MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI Corso di Laurea in Tecnologie Alimentari. Università degli Studi di Napoli Federico II Docente: Prof. Francesco Villani. villani@unina.it Obiettivi formativi Il corso ha l obiettivo di fornire conoscenze relative all origine, alla biologia, all ecologia, alle attività metaboliche e alla sistematica di microrganismi patogeni, pro-tecnologici, anti-tecnologici o alterativi e probiotici, valutandone il loro ruolo e comportamento negli ecosistemi alimentari. Affronta inoltre i sistemi di identificazione, valutazione, monitoraggio e controllo dei pericoli microbiologici in tutte le fasi coinvolte nella produzione, trasformazione, conservazione, distribuzione ed uso dei prodotti alimentari al fine di garantirne la loro sicurezza. Le esercitazioni forniranno conoscenze sui metodi di numerazione, di ricerca e identificazione di specifici microrganismi o gruppi microbici negli alimenti. Argomenti trattati 1) Introduzione: origine, storia, scopi ed evoluzione della microbiologia degli alimenti La microbiologia degli alimenti costituisce una branca della Microbiologia (branca della biologia che studia gli esseri viventi microscopici) e studia il ruolo svolto dai microrganismi nella produzione, alterazione e conservazione degli alimenti e le malattie microbiche trasmesse attraverso gli alimenti. Pur essendo un area specialistica, la microbiologia degli alimenti abbraccia vari aspetti di altre aree, come la microbiologia industriale, la biotecnologia delle fermentazioni, la microbiologia agraria, la microbiologia medica, la biologia dei microrganismi, l igiene, ecc. La produzione di alimenti con determinate caratteristiche organolettiche e nutrizionali e allo stesso tempo stabili nei confronti delle alterazioni e sicuri per la salute umana, è stato un obiettivo e un esigenza sempre crescente nella storia dell uomo. Sebbene la produzione di alimenti basata sull attività fermentativa svolta dai microrganismi, così come le alterazioni e i metodi di conservazione degli alimenti siano conosciuti e applicati fin dai tempi antichi, fu con la scoperta da parte di Antony van Leeuwenhoek, tra il 1676 e il 1683, della vasta distribuzione dei microrganismi in natura, che si incominciò ad ipotizzare il loro possibile ruolo nelle alterazioni e fermentazioni alimentari e solo a partire dal 1800 furono stabilite in maniera scientifica le relazioni tra microrganismi e alimenti. Nel 1837 Schwann propose di considerare i lieviti coinvolti nella fermentazione alcolica come delle piante microscopiche, mentre tra il 1857 e il 1876 Pasteur dimostrò la natura microbica delle modificazioni chimiche che avvenivano negli alimenti e nelle bevande. Queste prime osservazioni e scoperte rappresentarono il primo passo per lo sviluppo della moderna microbiologia degli alimenti. I successivi sviluppi delle biotecnologie e le migliori conoscenze sulla fisiologia, sul metabolismo e la genetica dei microrganismi coinvolti nei processi fermentativi hanno consentito di evidenziare molti attributi fisiologici degli stessi che possono contribuire al controllo di microrganismi indesiderati, sia alterativi che patogeni, così come assicurare il conseguimento di specifici obiettivi industriali e contribuire al miglioramento della salute umana. Attualmente la microbiologia degli alimenti comprende diverse aree di interesse strettamente interrelate. Le aree principali possono essere così riassunte: a) le fermentazioni alimentari: produzione, conservazione e miglioramento degli alimenti mediante l intervento dei microrganismi; b) le malattie microbiche trasmesse attraverso gli alimenti: protezione del consumatore nei confronti di microrganismi patogeni trasmessi con gli alimenti; c) le alterazioni microbiche degli alimenti: prevenzione del deterioramento degli alimenti dovuto alle attività microbiche; d) il controllo della qualità e sicurezza microbiologica degli alimenti; e) i metodi di analisi microbiologica degli alimenti 2 - Richiami sulle caratteristiche dei principali microrganismi e loro origine negli alimenti. 2.1- Microrganismi associati con gli alimenti (batteri, lieviti, muffe, virus) 1
