Ciclo dell acido citrico
Il metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici I gruppi acetili derivati da carboidrati, amminoacidi e acidi grassi entrano nel ciclo dell acido citrico dove vengono ossidati a CO 2
Il piruvato,, derivato dal glucosio ad opera della glicolisi viene ossidato formando acetil CoA e CO 2 per azione di 3 enzimi organizzati nel complesso della piruvato deidrogenasi,, localizzato nei mitocondri delle cellule eucariotiche.
Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi. In questa reazione sono coinvolti cinque coenzimi e tre enzimi.
Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi: La decarbossilazione ossidativa Processo di ossidazione irreversibile: il gruppo carbossilico viene rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO2 i 2 atomi di carbonio che restano diventano il gruppo acetilico legato al CoA.
La deidrogenazione e la decarbossilazione del piruvato ad Acetil CoA coinvolgono l azione l sequenziale di 3 enzimi diversi: piruvato deidrogenasi (E1), diidrolipoil transacetilasi (E2) diidrolipoil deidrogenasi (E3). e di 5 gruppi prostetici o coenzimi: tiamina pirofosfato (TPP) FAD CoA NAD lipoato. Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema: la tiamina per la TPP la riboflavina per il FAD, la niacina per il NAD il pantotenato per il CoA
E 2 = diidrolipoil transacetilasi (24) E 1 = piruvato deidrogenasi (24) Intero complesso (60 subunità) E 3 = diidrolipoil Deidrogenasi (12) Organizzazione strutturale del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi
Regolazione del complesso multienzimatico l attivazione avviene ad opera di una fosfoproteina fosfatasi che defosforila il cmplesso attraverso una reazione Mg 2+ e Ca 2+ dipendente L inattivazione del complesso si realizza per azione di una proteina chinasi Mg 2+- ATP-dipendente strettamente legata al complesso multienzimatico l acetil CoA e il NADH prodotti nella reazione inibiscono la forma defosforilata (attiva) dell enzima, ma stimolano la proteina chinasi, promuovendo l interconversione del complesso nella sua forma inattiva
il CoA libero inibisce la proteina chinasi e il NAD quando aumenta il rapporto NADH/NAD + mitocondriale o il rapporto acetil-coa/coa come avviene durante la β- ossidazione degli acidi grassi, il complesso della piruvato deidrogenasi è inattivato per azione della chinasi il piruvato è un potente inibitore della proteina chinasi, quindi alti livelli di piruvato inibiscono la chinasi e attivano il complesso
Modificazione covalente della piruvato deidrogenasi negli eucarioti.
Funzione principale del Ciclo è quella di generare equivalenti riducenti che sono utilizzati per produrre energia, cioè ATP, nel processo di trasporto degli elettroni-fosforilazione ossidativa
CICLO DELL ACIDO CITRICO Il ciclo dell acido citirco ossida l acetil CoA, il prodotto comune della degradazione di: glucosio acidi grassi amminoacidi chetogenici a CO 2 e H 2 O con produzione di NADH e FADH 2 molti amminoacidi glucogenici possono essere ossidati attraverso il ciclo dell acido citrico grazie alla loro demolizione in uno dei suoi intermedi
L attività degli enzimi dell acido citrico: citrato sintasi isocitrato deidrogenasi α-chetoglutarato deidrogenasi è controllata dalla disponibilità di substrato e dall inibizione a feedback da parte degli intermedi del ciclo
1 a reazione: formazione di citrato l enzima citrato sintasi è inibito da elevate concentrazioni di NADH(H), ATP di succinil CoA e di acil-coa che agiscono come effettori negativi il citrato a sua volta agisce come effettore negativo della fosfofruttochinasi-1
L intermedio citril-coa non viene rilasciato dall enzima durante la reazionee si ritiene che rimanga legato al sito catalitico della citrato sintasi la citrato sintasi è presente nella matrice mitocondriale ed ha un peso molecolare di 100.000
2 a reazione: formazione di isocitrato la reazione aconitasica è fortemente inibita da fluoroacetato ( CH 2 -F- COO - ) un composto presente in certe piante del Sud Africa
Centro ferro-zolfo dell aconotasi La reazione dell aconitasi non richiede cofattori, essa richiede la partecipazione di ioni ferroso che gli vengono forniti dal centro ferrozolfo che è un componente essenziale dell attività idratasica dell enzima
3 a reazione: decarbossilazione ssidativa dell isocitrato per formare a- chetoglutarato. Isocitrato deidrogenasi: NAD+ dip. (matrice mitocondriale, ciclo di Krebs) NADP+ dip.(citosol, reazioni anaboliche) peso molecolare di 380.000 è costituita da 8 sub unità identiche è stimolata da ADP e in alcuni casi da AMP è inibita da ATPe NADH +
4a reazione: decarbossilazione ossidativa dell a-chetoglutarato in succinil-coa e CO 2 questo complesso è identico a quello della piruvato deidrogenasi ma non è regolato da reazioni di fosforilazione e defosforilazione il complesso è inibito da ATP, GTP da NADH e succinil CoA sembra attivato da ioni calcio
5 a reazione: Conversione del succinil-coa a succinato fase intermedia in cui la molecola dell enzima enzima diventa fosforilata a livello di un suo residuo di His presente nel sito attivo Il gruppo fosforico viene quindi trasferito all ADP o al GTP per formare ATP e GTP E questa l unica l reazione metabolica in cui il GTP è preferito all ATP le cellule animali hanno 2 isozimi,, uno per l ADP l e un altro per il GDP.
