BioOscientific MaxSignal Aflatoxin M1 test kit Cat. N. BOS106005 Saggio ELISA per rilevazione di Aflatossina M1 Manuale Utente Leggere attentamente questo inserto prima di utilizzare il prodotto Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy : +39 059 8637161 : +39 059 7353024 : laboratorio@generon.it : www.generon.it [1] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Indice 1 - INFORMAZIONI GENERALI Descrizione del prodotto Procedura generale Contenuto del kit, conservazione e durata Sensibilità (Limite di rilevazione) Specificità (Cross-reattività) Materiali necessari non inclusi nel kit Avvertenze e precauzioni 2 - ALLESTIMENTO DEL CAMPIONE Latte Latte in polvere Burro/Formaggio Yogurt/Latticello/Latte cagliato 3 PROTOCOLLO DEL KIT: METODO QUANTITATIVO STANDARD Preparazione dei reagenti Protocollo test ELISA 4 PROTOCOLLO DEL KIT: METODO QUANTITATIVO RAPIDO Preparazione dei reagenti Protocollo test ELISA 5- PROTOCOLLO DEL KIT: METODO SEMI-QUANTITATIVO Preparazione dei reagenti Protocollo test ELISA 6 - RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Nessuno sviluppo del colore o Nessun segnale con gli standard Bassa lettura della densità ottica (OD) Elevato rumore di fondo o eccessiva densità ottica (OD) Alta variabilità Intra-Piastra Alta variabilità Inter-Piastra Uno o più punti della curva standard sono fuori dal range Il MaxSignal Aflatoxin M1 ELISA Test Kit è da utilizzare unicamente in laboratorio tranne se diversamente indicato. Questo prodotto non è per un uso diagnostico clinico. MaxSignal è un marchio registrato di BioO Scientific Corporation (BIOO). [2] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
1 Informazioni Generali Descrizione del prodotto Il MaxSignal Aflatoxin M1 ELISA Test Kit è un saggio competitivo immunoenzimatico per l analisi quantitativa di Aflatossina M1 in formaggio, burro, yogurt, latticello, latte cagliato, latte in polvere e latte. Aflatossina M1 è il metabolita idrossilato dell Aflatossina B1. Le Aflatossine sono ritenute essere tra le principali sostanze cancerogeniche presenti in natura, capaci di danneggiare il fegato e il DNA. Nel 1987, l OMS ha classificato le aflatossine come sostanze cancerogene di Gruppo 1. È noto che l Aflatossina M1 viene ossidata dalle ossigenasi a funzione mista P450 del fegato. Questa ossidazione genera come prodotto un 8,9-epossido, che sembra attaccare preferenzialmente certi residui di guanina nei doppi filamenti di DNA. L aflatossicosi è una malattia causata dall ingestione di aflatossine in alimenti o mangimi contaminati. Il MaxSignaI Aflatoxin M1 ELISA Test Kit consente alle agenzie di controllo governative e internazionali, ai produttori alimentari nonché agli enti di certificazione della qualità di rilevare aflatossina M1 in formaggio, latte in polvere e latte e soddisfare i clienti relativamente alla sicurezza alimentare. Le caratteristiche uniche del kit sono: Campioni di latte possono essere usati direttamente in ELISA Alta sensibilità (0.005 ng/g o ppb) Alta riproducibilità Procedura Generale Il metodo è basato su un saggio ELISA competitivo e colorimetrico. L anticorpo per Aflatossina M1 è inserito nei pozzetti della piastra. Durante le analisi, il campione viene aggiunto ai pozzetti per l incubazione. Dopo il lavaggio della piastra, l Aflatossina M1 coniugata con la perossidasi del rafano (Aflatoxin M1-HRP) viene aggiunta ai pozzetti per l incubazione. Se un residuo di Aflatossina M1 è presente nel campione, competerà con l anticorpo per l Aflatossina M1, impedendo così alla perossidasi del rafano di legare l anticorpo attaccato al pozzetto. L intensità della colorazione che risulta dopo l aggiunta del substrato ha una proporzionalità inversa alla concentrazione di aflatossine nel campione. [3] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Contenuto del kit, conservazione e durata