ISTITUTO ONCOLOGICO VENETO Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico. Linea di ricerca. Via Gattamelata, 64 35128 Padova

ISTITUTO ONCOLOGICO VENETO Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico Linea di ricerca Via Gattamelata, 64 35128 Padova

Linea di ricerca 8 Immunologia dei tumori e approcci terapeutici Innovativi Le cellule tumorali stabiliscono un complesso rapporto con i tessuti circostanti, che comprendono sia cellule parenchimali e stromali normali dell'organo in cui la neoplasia si sviluppa che leucociti richiamati nella sede della lesione da fattori diversi. Le interazioni cha avvengono a livello del microambiente neoplastico sono molto complesse, ed il delicato equilibrio che si instaura tra fattori di derivazione tumorale (che favoriscono la crescita delle cellule neoplastiche) e fattori derivanti dai tessuti normali dell'ospite (che tendono generalmente a contenerne la crescita) è uno degli elementi chiave per spiegare almeno in parte la diversa progressione delle neoplasie. Tale complessa cascata di fenomeni si sta inoltre rivelando un potenziale bersaglio terapeutico, in cui interventi mirati nei confronti dei diversi elementi possono alterare il precario equilibrio tra crescita del tumore e suo contenimento in favore di quest'ultimo, sinergizzando magari con interventi più convenzionali quali ad esempio la chemioterapia anti-neoplastica. A) Rapporti tumore-ospite Nell'ambito dei rapporti tra tumore ed ospite, particolare rilevanza assumono il fenomeno della neo-angiogenesi tumorale, il fenomeno della cosiddetta "dormienza tumorale", e la risposta immunitaria al tumore. Per quanto attiene al primo punto, è noto che la crescita dei tumori presuppone il reclutamento da parte del tumore di cellule endoteliali dalla vascolatura pre-esistente, così da fornire al tessuto neoplastico una rete vascolare in grado di garantirne l'ossigenazione e la nutrizione. Gli studi effettuati hanno confermato l'importanza del fenomeno della neo-angiogenesi, evidenziando altresì come tale evento possa essere modulato mediante sostanze ad azione anti-angiogenica quali l IFN-alfa. Dagli studi condotti è inoltre emerso che eventuali agenti anti-angiogenici devono essere somministrati in maniera continuativa e ad alte dosi, evidenziando così la necessità di ricorrere a modalità di "delivery" degli agenti biotecnologicamente avanzate, quali la terapia genica. Per quanto riguarda la cosiddetta "dormienza tumorale", questo fenomeno si riferisce al fatto che cellule neoplastiche possono risiedere nei tessuti in uno stato di apparente quiescenza per mesi o anni, per poi "risvegliarsi" e dare origine ad una massa tumorale a seguito di stimoli non ancora ben definiti. Le ricerche condotte su questo argomento in un modello animale di leucemia linfatica acuta umana hanno dimostrato che stimoli in grado di accendere fenomeni transitori di neoangiogenesi sono in grado di interrompere la dormienza tumorale; sono ora in corso studi volti a chiarire le interazioni tra endotelio e cellule maligne e le vie di trasduzione del segnale accese dalle interazioni cellula-cellula nel microambiente neoplastico. Per quanto concerne infine la risposta immunitaria ai tumori, gli studi sono stati condotti sia in modelli di tumore umano trapiantabile in topi immunodeficienti o di tumore murino ad insorgenza spontanea in certi ceppi di animali, che in neoplasie umane di vario istotipo, ed in particolare nel melanoma e nei tumori dell'esofago. Le ricerche più recenti si concentrano attorno a tre aspetti fondamentali: 1) definire il profilo di espressione degli antigeni tumorali, correlandolo alle caratteristiche clinicopatologiche dei singoli pazienti ed in particolare agli aspetti prognostici; 2) stabilire