Reazione della succinil CoA sintetasi Un gruppo fosforico sostituisce il CoA legato all enzima formando un fosfato ad alta energia Il succinil fosfato dona il gruppo fosforico a un residuodi His dell enzima formando un fosfoenzima ad alta energia Il gruppo fosforico viene trasferito dal residuo di His al gruppo fosforico terminale del GDP
La formazione di ATP o GTP a spese dell energia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell a- chetoglutarato è un esempio di fosforilazione a livello del substrato Il GTP formato dalla succinil-coa sintetasi può donare il suo gruppo fosforico terminale all ADP per formare ATP, mediante l azione reversibile della nucleoside difosfato chinasi.
6 a reazione: sintesi di fumarato la succinato deidrogenasi è fortementa inibita da malonato e ossalacetato è attivata da ATP, fosfato inorganico e succinato il malonato inibisce l enzima in modo competitivo, dovuto alla notevole somiglianza strutturale col succinato
La succinato deidrogenasi è una flavoproteina che è inserita a differenza degli altri enzimi, nelle membrana mitocondriale interna favorendo il trasferimento diretto degli elettroni alla catena respiratoria è costituito da due subunità di 70.000 e 30.000 m.w. rispettivamente la prima contiene il sito di legame per il substrato, il FAD legato alla lisina e 4 atomi di ferro + 4 atomi di zolfo la seconda contiene solo ferro e zolfo
7 a reazione: idratazione del fumarato per produrre malato la fumarasi è un tetramero con M.W. Di 200.000
Ultima reazione: ossidazione del malato a ossalacetato in questa reazione con l ossidazione del malato ad ossalacetato si rigenera il prodotto di partenza che così può riprendere il ciclo l ossalacetato può essere convertito anche in fosfoenol-piruvato o transaminato ad aspartato
Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi. In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra a le reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, o, e quindi la concentrazione di questi composti resta costante.
CARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASI Deficienze dei differenti componenti catalitici o subunità regolatrici I bambini con questo deficit presentano alti livelli di lattato, piruvato e alanina che causano acidosi lattica cronica.. Presentano inoltre gravi danni neurologici. In molti casi questa carenza comporta la morte dell individuo La diagnosi viene fatta saggiando il complesso enzimatico e/o le sue subunità enzimatiche in colture di fibroblasti di pelle prelevata dal paziente In alcuni casi i pazienti rispondono a un regime dietetico regime dietetico di tipo chetogenico con bassi livelli di carboidrati
DEFICIT DI FUMARASI Il deficit di enzimi del ciclo degli acidi ticarbossilici è raro, tuttavia sono stati riportati alcuni casi in cui è presente un grave deficit di fumarasi sia a livello mitocondriale che citosolico È presente un grave danno neurologico con encefalopatia e distonia che si manifestano precocementa dopo la nascita Le urine contengono quantità anomale di fumarato e di una o più delle seguenti sostanze : succinato, α-chetoglutarato, citrato e malato Entrambi i genitori presentano livelli di attività enzimatica dimezzati rispetto al normale come si verifica nei disordini su base autosomica recessiva
Una molecola di glucosio può potenzialmente promuovere la sintesi di circa 38 ATP in condizioni di aerobiosi, cioè quando funziona il ciclo dell' acido citrico.