Il MaxSignaI Aflatoxin M1 ELISA Test Kit consente 96 determinazioni o test su 42 campioni in duplicato (supponendo 12 pozzetti per gli standard). Riporre ogni micropozzetto inutilizzato nella bustina e risigillare con il disseccante incluso nella confezione originale. Conservare il kit a 2-8 C*. Il periodo di validità è di 12 mesi se il kit è correttamente conservato. Contenuto del kit Quantità Conservazione Aflatossina M1 Piastra 12x8 pozzetti 2-8 C Aflatossina M1 Standard: Controllo Negativo (provetta tappo bianco) 0.0050 ng/ml (provetta tappo giallo) 0.015 ng/ml (provetta tappo arancione) 0.030 ng/ml (provetta tappo rosa) 0.090 ng/ml (provetta tappo viola) 0.27 ng/ml (provetta tappo blu) 10.0 ng/ml (provetta standard interno tappo rosso) 1.8 ml 2-8 C Aflatossina M1 - HRP coniugato 12 ml 2-8 C 20X Wash Solution ** 14 ml 2-8 C Substrato TMB ** 12 ml 2-8 C 10X PBS (Opzionale) 25 ml 2-8 C 10X Milk Extraction Buffer (Opzionale) 5 ml 2-8 C *Se si pensa di non utilizzare il kit per oltre un mese, conservare Aflatossina M1 Standard e Aflatossina M1- HRP coniugati in un freezer a -20 C. ** Elementi con lo stesso codice BIOO entro la loro data di scadenza sono intercambiabili tra loro. Sensibilità (Limite di rilevazione) Latte Latte in polvere Burro/Formaggio Yogurt/Latticello/Latte cagliato 5 ppt 5 ppt 20 ppt 10 ppt Specificità (Cross-Reattività) Aflatossina M1 100% Aflatossina B1 59% Aflatossina B2 14% Aflatossina G1 21% Aflatossina G2 13% [4] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Materiali richiesti non inclusi nel kit Lettore di micropiastre (450 nm filtro primario; 630 nm filtro differenziale, codice ACC1028) Pipette da 10, 20, 100 e 1000 microlitri Pipette Multi-canale da 50-300 microlitri (Opzionale, code ACC1018) Termoblocco riscaldante (solo per il protocollo RAPID quantitative e il protocollo Semi-Quantitativo, codice ACC1025) Avvertenze e Precauzioni BIOO raccomanda fortemente di leggere le seguenti avvertenze e precauzioni per assicurare la completa consapevolezza all utilizzatore circa le tecniche ELISA e altri dettagli verso i quali riporre attenzione durante l utilizzo dei saggi. Ulteriori informazioni possono essere trovate nella sezione Risoluzione dei problemi. Periodicamente, ottimizzazioni e revisioni vengono fatte al kit e al manuale. Di conseguenza, è importante seguire il protocollo in allegato al kit. Se si necessita di ulteriore assistenza, è possibile contattare laboratorio@generon.it in qualità di distributore locale o BIOO all indirizzo techsupport@biooscientific.com. Gli standard contengono Aflatossina M1. Maneggiare con cautela. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza. GLI ANTICORPI E LE PIASTRE SONO SPECIFICHE PER IL KIT E LOTTO. Non mescolare reagenti provenienti da kit differenti, ad eccezione di componenti con lo stesso codice entro la loro data di scadenza. Mantenere una temperatura in laboratorio tra i 20 e i 25 C. Evitare di utilizzare i saggi in prossimità di correnti d aria, poiché ciò potrebbe causare un raffreddamento eccessivo, riscaldamento e/o evaporazione. Non utilizzare i saggi esponendosi direttamente al sole, poiché potrebbe causare un riscaldamento eccessivo ed evaporazione. Non lavorare su piani di lavoro freddi, eventualmente disponendo diversi strati di carta o altri materiali isolanti sotto alle piastre durante l incubazione. Assicurarsi di usare solo acqua distillata o deionizzata poiché la qualità dell acqua è molto importante. Quando si pipettano i campioni o i reagenti dentro una micropiastra vuota, posizionare il puntale nell angolo in basso del pozzetto, a contatto con la plastica. Le incubazioni delle piastre devono durare il più precisamente possibile. Essere precisi quando si aggiungono gli standard alla piastra. Aggiungere prima gli standard e poi i campioni. Aggiungere gli standard alla piastra in