Tipi e numero di microrganismi presenti negli alimenti dipendono dall azione combinata di numerosi fattori. Fondamentalmente (tentando di semplificare) possiamo distinguere i microrganismi rinvenibili negli alimenti in utili, dannosi e indifferenti. Tra i microrganismi utili vanno annoverati gli agenti di trasformazione e conservazione degli alimenti e i microrganismi utilizzati per le loro proprietà di promuovere la salute umana (probiotici), mentre quelli dannosi comprendono i microrganismi patogeni trasmessi per via alimentare e i microrganismi responsabili di alterazioni degli alimenti. 2.2- Contaminazione microbica degli alimenti I microrganismi presentano un alto grado di adattabilità alle varie condizioni che si realizzano in un determinato ambiente e sono pertanto i più ubiquitari tra gli organismi viventi. Le caratteristiche chimiche e chimico-fisiche degli alimenti sono tali da permettere la colonizzazione e lo sviluppo di un gran numero di microrganismi, alcuni dei quali utili, altri indesiderati, sia patogeni che alterativi. Naturalmente ogni alimento possiede una microflora che è strettamente dipendente dalla natura delle materie prime e dall ambiente in cui esse vengono prodotte (coltivazione, allevamento) e dalle condizioni in cui esse vengono trasformate, conservate e consumate. Ovviamente vi è una microflora associata con le materie prime, le quali rappresentano l habitat naturale; tuttavia possono verificarsi diverse circostanze che possono determinare modificazioni quantitative e/o qualitative dei microrganismi contaminanti. Inizialmente le materie prime possono essere contaminate da microrganismi provenienti dall aria, dall acqua, dal suolo, dalla superficie di vegetali e animali (contaminazione primaria). Nel corso della loro trasformazione, gli alimenti possono essere nuovamente contaminati da microrganismi derivanti dagli ambienti di lavorazione e conservazione, dalle superfici, dagli utensili e attrezzature, dal personale impegnato nelle attività produttive. Inoltre, lo specifico processo tecnologico cui l alimento viene sottoposto, determinerà variazioni quanti-qualitative della microflora presente naturalmente o aggiunta, come conseguenza delle modificazioni delle caratteristiche chimico-fisiche dell alimento stesso. Infine, l alimento potrà subire contaminazioni e/o variazioni del contenuto microbico nelle successive fasi di magazzinaggio, trasporto, distribuzione e di consumo 3- Ecologia microbica alimenti: Fattori ecologici che influenzano la sopravvivenza, la crescita e la morte dei microrganismi negli alimenti La colonizzazione di un alimento da parte di specie e ceppi di microrganismi appartenenti ad ogni uno dei gruppi passati in rassegna nelle pagine che seguono, siano essi patogeni o alterativi, così come protecnologici, dipende strettamente dalle condizioni ecologiche che si realizzano nell alimento stesso. La comprensione e l applicazione dei principi dell ecologia microbica ai sistemi alimentari è di fondamentale importanza per il controllo della loro qualità e sicurezza microbiologica. Infatti, tutte le moderne procedure e strategie di assicurazione della qualità, dell analisi quantitativa del rischio, della microbiologia predittiva, dei metodi di conservazione degli alimenti, così come la microbiologia analitica si fondano sulle conoscenze del comportamento dei vari microrganismi negli ecosistemi alimentari. Gli ecosistemi sono costituiti dall ambiente e dagli organismi che vivono in esso. Quando sono colonizzati da microrganismi, gli alimenti costituiscono degli ecosistemi ben definiti, la cui complessità è determinata dalle interazioni tra i fattori ambientali intrinseci ed estrinseci dell alimento stesso. Le popolazioni microbiche inizialmente presenti nell alimento, sotto l azione selettiva dei determinanti ecologici, subiranno delle modificazioni della loro struttura comunitaria. I fattori ecologici che influenzano il comportamento dei microrganismi negli alimenti, e quindi il destino della comunità microbica inizialmente presente, vengono classificati in quattro gruppi principali: fattori intrinseci; fattori estrinseci; fattori di processo e fattori impliciti. I fattori intrinseci riguardano le caratteristiche proprie dell alimento e riguardano la composizione chimica, la disponibilità di acqua libera (a w ), il ph, la presenza di antimicrobici naturali o di conservanti aggiunti, il potenziale di ossido riduzione e la presenza di eventuali strutture biologiche. I fattori estrinseci che influenzano la crescita dei microrganismi negli alimenti sono rappresentati dalle condizioni esterne applicate all alimento e riguardano in particolar modo la temperatura, l umidità e la composizione gassosa dell atmosfera in cui l alimento viene conservato. I fattori di processo includono tutte quelle procedure che applicate all alimento nel corso della sua trasformazione ne modificano completamente l ecologia. I processi tecnologici applicati 2