Il ciclo dell acido citrico è regolato a livello delle sue tre tappe esoergoniche Il flusso dei metaboliti attraverso il ciclo dell acido citrico è sotto stretto controllo. Tre fattori governano la velocità del flusso attraverso il ciclo: 1. La disponibilità di substrato 2. l inibizione da accumulo di prodotti 3. l inibizione allosterica retroattiva (a feedback) dei primi enzimi del ciclo da parte degli ultimi intermedi. Vi sono 3 tappe fortemente esoergoniche nel ciclo: 1. reaz. catalizzata dalla citrato sintasi 2. reaz. catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi 3. reaz. catalizzata dalla a-chetoglutarato deidrogenasi
In condizioni normali la velocità della glicolisi e del acido citrico sono coordinate in modo che la quantità di glucosio metabolizzato a piruvato sia soltanto quella che poi entra nel ciclo dell acido citrico sotto forma di Acetil-CoA CoA. Piruvato, lattato e Acetil-CoA sono mantenuti a concentrazioni stazionarie. La velocità della glicolisi viene quindi adeguata a quella del ciclo dell acido citrico non soltanto dai livelli di ATP e di NADH,, che sono componenti della fase sia glicolitica sia respiratoria dell ossidazione del glucosio, ma anche dal citrato.
Il Citrato,, prodotto della prima tappa del ciclo, è anche un inibitore allosterico della fosforilazione del fruttosio 6-fosfato da parte della fosfofrutto chinasi-1 1 della via glicolitica. L aconitasi funziona in condizioni vicine all' equilibrio, per cui la velocità di consumo del citrato dipende dall'attività:
1.dell'isocitrato deidrogenasi NAD+ NAD+-dipendente, che in vitro viene fortemente inibita dal suo prodotto NADH. 2. La citrato sintasi sintasi viene anche inibita dal NADH, ma è meno sensibile dell'isocitrato deidrogenasi alle variazioni della [NADH]. sintasi è anche inibita e dal citrato che compete con l'ossalacetato ossalacetato) La citrato sintasi 3. l'inibizione dell a-chetoglurarato deidrogenasi da parte del NADH e del succinil-coa CoA. Il succinil-coa compete anche con l'acetil acetil-coa nella reazione della citrato sintasi (inibizione retroattiva competitiva). Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a mantenere regolato il ciclo dell' acido citrico in modo coordinato.
Altri meccanismi regolatori Studi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido citrico co hanno permesso di identificare alcuni inibitori e attivatori allosterici. L ADP è un attivatore allosterico dell'isocitrato deidrogenasi, mentre l'atp inibisce questo enzima. Il Ca2+ oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, regola il ciclo dell' acido citrico in diversi punti: attiva la piruvato deidrogenasi fosfatasi,, che a sua volta attiva il complesso della piruvato deidrogenasi per la produzione di acetil- CoA. Il Ca2+, attiva anche l'isocitrato deidrogenasi e l a l chetoglutarato deidrogenasi
Così il Ca2+, il segnale che stimola la contrazione muscolare, Cos il segnale che stimola la contrazione muscolare, stimola anche la produzione dell'atp che andrà a supportarla Nel muscolo cardiaco, dove il ciclo dell' acido citrico, dove il ciclo dell' acido citrico è attivo, il flusso dei metaboliti lungo il ciclo è proporzionale alla velocità del consumo cellulare di ossigeno Poiché il consumo di ossigeno, la riossidazione del NADH e la produzione di ATP sono saldamente accoppiati, il ciclo dell'acido citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.
I più importanti regolatori del ciclo dell'acido citrico sono i suoi substrati l'acetil-coa l'ossalacetato il suo prodotto, NADH. K = [ossalacetato][nadh] [malato] [NAD+]
Sia l'acetil acetil-coa sia l l ossalacetato sono presenti nei mitocondri a una concentrazione che non è in grado di saturare la citrato sintasi. Il flusso metabolico lungo questo enzima varia quindi in funzione della concentrazione di substrato e viene controllato dalla disponibilità di quest'ultimo. ultimo.
La produzione di acetil-coa a partire da piruvato viene regolata dall' attività della piruvato deidrogenasi. La concentrazione di ossalacetato,, che è in equilibrio con il malato, fluttua a seconda del rapporto [NADH]/[NAD+ NAD+] ] seguendo l'espressione all'equilibrio K = [ossalacetato][nadh] [malato] [NAD+[ NAD+] Se aumenta il carico di lavoro del muscolo e la respirazione, nei mitocondri la [NADH] diminuisce. Il conseguente aumento della [ossalacetato[ ossalacetato] ] stimola l'attività della sintasi,, che controlla la velocità di formazione del citrato. citrato sintasi
Il ciclo del citrato come piattaforma girevole del metabolismo.
fine