ordine dalla minor concentrazione alla più alta concentrazione, per minimizzare il rischio di contaminare la curva standard. Refrigerare sempre le piastre in contenitori sigillati con il dessiccante per mantenere una corretta conservazione. Per prevenire la formazione di condensa sulle piastre, portarle a temperatura ambiente (20-25 C) mentre sono nei contenitori. BIOO e Generon non offrono garanzie di nessun tipo, né espresse né implicite, ad eccezione dei materiali di cui i loro prodotti sono fatti, di qualità standard. Non ci sono garanzie di vendita per questo prodotto, o sull efficacia del prodotto per ogni applicazione. BIOO e Generon non sono responsabili per alcun danno, inclusi danni speciali o conseguenti, o spese direttamente o indirettamente dovute all uso di questo prodotto. [5] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
2 Preparazione del campione Assicurarsi che i campioni siano correttamente conservati. I campioni devono essere refrigerati a 2-4 C per non più di 1-2 giorni. Congelare i campioni ad un minimo di -20 C se devono essere conservati per un lungo periodo. I campioni congelati possono essere scongelati a temperatura ambiente (20-25 C) o in un frigorifero prima dell uso. Preparazione di 1X PBS: Aggiungere 1 volume di 10X PBS a 9 volumi di acqua distillata. Preparazione di 1X Milk Extraction Buffer: Aggiungere 1 volume di 10X Buffer estrazione Latte a 9 volumi di acqua distillata. Latte In generale, latte crudo e omogeneizzato possono essere direttamente utilizzati per il saggio. Comunque, se si riscontra alto rumore di fondo o un basso recupero, centrifugare il latte per 10-20 minuti a 4,000 x g scartando lo strato superiore di grasso e usando il campione rimanente per il saggio. Nota: Fattore di diluizione = 1 Latte in polvere Per 1 g di latte in polvere in una provetta, aggiungere 10 ml di acqua distillata. Sciogliere il campione vortexando. Se si ottiene alto rumore di fondo perché il latte in polvere è particolarmente grasso, centrifugare per 10 minuti per sciogliere il latte, scartando lo strato superiore di grasso e usando il campione rimanente per il saggio. Nota: Fattore di diluizione = 1 (corrispondenti al latte liquido disciolto) Burro/Formaggio Per 1 g di formaggio o burro finemente grattugiato, aggiungere 4 ml di metanolo al 100%. (Consiglio: per campioni di burro, potrebbe essere necessario scaldare il campione a bagnomaria per diversi minuti per formare una soluzione omogenea prima di agitare). Agitare i campioni vigorosamente per 5 minuti manualmente o usando un agitatore. Centrifugare il campione per 10 minuti a 4,000 x g. Trasferire 1 ml del surnatante in una nuova provetta. Seccare il campione usando un evaporatore rotante a 70 C o insufflando azoto sul campione. Per ogni campione secco, aggiungere 800 µl di 1X PBS. Vortexare per 1 minuto. Usare 200 µl di campione per ogni pozzetto. Nota: Fattore di diluizione = 4 Yogurt/Latticello/Latte inacidito Per 0.5 ml di campione in una provetta, aggiungere 0.5 ml di 1X Milk Extraction Buffer. Vortexare il campione per 3 minuti alla massima velocità. Centrifugare il campione per 5 minuti a 4,000 x g. Usare per il saggio 200 µl dello strato acquoso nella parte bassa della provetta (evitando il contatto con lo strato superiore grasso). Nota: Fattore di diluizione = 2 [6] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