possono comprendere trattamenti termici, refrigerazione, salagione, acidificazione, aggiunta di starter ecc. I fattori impliciti comprendono le relazioni che si instaurano tra i microrganismi che hanno colonizzato l alimento nelle condizioni dettate dall azione dei fattori intrinseci ed estrinseci. Le popolazioni microbiche presenti nell alimento possono esercitare azioni sinergiche, per cui un dato gruppo di microrganismi viene avvantaggiato dallo sviluppo di un altro gruppo (ad es. rimuovendo metaboliti tossici, o producendo metaboliti utili o modificando le condizioni intrinseche dell alimento) e azioni antagonistiche mediante la produzione di sostanze antimicrobiche, o attraverso la competizione per i nutritivi ecc. Manipolando in maniera appropriata questi fattori è possibile operare un azione di controllo dei microrganismi negli alimenti. In effetti questi fattori rappresentano la base su cui si fondano la maggior parte delle procedure di conservazione degli alimenti I microrganismi negli alimenti si moltiplicano secondo una cinetica paragonabile a quella che si realizza nei sistemi di coltura chiusi discontinui. Nelle condizioni ottimali di sviluppo, se riportiamo il log del numero di cellule per g o ml di substrato si ottiene una curva caratterizzata da una serie di fasi. Una prima fase, detta di latenza o fase Lag, le cellule mettono in atto meccanismi tali per adattarsi all ambiente e pertanto il numero di cellule in questa fase rimane costante. La durata della lag fase dipende da molti fattori come la composizione del substrato di crescita, la temperatura e l atmosfera di incubazione e lo stato fisiologico delle cellule al momento dell inoculo. Segue una fase in cui le cellule incominciano a moltiplicarsi mediante divisione binaria, per cui il numero di batteri raddoppia ad ogni successiva divisione. Questa fase è detta fase esponenziale o fase log e continua fin tanto che non intervengono fattori limitanti (esaurimento dei nutritivi, diminuzione del ph, accumulo di metaboliti tossici ecc.). Successivamente si ha una fase stazionaria in cui il numero di cellule rimane più o meno costante a cui segue una fase di declino o morte. La cinetica dello sviluppo microbico nella fase esponenziale può essere descritta matematicamente dalla seguente equazione, N=N 0 e µt, in cui il numero di cellule (N) in un dato periodo di tempo t è direttamente proporzionale al numero di cellule iniziale (N 0 ). 4 - Il ruolo svolto dai microrganismi nella produzione e conservazione degli alimenti e sul benessere umano 4.1 - I microrganismi pro-tecnologici e il loro ruolo nella produzione e conservazione degli alimenti I microrganismi che causano cambiamenti desiderati negli alimenti sono in genere detti protecnologici. La produzione di alimenti basati sull attività fermentativa svolta da microrganismi vari sono conosciuti e applicati fin dai tempi antichi. Materie prime come il latte, la carne o alcuni vegetali venivano sottoposti ad una serie di cambiamenti fino a nuovi prodotti che potevano essere, per così dire, salvati per ulteriori usi. Questi processi di trasformazione furono molto probabilmente scoperti per caso ed erano praticati senza conoscerne le basi fermentative. Con metodi empirici, prove ed errori, inconsapevolmente si creavano le condizioni in grado di selezionare nell ambito della microflora naturalmente presente nelle materie prime e nei recipienti e attrezzi, microrganismi utili, mentre altri erano inibiti. Dopo millenni di efficace empirismo di conservazione degli alimenti il riconoscimento da parte di Pasteur nel 1857 della natura microbica delle fermentazioni e successivamente il primo isolamento in coltura pura di un batterio da parte di Lister nel 1878, identificato come Bacterium lactis (oggi Lactococcus lactis) portarono all impiego nel 1890 della prima coltura starter per la produzione di formaggi, aprendo la strada per l industrializzazione delle fermentazioni alimentari. Sebbene lo scopo originale delle fermentazioni alimentari era quello di prolungare il tempo di conservazione dei prodotti, le colture starter sono state introdotte in alcuni settori dell industria alimentare per iniziare la fermentazione e assicurare l esito tecnologico del processo produttivo. La selezione dei ceppi e la formulazione delle colture starter pertanto è stata per lungo tempo basata soprattutto sulla capacità dei ceppi microbici di svolgere i processi biochimici richiesti dalle varie tecnologie di trasformazione. Gli sviluppi delle biotecnologie e le migliori conoscenze sul metabolismo dei microrganismi coinvolti nei processi fermentativi possono contribuire, in maniera non marginale, sia al conseguimento degli obiettivi industriali sia nella conservazione di quelle caratteristiche che 3