il repertorio cellulare e molecolare della risposta linfocitaria dell'ospite a tali antigeni, sia mediante approcci convenzionali di immunologia cellulare che mediante le più moderne tecniche di analisi mediante microarrays; 3) approfondire il ruolo svolto da cellule mieloidi infiltranti il tumore nel favorire la progressione tumorale. Su quest'ultimo aspetto si è realizzata nel nostro Istituto nel corso degli ultimi 3 anni una massa critica notevole, che pone il nostro gruppo in posizione leader nel panorama internazionale. Gli studi condotti hanno dimostrato che cellule di derivazione

midollare dell'ospite possono in certe condizioni favorire anziché contrastare la crescita neoplastica, attraverso l'induzione di uno stato di immunodepressione nell'ospite; è in corso sia la definizione dei meccanismi alla base di questo fenomeno in modelli sperimentali e nell'uomo, sia il disegno di strategie farmacologiche appropriate per limitare l'azione delle cellule mieloidi soppressive. B) Approcci terapeutici innovativi Le strutture afferenti allo IOV sono da tempo impegnate a studiare la possibilità di sviluppare strategie terapeutiche o preventive di vaccinazione verso antigeni tumorali, in particolare verso antigeni espressi da cellule di melanoma; in quest'ambito, oltre agli studi condotti in modelli preclinici, alcune strutture afferenti allo IOV hanno già preso parte a trials clinici di vaccinazione con peptidi di antigeni tumorali e/o gangliosidi condotti su scala europea. Di particolare rilievo lo sforzo che viene portato avanti per l'identificazione di correlati di protezione che possano fungere da markers di risposta nei pazienti vaccinati, predicendo la risposta all'immunoterapia. Per quanto attiene ad approcci innovativi di terapia dei tumori, quali la terapia cellulare adottiva e la terapia genica, tali approcci nell'uomo sono attualmente preclusi nell'ambito dello IOV per la non disponibilità di una struttura che risponda alle normative vigenti sul tema, che prevedono l'osservanza rigorosa delle procedure GMP per la preparazione dei prodotti destinati a terapia cellulare adottiva o terapia genica. Ciononostante, sono maturate approfondite competenze sulle caratteristiche di vettori retrovirali e lentivirali destinati al trasferimento genico, al fine di affrontare le problematiche più rilevanti in campo di terapia genica: ottenere vettori ad alto titolo, capaci di esprimere per un periodo di tempo prolungato il transgene in maniera tessuto-specifica, con meccanismi che consentano la regolazione dell'espressione genica e/o di salvaguardia mediante l'incorporazione nel vettore di geni "suicidi". I modelli su cui si è maggiormente concentrata l'attenzione mirano da un lato al trasferimento di geni che codificano per citochine in grado di potenziare le risposte anti-tumorali nella sede tumorale o molecole in grado di interferire con la neoangiogenesi tumorale; questa linea di ricerca è stata perseguita principalmente in modelli di carcinoma ovarico umano trapiantabile nel topo. L'interesse per la complessa interazione tra cellule neoplastiche e microambiente non si è limitato ai tumori sperimentali trapiantati in topi immunodeficienti, ma si è estesa a ad un modello di neoplasia prostatica ad insorgenza spontanea in un particolare ceppo di topi (topi TRAMP); in questo contesto è infatti possibile studiare in condizioni molto più vicine alle neoplasie umane i fenomeni angiogenetici che caratterizzano la storia naturale del tumore, e disegnare gli approcci di terapia genica più appropriati per interferire con lo sviluppo di vasi all'interno della massa prostatica dell'animale. Infine, è prevista a breve la trasferibilità in un trial di fase I-II nell'uomo di un coniugato di ialuronato con un tracciante radioattivo, che si è dimostrato estremamente efficace in un modello preclinico di epatocarcinoma. 