3 Test kit ELISA Aflatossina M1 Metodo Quantitativo STANDARD Preparazione dei Reagenti IMPORTANTE: Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso (1-2 ore a 20-25 C). Assicurarsi di avere letto la sezione Avvertenze e Precauzioni. Le soluzioni dovrebbero essere preparate subito prima del Test ELISA. Tutti i reagenti devono essere agitati vigorosamente prima dell uso. Preparare solo i volumi necessari per il numero di pozzetti che verranno utilizzati. Non rimettere i reagenti nella provetta/bottiglietta originale. È raccomandato l utilizzo di contenitori monouso quando si maneggiano i reagenti, per minimizzare il rischio di contaminazione. Preparazione di 1X Wash Solution: aggiungere 1 volume di 20X Wash Solution a 19 volumi di acqua distillata. Protocollo Test ELISA Calcolare le strip che verrano usate e aliquotare i reagenti come nell esempio seguente: Component Volume per Reaction Aflatossina M1-HRP Coniugata 100 µl 1X Wash Solution 1 ml Stop Buffer 100 µl TMB Substrato 100 µl 1. Aggiungere 200 µl di ogni Aflatossina M1 Standard in duplicato in pozzetti diversi. Aggiugere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. 2. Aggiungere 200 µl di ogni campione in duplicato in pozzetti diversi. 3. Incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). 4. Travasare attentamente o aspirare la soluzione dai pozzetti e scartare il liquido. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e delicatamente picchiettare per asciugarla su pezzi di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro. 5. Aggiungere 100 µl di Aflatossina M1-HRP coniugata in ogni pozzetto. 6. Incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). 7. Travasare attentamente o aspirare la soluzione dai pozzetti e scartare il liquido. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e delicatamente picchiettare per asciugarla su pezzi di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro. 8. Aggiungere 100 µl di TMB substrato. Incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Cronometrare la reazione facendo partire il timer subito dopo l aggiunta del substrato. Agitare la soluzione oscillando manualmente la piastra per 1 minuto durante l incubazione a temperatura ambiente. Non rimettere il substrato nella confezione originale per evitare potenziali contaminazioni. Se il TMB Substrato nella bottiglietta dovesse mostrare una qualunque colorazione, ciò è indicativo di un deterioramento e perciò la soluzione deve essere scartata. È consigliato coprire la micropiastra durante l incubazione. 9. Dopo l incubazione, aggiungere 100 µl di Stop Buffer per bloccare la reazione enzimatica. 10. Leggere le piastre il più presto possibile in seguito all aggiunta dello Stop Buffer su un lettore di micropiastre a lunghezza d onda 450 nm. Prima della lettura, pulire il fondo della piastra con una salvietta per assicurarsi che né umidità né impronte digitali interferiscano con le letture. [7] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Assorbanza relativa % Calcolo della concentrazione di Aflatossina M1 È possibile costruire una curva logaritmica utilizzando le medie delle assorbanze relative (%) ottenute da ogni standard di riferimento e la loro concentrazione in ng/ml. Assorbanza relativa (%) = [assorbanza standard (o campione) / assorbanza zero standard] x 100 Usare le medie dei valori delle assorbanze relative per ogni campione per determinare dalla curva standard la corrispondente concentrazione della sostanza ricercata in ng/ml. Il programma MaxSignal ELISA in Excel è disponibile a richiesta per valutare i risultati del test. Contattare laboratorio@generon.it per ulteriori informazioni. L immagine seguente è una tipica curva standard dell Aflatossina M1. Log [Standard] ng/ml [8] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