originalmente rendevano tradizionale il prodotto. Inoltre, negli ultimi anni, come conseguenza dei mutati stili di vita, le nostre abitudini alimentari e i gli alimenti che consumiamo hanno subito cambiamenti rilevanti, con un rafforzamento del binomio alimento e salute. Tutto ciò ha fatto crescere sempre di più l interesse per quegli alimenti che, oltre agli effetti nutrizionali, esercitano anche effetti benefici su una o più funzioni del corpo, migliorando lo stato di salute del consumatore e/o riducendo i rischi di malattie, ormai conosciuti come alimenti funzionali. I microrganismi coinvolti nella preparazione di alimenti fermentati appartengono a gruppi diversi come i batteri lattici, i lieviti, le muffe, le Micrococcaceae, i propionibatteri ed altri ancora. Tra questi, i batteri lattici come componenti di colture starter e/o protettive, trovano largo impiego nella produzione di una grande varietà di alimenti fermentati, come derivati del latte, della carne, di vegetali, di prodotti da forno, insilati e altri, contribuendo in vari modi nel determinare le loro caratteristiche e la loro stabilità. Spesso si tende a fare una distinzione, e talvolta tale distinzione è necessaria, tra colture starter e colture protettive, anche se in realtà potrebbe trattarsi della stessa coltura applicata per scopi diversi in condizioni diverse. Naturalmente per una coltura starter le attività metaboliche di interesse tecnologico (capacità acidificanti, proteolitiche, aromatizzanti, addensanti ecc.) hanno un importanza principale, mentre le azioni antimicrobiche potrebbero rappresentare un effetto secondario; per una coltura protettiva gli obiettivi funzionali sono l inverso. La prima classificazione dei batteri lattici è dovuta ad Orla-Jensen che nel 1919, sulla base di caratteristiche morfologiche e fisiologiche individuò 7 generi. Negli ultimi 20 anni, grazie all introduzione di moderne tecniche biochimiche e molecolari, gli studi chemiotassonomici e filogenetici hanno consentito un ampliamento del raggruppamento inizialmente proposto, comportando allo stesso tempo grosse modificazioni anche della loro nomenclatura. Filogeneticamente, i batteri lattici appartengono al ramo evolutivo dei clostridi. Si tratta di batteri gram positivi, di forma bastoncellare o coccica, non sporigeni, catalasi negativi, ossigeno tolleranti a metabolismo fermentativo, con un contenuto molare in G+C del loro DNA inferiore al 55%. Al gruppo attualmente sono ascrivibili moltissimi generi, tra cui le specie e i ceppi maggiormente utilizzati nelle fermentazioni alimentari, appartengono ai generi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Pediococcus, Carnobacterium ed Enterococcus. I batteri lattici sono considerati organismi di grado alimentare (Food-grade) e la maggior parte di essi sono riconosciuti come generalmente sicuri per la salute umana, cioè organismi GRAS (generally recognised as safe). La qualità di grado alimentare e l assenza di rischi per la salute sono le prime due caratteristiche che i ceppi selezionati devono possedere per far parte di una coltura starter o protettiva. Altre caratteristiche riguardano i loro effetti benefici apportati al prodotto come l adattamento al substrato, la capacità di competere con la microflora naturalmente presente e la produzione di metaboliti ad attività antimicrobica (acidi organici, il perossido di idrogeno, enzimi, metaboliti a basso peso molecolare e le batteriocine); infine una buona coltura protettiva non deve determinare nell alimento modificazioni organolettiche negative e dovrebbe poter funzionare da indicatore di rischi microbiologici nel caso in cui i fattori tecnologici miranti alla stabilità dell alimento non vengano rispettati come ad esempio la non corretta applicazione della catena del freddo, o la scarsa acidità ecc. 4.2 - I microrganismi Probiotici I microrganismi vivi che, dopo ingestione in numero appropriato, esercitano un effetto benefico sulla salute del consumatore sono definiti probiotici. I microrganismi utilizzati per le loro proprietà di promuovere la salute umana appartengono a diversi generi di batteri e lieviti. I ceppi più comunemente utilizzati appartengono all eterogeneo gruppo dei batteri lattici: Lactobacillus, Bifidobacterium ed Enterococcus. In ogni modo, negli ultimi anni, altri microrganismi, quali alcune specie del genere Bacillus e alcune specie di lieviti sono stati sviluppati come potenziali probiotici. In questo corso descriveremo l ecologia, le proprietà fisiologiche, la tassonomia e i metodi di isolamento e identificazione dei gruppi e delle specie di microrganismi di maggiore interesse probiotico e alimentare. 