1 - STUDIO DEL RUOLO DEL METABOLISMO DELLA L-ARGININA NELL'IMMUNOSOPPRESSIONE INDOTTA DAI TUMORI. Responsabile: Mandruzzato Susanna Parole chiave: immunologia, patogenesi, marcatori Per indagare il ruolo degli enzimi arginasi e ossido nitrico sintetasi nelle disfunzioni del sistema immunitario indotte dai tumori, ci proponiamo di studiare l'espressione e l'attività di questi enzimi in tessuti tumorali umani di diverso tipo istologico, con una particolare attenzione ad indentificare le cellule esprimenti tali enzimi nel microambiente tumorale. Abbiamo eseguito un'analisi dell'infiltrato presente nel tessuto neoplastico, analizzando l'espressione in situ delle proteine arginasi-1 e arginasi-2 in un pannello di biopsie di melanoma e carcinoma del colon. L' analisi immunoistochimica ha mostrato la presenza di cellule che esprimono queste proteine in una frazione dei campioni analizzati con un chiaro pattern di espressione: cellule che esprimono arginasi-2 sono presenti in alcuni campioni analizzati e sono a carico di cellule neoplastiche sia nel caso di melanoma che in quello del carcinoma del colon-

retto in aree disomogenee. Per contro, cellule che esprimono arginasi-1 sono invece espresse in tutti i granulociti che infiltrano le aree neoplastiche. E' in corso la messa a punto della colorazione immunoistochimica per l'enzima NOS2. 2 - STUDIO DEL RUOLO DI ALTERAZIONI DEL METABOLISMO DI AMINOACIDI NELL'IMMUNOSOPPRESSIONE INDOTTA DA TUMORI MEDIANTE UTILIZZO DI TOPI TRANSGENICI E KNOCK-OUT Responsabile: Bronte Vincenzo Parole chiave: immunosoppressione, modelli sperimentali, microambiente La ricerca ha come scopo la comprensione del ruolo che alterazioni del metabolismo di aminoacidi, quali la L-Arginina; possono avere nel generare un microambiente tumorale con caratteristiche soppressorie nei confronti della risposta immunitaria. I perossinitriti, generati dal metabolismo dell'aminoacido L-arginina da parte di cellule mielo-monocitarie infiltranti il tumore o dalle cellule tumorali stesse, sono stati coinvolti nei meccanismi di soppressione della risposta immune anti-tumorale. Abbiamo osservato che i perossinitriti formano degli addotti con alcune citochine alterandone la funzione. In particolare, la nitrazione di alcuni residui di tirosina della chemochina SDF-1 ne altera la capacità di far migrare cellule T CD8+ umane. Stiamo valutando i meccanismi molecolari e l'importanza biologica di questi risultati. 3 - ANALISI DEL PROFILO DEI MICRORNA COME STRUMENTO PER STUDIARE LA BIOLOGIA DELLE CELLULE MIELOIDI SOPPRESSORIE Responsabile: Bronte Vincenzo Parole chiave: genomica, immunosoppressione, modelli sperimentali La ricerca ha come scopo l'identificazione di mir di cellule mielo-monocitarie purificate dalla massa tumorale e dal sangue periferico di pazienti oncologici per definire la biologia di sottopopolazioni di cellule mielomonocitarie condizionate dal tumore, capaci di svolgere un'importante sulle risposte immunitarie dell'ospite. Abbiamo determinato il profilo di espressione genica in macrofagi infiltranti il tumore ottenuti da diversi tumori murini. Da queste cellule è stato estratto anche RNA per l'analisi dei microrna. L'ibridizzazione su chip di microrna viene condotta, in questo momento, nei laboratori del Dott. F. Marincola, Bethesda, USA. Cercheremo di creare algoritmi che consentano di tracciare reti di interazione tra microrna e mrna presenti nelle cellule infiltranti il tumore. 4 - IDENTIFICAZIONE DI NUOVE MOLECOLE IN GRADO DI RECUPERARE L'ATTIVITÀ DEL SISTEMA IMMUNITARIO CONTRO IL TUMORE: BASI MOLECOLARI E BIOLOGICHE PER NUOVE TERAPIE. Responsabile: Bronte Vincenzo Parole chiave: immunoterapia, vaccinoterapia, modelli sperimentali, immunosoppressione Lo scopo di questa ricerca è quello di dimostrare l'azione di inibitori di COX donatori di NO come nuovi farmaci per ricostituire le funzioni immunitarie in soggetti portatori di neoplasia, partendo dall'osservazione ottenuta nei modelli sperimentali che la somministrazione per via orale di alcuni composti con questa attività è in grado di aumentare il numero e la funzione di linfociti T tumore-specifici e l'efficacia della vaccinazione antitumorale. Abbiamo identificato 3 composti "leader" aventi in comune la capacità di donare NO ma con strutture chimiche diverse. Tutti questi composti sono molto attivi nel recuperare la soppressione dei linfociti T indotta da cellule mieloidi soppressorie in saggi in vitro. Al momento attuale stiamo eseguendo esperimenti in animali portatori di tumore per valutare quali di questi composti siano attivi anche in vivo. 5 - APPROCCI DI TERAPIA ANTI-ANGIOGENICA DEI TUMORI OVARICI Responsabile: Indraccolo Stefano

Parole chiave: neo-angiogenesi, ovaio, terapia genica, microambiente, apoptosi, interferon, modelli sperimentali La definizione dei parametri dai quali possa dipendere l'esito terapeutico dell'impiego di farmaci anti-angiogenici in oncologia è un ambito d'investigazione di grande interesse. Questo aspetto verrà studiato in modelli sperimentali di carcinoma ovarico, precedentemente utilizzati nel nostro laboratorio. Nel corso dello studio si propongono le seguenti attività: (1) Valutazione del ruolo del fattore trascrizionale HIF-1 nel determinare la sensibilità o la resistenza delle cellule di carcinoma ovarico all'ipossia; (2) Valutazione dell'espressione di geni coinvolti nella regolazione dell'apoptosi nelle linee resistenti o sensibili all'ipossia; (3) Valutazione della possibile correlazione tra metabolismo cellulare, misurato in particolare mediante parametri quali il consumo di glucosio e la produzione di lattato, e risposta all'ipossia; (4) Valutazione della possibile correlazione tra tipo di metabolismo delle cellule tumorali (prevalentemente glicolitico o ossidativo) e la risposta alla terapia antiangiogenica in vivo; (5) Silenziamento mediante vettori lentivirali codificanti opportuni sirna dell'espressione di geni coinvolti nella resistenza all'ipossia e valutazione della sensibilità delle linee tumorali geneticamente modificate alla terapia anti-angiogenica con IFN-alfa o con anticorpi neutralizzanti il VEGF in vivo; (6) Valutazione di farmaci che possano incrementare la risposta delle cellule tumorali all'ipossia e sortire quindi un effetto sinergico con farmaci anti-angiogenici. Abbiamo valutato le risposte cellulari all'ipossia di un gruppo di 9 linee di carcinoma ovarico, identificando alcune linee molto sensibili alla morte indotta dall'ipossia ed altre relativamente resistenti. Lo studio si è quindi focalizzato su 2 linee in particolare, rappresentative delle due risposte, quali la linea OC316 (sensibile all'ipossia) e la linea IGROV-1 (resistente all'ipossia). Abbiamo osservato che esiste una correlazione tra il metabolismo glicolitico delle cellule, misurato in termini di consumo di glucosio e produzione di acido lattico in condizioni di normossia e l'espressione di geni della glicolisi (GAPDH, LDHA, HKII), e la sensibilità all'ipossia: la linea OC316, molto glicolitica, è risultata andare incontro ad un'apoptosi molto maggiore rispetto alle cellule IGROV-1, poco glicolitiche. Il silenziamento stabile del fattore trascrizionale HIF1-A mediante vettori lentivirali codificanti specifici shrna ha accentuato la sensibilità all'ipossia della linea OC316, mentre non ha modificato il comportamento delle cellule IGROV-1. La morte delle cellule