5- I microrganismi indicatori della qualità e sicurezza microbiologica degli alimenti Il numero e i tipi di microrganismi presenti in un alimento possono essere usati per giudicare la qualità e la sicurezza microbiologica di quel prodotto. La sicurezza e la qualità microbiologica di un alimento è determinata dall assenza di microrganismi patogeni e/o delle loro tossine e dal 4
livello di microrganismi alterativi. In generale, non è praticabile analizzare ogni alimento per la presenza di microrganismi indesiderati, siano essi patogeni che alterativi. In pratica per accertare sia la qualità microbiologica che la sicurezza di un alimento si fa ricorso alla ricerca di organismi in grado di indicare una situazione potenzialmente pericolosa. Tali microrganismi o gruppi di microrganismi sono detti Organismi marker e sono distinti in due gruppi: organismi index e organismi indicatori. Fanno parte dei microrganismi indicatori i seguenti gruppi di microrganismi: microrganismi aerobi mesofili, famiglia delle Enterobacteriaceae, coliformi ed Escherichia coli, streptococchi fecali (enterococchi) e clostridi solfito-riduttori. 6 - I microrganismi anti-tecnologici o alterativi e le alterazioni degli alimenti I microrganismi che causano modificazioni in un alimento tali da renderlo inaccettabile per il consumo umano sono detti alterativi. I più importanti microrganismi alterativi appartengono a diversi gruppi microbici, come batteri gram-negativi, batteri gram-positivi sporigeni e non, batteri lattici, lieviti e muffe. Con poche eccezioni, tutti gli alimenti, dopo la raccolta o la macellazione o nel corso di ogni fase della loro trasformazione e consumo, vanno incontro ad alterazioni di varia natura che comportano una perdita della loro qualità con una velocità che è strettamente dipendente dal tipo e composizione dell alimento, dalle tecnologie di trasformazione e dalle modalità di conservazione, distribuzione e consumo. A volte le modificazioni indesiderate possono essere ovvie, come lo sviluppo superficiale di muffe o la produzione di mucillagini batteriche; altre volte l alterazione riguarda modificazioni strutturali dell alimento o la comparsa di sapori e odori anomali, che sono il risultato di complesse interazioni tra la microflora che si sviluppa nell alimento e le modificazioni chimiche che avvengono nell alimento stesso. Le alterazioni di natura biologica possono essere imputate ai processi di degradazione (idrolisi e ossidazioni) a carico dei lipidi, delle proteine e degli aminoacidi, dei carboidrati, degli alcoli ecc., catalizzate da enzimi costitutivi dell alimento (di origine animale o vegetale) o da enzimi prodotti da microrganismi che contaminano l alimento. L alterazione di un alimento è dunque il risultato dell attività microbica di una grande varietà di microrganismi, il cui numero e composizione speciografica risulta strettamente dipendente dalle caratteristiche del prodotto e dalle condizioni ecologiche che in esso si realizzano nel corso della sua trasformazione e conservazione. I danni economici, sia per l industria alimentare sia per il consumatore, conseguenti dall alterazione microbica degli alimenti sono inestimabili. Per questo motivo, la produzione di alimenti stabili nei confronti delle alterazioni è stato un obiettivo e un esigenza via via crescente nella storia dell uomo. 7- Biologia, ecologia, attività metaboliche e fondamenti di sistematica di microrganismi patogeni trasmessi con gli alimenti Le malattie causate dall ingestione di alimenti contaminati da microrganismi infettivi e tossinogeni rappresentano ancora un problema molto diffuso nel mondo contemporaneo, malgrado l applicazione di moderne procedure di accertamento e controllo delle possibili deviazioni dagli standard di sicurezza delle produzioni alimentari. Tra i vari agenti causali (batteri, funghi, parassiti, virus ecc.), i batteri risultano quelli maggiormente implicati nelle malattie alimentari. Viene stimato che oltre il 70% degli episodi che si verificano nel mondo sono da attribuire ai batteri. Generalmente, le malattie alimentari sostenute da batteri