OC316 in condizioni ipossiche sembra correlare con un brusco calo nei livelli di ATP intracellulare ed è marcatamente attenuata da un supplemento di glucosio nel terreno di coltura. Tumori formati dalle cellule OC316 silenziati per HIF1-A hanno dimensioni simili a quelli dei tumori di controllo ed inducono risposte angiogeniche comparabili ma sono caratterizzati dalla presenza di aree di necrosi molto più estese rispetto ai controlli. Lo studio sta progredendo nella direzione di una più accurata definizione delle differenze molecolari tra tumori ovarici proficienti e deficienti per HIF1-A e con la valutazione degli effetti della terapia anti-angiogenica con anticorpi neutralizzanti il VEGF in tale sistema sperimentale. 6 - STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI CHE REGOLANO LA DORMIENZA TUMORALE Responsabile: Indraccolo Stefano Parole chiave: neo-angiogenesi, metastasi, dormienza tumorale, apoptosi, modelli anaimali Un numero crescente di studi ha evidenziato come l'angiogenesi rappresenti un aspetto fondamentale della crescita tumorale: all'incapacità di una cellula tumorale di promuovere l'angiogenesi segue, in molti modelli sperimentali, l'eliminazione delle cellule tumorali stesse o lo sviluppo di una condizione, detta "dormienza tumorale", nella quale si assiste generalmente ad un bilanciamento tra proliferazione ed apoptosi ed al mantenimento del tumore entro dimensioni microscopiche. I nostri studi sono

volti a chiarire i meccanismi coinvolti nella transizione di un tumore indolente in una neoplasia aggressiva in un modello di dormienza tumorale. In particolare si prevedono le seguenti attività: (1) Analisi dello stato d'attivazione di particolari fosfoproteine nei tumori dormienti ed in quelli aggressivi mediante metodiche di immunoblotting ed ELISA; (2) Valutazione della possibile implicazione della pathway di Notch1 e di Notch3 nella conversione dei tumori dormienti in aggressivi; (3) Sviluppo di una serie di linee tumorali neoplastiche umane ingegnerizzate ad esprimere marcatori bioluminescenti che ne permettano lo studio del comportamento biologico in vivo. Abbiamo valutato lo stato d'attivazione di una protein-chinasi attivata dallo stress cellulare, quale p38, nel sistema sperimentale di dormienza tumorale delle cellule MOLT-3, derivate da un paziente con T-ALL. La forma fosforilata di p38 (pp38), che è attiva e può contribuire ad indurre apoptosi, è espressa in maniera aumentata nei tumori dormienti rispetto a quelli aggressivi, e tale espressione correla inversamente con l'espressione di una fosfatasi, MKP-1, preposta a controllare il livello di fosforilazione di p38: MKP-1 è espressa quindi a livelli maggiori nei tumori aggressivi rispetto a quelli dormienti. Per consolidare tali risultati abbiamo quindi generato vettori lentivirali d'espressione di MKP-1 ed altri in grado di silenziare tale gene. Le cellule MOLT-3 over-esprimenti MKP-1 sono risultate più resistenti ad uno stimolo apoptotico; al contrario, cellule in cui MKP-1 veniva silenziato erano particolarmente sensibili agli effetti apoptotici del trattamento. Gli studi in corso sono volti a verificare se diversi livelli d'espressione di MKP-1/pp38 correlino con la risposta apoptotica ad alcuni chemioterapici utilizzati per la terapia delle T-ALL e se i livelli d'espressione di tali proteine nelle cellule di T-ALL ottenute dai pazienti correlino con il decorso della leucemia e la risposta alla terapia. Sono inoltre in corso studi volti ad approfondire la possibile associazione tra la modulazione dell'espressione di MKP-1 nelle cellule MOLT-3 e l'attivazione della via di Notch 3. 7 - IDENTIFICAZIONE DI CELLULE MIELOIDI SOPPRESSORIE IN PAZIENTI PORTATORI DI TUMORE Responsabile: Zanovello Paola Parole chiave immunità, genomica, immunosoppressione, melanoma La ricerca si propone di affrontare la caratterizzazione funzionale di sottopopolazioni di cellule mieloidi presenti nella massa tumorale e nel sangue di pazienti con neoplasia, con lo scopo di individuare possibili profili di attivazione e marcatori biochimici. Studi condotti in precedenza nel nostro laboratorio in modelli preclinici di tumore hanno dimostrato che un aumentato metabolismo dell'aminoacido L-Arginina nel microambiente tumorale costituisce un meccanismo mediante il quale cellule dello stipite mielo-monocitario possono condizionare la riposta immunitaria tumorespecifica. Analisi preliminari condotte su biopsie di tessuto tumorale e campioni di sangue periferico di pazienti con patologia tumorale in stadio avanzato (melanoma metastatico, carcinoma colo-rettale) hanno indicato che la popolazione granulocitaria isolata dai pazienti possiede un'elevata attività di Arginasi 1 (ARG1), un enzima coinvolto nel metabolismo di L-Arginina. L'aumento dell'attività enzimatica riscontrato nei granulociti dei pazienti rispetto ai donatori sani, se confermato da ulteriori indagini, potrebbe rappresentare un parametro interessante nel monitoraggio dell'assetto mielo-monocitario dei pazienti con tumore. 8 - VACCINAZIONE ANTI-IDIOTIPICA SUBSET-SPECIFICA PER IL CONTROLLO DI LINFOMI NHL A CELLULE B Responsabile: Rosato Antonio Parole chiave: vaccini, linfomi, modelli animali Questo progetto di ricerca, condotto in collaborazione con il CRO di Aviano, si propone di valutare il ruolo di catene leggere e pesanti delle immunoglobuline, che risultano inaspettatamente utilizzate in maniera preferenziale da tumori a cellule B di differenti pazienti, a fungere come antigeni tumore-specifici per la realizzazione di vaccini anti-

idiotipo subset-specifici. Il programma proposto è stato finanziato dalla Comunità Europea (FP6) nell'ambito di uno STREP (Specific Target Research Project) triennale che vede coinvolti quattro enti di ricerca pubblica (l'università di Oslo, l'istituto Karolinska, il CRO di Aviano e lo IOV di Padova) e tre SME (Small Medium Enterprises, Areta, Proimmune e Pepscan), per un totale di 2.050.000 euro di finanziamento. Studi preliminari ci hanno già portato alla generazione di una serie di anticorpi monoclonali specifici per la catene VK3-20, una delle catene montate preferenzialmente da linfomi insorti in seguito ad infezione con HCV e che rappresenta il prototipo per gli studi di vaccinazione subset-specifica. Tali monoclonali potranno quindi essere utilizzati per lo screening di altri linfomi, per la diagnostica e per approcci immunoterapici. 9 - EFFICACIA TERAPEUTICA DI LINEE DI LINFOCITI T CITOTOSSICI CD8+ E CD4+ SPECIFICI PER SUBUNITÀ PROTEICHE DEL VIRUS EBV NEL CONTROLLO DI DISORDINI LINFOPROLIFERATIVI POST-TRAPIANTO: VALIDAZIONE IN UN MODELLO PRECLINICO DI IMMUNOTERAPIA ADOTTIVA NEL TOPO SCID Responsabile: Rosato Antonio Parole chiave: virus, modelli sperimentali, immunoterapia, trapianto, immunosoppressione Gli attuali protocolli di immunoterapia adottiva con linfociti T citotossici (CTL) EBVspecifici in corso di patologie linfoproliferative post-trapianto (PTLD) si basano sullo sviluppo di linee CTL policlonali ristrette per HLA di classe I. Per quanto questo approccio si sia dimostrato efficace in ambito clinico sia per la profilassi che il trattamento di PTLD, non è tuttora chiaro il contributo relativo di CTL con differente restrizione nel controllo e nell'eradicazione del tumore. D'altro canto, il ruolo potenziale dell'impiego di cellule T CD4+ EBV-specifiche per il controllo di PTLD non è mai stato valutato né nell'uomo, né in modelli preclinici. In questo contesto, gli obiettivi specifici del progetto sono