e/o loro tossine vengono classificate come infezioni e intossicazioni, sebbene considerando i meccanismi dell azione patogena è possibile individuare almeno quattro gruppi di batteri patogeni: 1) batteri che causano le classiche infezioni; 2) batteri che causano le classiche intossicazioni; 3) batteri che pur causando tipiche infezioni, devono prima colonizzare le cellule epiteliali del tratto gastro-intestinali per produrre la tossina; 4) batteri tipicamente infettivi che producono tossina senza interagire con le cellule epiteliali dell intestino. Solo una parte (stimata intorno all 1%) degli avvelenamenti da cibo vengano riportati nelle statistiche annuali. Questo, si ritiene sia imputabile, da una parte, al mancato rapporto dei casi dovuto a scarsa investigazione, ma anche, molto probabilmente ad una minore importanza, sotto il profilo psicologico, che oggi si tende a dare a queste malattie, per cui la persona colpita spesso evita di consultare il medico, aspettando la guarigione, o rivolgendosi alle strutture sanitarie solo se i sintomi non scompaiono dopo qualche giorno. 5
Perché si verifichi una malattia alimentare di origine batterica, è necessario che si realizzino una serie di circostanze, il più delle volte contemporaneamente, come la presenza nell alimento di batteri in concentrazione sufficiente a consentire una loro sopravvivenza durante le fasi di produzione, la moltiplicazione dei batteri nell alimento fino ad un numero sufficiente a determinare la malattia o a produrre tossine in quantità tale da determinare la malattia e l ingestione di una quantità sufficiente di alimento contenente batteri o tossine. Per ogni microrganismo, inoltre, esiste una Dose Infettiva Minima (DIM) che dipende principalmente dalla virulenza del microrganismo e dall età e stato generale di salute delle persone colpite. In genere, bambini e anziani e persone con deficit immunitari sono molto più suscettibili all attacco microbico e una dose inferiore alla DIM può essere sufficiente a causare la malattia. L insorgenza, la diffusione e la persistenza di episodi di malattie alimentari è strettamente correlata con i fattori che contribuiscono alla contaminazione degli alimenti. Tra questi rivestono particolare importanza la diffusione del fenomeno della ristorazione collettiva e la rapida espansione dei viaggi turistici che implicano spostamenti nel mondo di grandi masse di persone, ma anche le modificate abitudini alimentari dei consumatori, gli scambi internazionali di derrate alimentari, le modificazioni tecnologiche di produzione, confezionamento, distribuzione ecc. degli alimenti. E demandato alle autorità sanitarie competenti il compito di mettere in atto programmi di sorveglianza e vigilanza al fine di individuare episodi epidemici di malattie associate al consumo di alimenti. Un episodio epidemico di origine alimentare o outbreack degli anglosassoni, rappresenta un evento in cui due o più persone presentano la stessa malattia in seguito all ingestione dello stesso alimento. I dati relativi a queste indagini possono essere usati a fini preventivi con l emanazione di regolamenti e leggi che forniscono all industria alimentare le procedure più idonee da adottare durante tutte le fasi della produzione per assicurare il massimo livello di sicurezza degli alimenti. Si possono così in futuro prevenire casi analoghi di malattie alimentari, informando gli addetti alla preparazione di alimenti delle circostanze che hanno causato l episodio e fornendo suggerimenti su come evitare il ripetersi di incidenti; si potranno infine avere utili informazioni sui pericoli e sui punti critici di controllo di un particolare processo produttivo e sui metodi appropriati per il loro controllo per la corretta applicazione dell HACCP. 8 - Microbiologia dei principali prodotti alimentari 8.1- Prodotti alimentari non fermentati Come già accennato prima, quasi tutti gli alimenti, nel corso di ogni fase della loro produzione, trasformazione e consumo, possono essere contaminati da una vasta gamma di microrganismi, che possono compromettere la loro qualità e sicurezza d uso. Prenderemo in considerazione l origine e la composizione della microflora di vari alimenti non fermentati (Acque potabili, Latte, Carne, Prodotti ittici, Vegetali, Uova e prodotti a base di uova, Preparazioni gastronomiche, Conserve) in funzione della loro composizione, delle tecnologie di trasformazione e delle modalità di conservazione, distribuzione e consumo. 