rappresentati dallo sviluppo di un protocollo riproducibile ed orientato all'applicazione clinica per la generazione di CTL CD8+ e CD4+ diretti contro specifiche subunità di EBV, e dalla valutazione e la validazione direttamente in vivo del loro ruolo anti-tumorale dopo trasferimento adottivo. Abbiamo focalizzato la nostra ricerca sull'induzione di CTL CD4+ EBV-specifici. In particolare, abbiamo potuto osservare che tale popolazione risulta facilmente generabile da tutti i donatori sani analizzati ed è caratterizzata da elevata attività citotossica in vitro verso cellule B trasformate da EBV (LCL); inoltre, tale attività litica è ristretta per molecole MHC di classe II e si basa sull'esocitosi di granuli citotossici e sul rilascio di mediatori (perforine, granzimi e granulisina) utilizzati anche dai classici CTL CD8+. Per quanto concerne l'efficacia terapeutica dopo trasferimento in topi SCID portatori di neoplasie LCL EBV+, i risultati hanno evidenziato che i CTL CD4+ presentano elevata attività antineoplastica quando trasferiti al giorno 0 o 1 dopo l'inoculo del tumore, ma non nei giorni successivi. Tuttavia, una approfondita indagine ha permesso di evidenziare che le LCL, quando trasferite in vivo, modulano negativamente l'espressione di molecole MHC-II, rendendole quindi virtualmente non aggredibili dai CTL CD4+. Resta da chiarire se tale fenomeno sia presente anche nelle PTLD che insorgono nell'uomo o non rappresenti piuttosto una bias sperimentale del modello preclinico. A tale scopo, stiamo attualmente analizzando in immunoistochimica campioni di linfoma provenienti da pazienti al fine di evidenziare l'espressione di MHC-II. 10 - STUDIO DI IMMUNIZZAZIONE CON MAGE-3 PROTEINA RICOMBINANTE CON ADIUVANTE AS02B O AS15 NEI PAZIENTI CON MELANOMA CUTANEO METASTATICO IN PROGRESSIONE NON RESECABILE Responsabile: Chiarion Sileni Vanna Parole chiave: vaccinoterapia, melanoma, metastasi Verranno arruolati pazienti con melanoma cutaneo istologicamente accertato che presentino metastasi cutanee, sottocutanee o linfonodali non resecabili radicalmente e in evidente progressione nelle 12 settimane prima dell'inizio delle vaccinazioni. I

pazienti, con età maggiore di 18 anni, devono acconsentire all'esecuzione di una biopsia tumorale per valutare mediante RT-PCR l'espressione di MAGE-3; non devono avere ricevuto nessun trattamento per la malattia metastica, ad esclusione della perfusione ipertermica isolata, e non devono presentare malattie autoimmuni od autoanticorpi. I pazienti che dopo l'arruolamento risultano MAGE-3 positivi verranno randomizzati, dopo stratificazione per stadio, centro e presenza o assenza di lesioni > di 20 mm, alla vaccinazione con MAGE-3 ricombinante più due diversi adiuvanti: AS02B o AS15. Sono previsti 4 cicli di vaccinazioni. Il primo ciclo comprende 6 somministrazioni i.m, una ogni 2 settimane. Alla rivalutazione, tutti i pazienti con assenza di progressione viscerale o significativa iniziano il secondo ciclo di sei vaccinazioni con scadenza trisettimanale. Il terzo ciclo è di quattro vaccinazioni a intervalli di sei settimane ed il quarto ciclo prevede 4 vaccinazioni ad intervalli di 3 mesi e altre 4 con intervallo di 6 mesi. Le rivalutazioni di malattia sono fissate alla settimana 23, 32, 54, e quindi ogni 6 mesi. Il trattamento viene interrotto per tossicità o progressione viscerale o volontà del paziente. Lo studio prevede il trattamento di 34 pazienti per braccio e sarà considerato attivo e sicuro se saranno osservate >4 (11,8 %) risposte cliniche e <4 tossicità di grado 3/4. In caso di risposte <3 (8,8%) o tossicità > 5 (14,7%), il trattamento verrà considerato non sufficientemente attivo o troppo tossico. Sono stati arruolati 6 pazienti; lo studio è ancora in corso.