8.2- Prodotti alimentari fermentati La produzione di alimenti basati sull attività fermentativa svolta da microrganismi vari sono conosciuti e applicati fin dai tempi antichi. Materie prime come il latte, la carne o alcuni vegetali erano sottoposti ad una serie di cambiamenti fino a nuovi prodotti che potevano essere, per così dire, salvati per ulteriori usi. Questi processi di trasformazione furono molto probabilmente scoperti per caso ed erano praticati senza conoscerne le basi fermentative. Con metodi empirici, prove ed errori, inconsapevolmente si creavano le condizioni in grado di selezionare nell ambito della microflora naturalmente presente nelle materie prime e nei recipienti e attrezzi, microrganismi utili, mentre altri erano inibiti. Nella maggior parte dei casi le metodologie e le conoscenze associate con la produzione di questi alimenti veniva tramandata da generazioni in generazioni all interno di comunità locali, monasteri e stati feudali. Dopo millenni di efficace empirismo di conservazione degli alimenti il riconoscimento da parte di Pasteur nel 1857 della natura microbica delle fermentazioni e successivamente il primo isolamento in coltura pura di un batterio da parte di Lister nel 1878, identificato come Bacterium lactis (oggi Lactococcus lactis subsp. lactis) portarono all impiego nel 1890 della prima coltura starter per la produzione di formaggi, aprendo la strada per l industrializzazione delle fermentazioni alimentari. Sebbene lo scopo originale delle fermentazioni alimentari fosse quello di prolungare il tempo di conservazione dei prodotti, le colture starter sono state introdotte in alcuni settori dell industria 6
alimentare per iniziare la fermentazione e assicurare l esito tecnologico del processo produttivo. La selezione dei ceppi e la formulazione delle colture starter pertanto è stata basata per lungo tempo soprattutto sulla capacità dei ceppi microbici di svolgere i processi biochimici richiesti dalle varie tecnologie di trasformazione. Gli sviluppi delle biotecnologie e le migliori conoscenze sul metabolismo dei microrganismi coinvolti nei processi fermentativi possono contribuire, in maniera non marginale, sia al conseguimento degli obiettivi industriali sia nella conservazione di quelle caratteristiche che originalmente rendevano tradizionale il prodotto. Durante questo corso descriveremo i processi di fermentazione e di produzione dei più importanti alimenti fermentati. 9 - Sistemi di controllo dei microrganismi negli alimenti e nell industria alimentare mediante metodi fisici, fisico-chimici, chimici e biologici Da tempo immemorabile l uomo ha messo a punto tecniche di conservazione capaci di rallentare i fenomeni di degradazione biologica degli alimenti in maniera da garantire il più possibile la loro integrità originale e di prevenire o inibire la crescita di microrganismi patogeni, a garanzia della loro sicurezza d uso. La maggior parte delle tecniche di conservazione degli alimenti hanno come obiettivo principale quello di prevenire, rimuovere, ritardare o inibire la crescita di microrganismi indesiderati (alterativi e/o patogeni) o di inattivarli completamente mediante l impiego di metodi fisici, fisicochimici, chimici e biologici La colonizzazione di un alimento da parte di specie e ceppi di microrganismi sia utili che dannosi dipende strettamente dalle condizioni ecologiche che si realizzano nell alimento stesso. Quando sono colonizzati da microrganismi, gli alimenti costituiscono degli ecosistemi ben definiti, la cui complessità è determinata dalle interazioni tra i fattori ambientali intrinseci ed estrinseci dell alimento stesso. Le popolazioni microbiche inizialmente presenti nell alimento, sotto l azione selettiva dei determinanti ecologici, subiranno delle modificazioni della loro struttura comunitaria. I parametri che influenzano in maniera significativa la proliferazione microbica in un determinato alimento sono rappresentati da fattori intrinseci legati alle proprietà fisiche, chimiche e biochimiche dell alimento (composizione chimica, disponibilità di acqua libera a w, ph, presenza di antimicrobici naturali o di conservanti aggiunti, potenziale di ossido riduzione, presenza di eventuali strutture biologiche), da fattori di processo legati ai trattamenti ai quali l alimento viene sottoposto (trattamenti termici, refrigerazione, salagione, acidificazione, aggiunta di starter ecc.), da fattori estrinseci legati alle condizioni di conservazione dell alimento (temperatura, umidità, composizione gassosa dell atmosfera di conservazione) e da fattori impliciti legati alla natura dei microrganismi stessi e alle interazioni che si instaurano tra di loro e l ambiente in cui vivono (sinergismi e antagonismi). Dunque, la preservazione della qualità e sicurezza microbiologica di un alimento implica la creazione di un ambiente ostile ai microrganismi che lo colonizzano attraverso la manipolazione appropriata dei fattori ecologici, i quali costituiscono la base su cui si fondano la maggior parte delle procedure di conservazione degli alimenti. Oltre alle tradizionali tecnologie (trattamenti termici, refrigerazione, congelamento, essiccazione, salagione, additivi, ecc.), che continuano, comunque, ad essere importanti, oggi si stanno affermando nuove tecniche di conservazione degli alimenti (confezionamento sotto vuoto e in atmosfere modificate, alte pressioni idrostatiche, scariche elettriche ad alta intensità, manotermosonicazione, uso di enzimi e colture protettive di batteri lattici e/o loro metaboliti ad azione antimicrobica), soprattutto come conseguenza delle richieste dei consumatori sugli attributi qualitativi che un alimento deve possedere. Infatti vi è una generale e aumentata tendenza dei consumatori a preferire alimenti che abbiano subito trattamenti tecnologici meno drastici, preparati con pochi, o addirittura senza additivi chimici e con bassi contenuti di acidi, zuccheri, sali e grassi, cioè alimenti più sicuri e naturali. 10 - Cenni sul sistema HACCP (Hazard Analysis Critical Control Points) e la nuova legislazione europea relativa al controllo e alla sicurezza degli alimenti L applicazione dell HACCP (Hazard analysis and critical control points) rappresenta un utile strumento per garantire la sicurezza igienica degli alimenti. L applicazione dei principi su cui è basato tale sistema mira ad identificare i pericoli associati ad ogni singola fase della produzione di un alimento, valutandone i rischi (cioè la probabilità che un pericolo si verifichi) e le relative conseguenze, definendo nel contempo le misure e i mezzi per il loro controllo. L implementazione del sistema HACCP nelle industrie alimentari è sancito dalla legislazione internazionale e nazionale in materia di alimenti ed in particolare dal Regolamento (CE) n. 7
852/2004 del 29 aprile 2004 Regolamento del Parlamento europeo e del Consiglio sull'igiene dei prodotti alimentari. Tale regolamento suggerisce inoltre alle aziende alimentari di applicare costantemente le norme di buona fabbricazione (GMP: Good Manufacturing Procedures) e di predisporre manuali di corretta prassi igienica. ESERCITAZIONI -L analisi microbiologica degli alimenti. -Piani di campionamento e criteri microbiologici. -Metodi analitici per la numerazione dei microrganismi negli alimenti. --Conteggio standard di cellule vitali su piastra (standard plate counts). --Conteggio dei microrganismi in terreno nutritivo liquido: tecnica di stima del numero più probabile di microrganismi (MPN, most probable number). -Presupposti teorici sui metodi di ricerca e numerazione di batteri patogeni trasmessi con gli alimenti. --Principi di microbiologia selettiva e differenziale. --Fasi per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti. --Principi sull identificazione dei batteri. -Analisi microbiologica di specifici prodotti alimentari. Bibliografia Libri di testo Appunti dalle lezioni Una parte del materiale didattico è disponibile all indirizzo: http://www.docenti.unina.it/francesco.villani GALLI VOLONTERIO A. (2005) Microbiologia degli alimenti. Casa Editrice Ambrosiana, Milano. BURGEOIS, C.M., MESCLE, J.F., ZUCCA, J. (1990) Microbiologia alimentare. Ed. Tecniche Nuove, Milano. Libri di approfondimento BELL C., NEAVES P., WILLIAMS A. P. (2005) Food microbiology and laboratory practice. Blackwell Sciente, UK. DOYLE M.P., BEUCHAT L.R., MONTVILLE T.J. (1997) Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. ASM Press. GARBUT J. (1997) Essentials of food microbiology. Arnold, London. HAYES, P.R. (1995) Food Microbiology and hygiene. Second Edition. Chapman & Hall. ICMSF (1996) Microrganisms in foods 5. Characteristics of microbial pathogens, Blackie Academic & Professional, London. JAY J.M., LOESSNER M.J., GOLDEN D.A. (2005) Modern Food microbiology. Sprnger, USA. MOSSEL D.A.A., CORRY J.E.L., STRUIJK C.B., BAIRD R.M. (1995) Essentials of the microbiology of foods. A text book for advanced studies. John Wiley and Sons. Chichester, U.K. RAY B. (2004) Fundamental of food microbiology. CRC PRESS, London. ROBERTS D., HOOPER W., GREENWOOD M. (1995) Practical Food Microbiology. PHLS, London. 8