4 Test kit ELISA Aflatossina M1 Metodo Quantitativo RAPIDO Preparazione dei reagenti IMPORTANTE: Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso (1-2 ore a 20-25 C). Assicurarsi di avere letto la sezione Avvertenze e Precauzioni. Le soluzioni dovrebbero essere preparate subito prima del Test ELISA. Tutti i reagenti devono essere agitati vigorosamente prima dell uso. Preparare solo i volumi necessari per il numero di pozzetti che verranno utilizzati. Non riporre i reagenti nella provetta/botiglietta originale. È raccomandato l utilizzo di contenitori monouso quando si maneggiano i reagenti, per minimizzare il rischio di contaminazione. Preparazione di 1X Wash Solution: aggiungere 1 volume di 20X Wash Solution con 19 volumi di acqua distillata. Protocollo Test ELISA Questo protocollo è validato SOLO su campioni di latte e latte in polvere. Calcolare le strip che verranno usate e aliquotare i reagenti come nell esempio seguente: Component Volume per Reaction Aflatossina M1-HRP Coniugato 115 µl 1X Soluzione di Lavaggio 1 ml Stop Buffer 100 µl TMB Substrato 100 µl 1. Aggiungere 200 µl di Aflatossina M1 Standard in duplicato in pozzetti diversi. Aggiungere solo i seguenti standard: controllo negativo, 0.0050 ng/ml, 0.015 ng/ml, 0.030 ng/ml, 0.090 ng/ml. Aggiungere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. 2. Centrifugare ogni campione per 3 minuti a 14,000 g, scartando lo strato superiore di grasso. Aggiungere 200 µl di ogni campione in duplicato in pozzetti diversi. 3. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 C. 4. Travasare attentamente o aspirare la soluzione dai pozzetti e scartare il liquido. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e delicatamente picchiettare per asciugarla su pezzi di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro. 5. Aggiungere 115 µl di Aflatossina M1-HRP Coniugato in ogni pozzetto. 6. Incubare la piastra per 5 minuti a 37 C. 7. Travasare attentamente o aspirare la soluzione dai pozzetti e scartare il liquido. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e delicatamente picchiettare per asciugarla su pezzi di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro. 8. Aggiungere 100 µl di TMB substrato. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Cronometrare la reazione facendo partire il timer subito dopo l aggiunta del substrato. Agitare la soluzione oscillando manualmente la piastra per 1 minuto durante l incubazione a temperatura ambiente. Non rimettere il substrato nella confezione originale per evitare potenziali contaminazioni. Se il TMB Substrato nella bottiglietta dovesse mostrare una qualunque colorazione, ciò è indicativo di un deterioramento e perciò la soluzione deve essere scartata. È consigliato coprire la micropiastra durante l incubazione. [9] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Assorbana relativa % 9. Dopo l incubazione, aggiungere 100 µl di Stop Buffer per bloccare la reazione enzimatica. 10. Leggere le piastre il più presto possibile in seguito all aggiunta dello Stop Buffer su un lettore di micropiastre a lunghezza d onda 450 nm. Prima della lettura, pulire il fondo della piastra con una salvietta per evitare che né umidità né impronte digitali interferiscano con le letture. Calcolo della concentrazione di Aflatossina M1 È possibile costruire una curva logaritmica utilizzando le medie delle assorbanze relative (%) ottenute da ogni standard di riferimento e la loro concentrazione in ng/ml. Assorbanza relativa (%) = [assorbanza standard (o campione) / assorbanza zero standard] x 100 Usare le medie dei valori delle assorbanze relative per ogni campione per determinare dalla curva standard la corrispondente concentrazione della sostanza ricercata in ng/ml. Il programma MaxSignal ELISA in Excel è disponibile a richiesta per valutare i risultati del test. Contattare laboratorio@generon.it per ulteriori informazioni. L immagine seguente è una tipica curva standard dell Aflatossina M1. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0,00 0,01 0,10 1,00 Log [ Standard ] ng/ml [10] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
5 Test kit ELISA Aflatossine M1 Metodo Semi-Quantitativo Preparazione dei Reagenti IMPORTANTE: Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ampiente prima dell uso (1-2 ore a 20-25 C). Assicurarsi di avere letto la sezione Avvertenze e Precauzioni. Le soluzioni dovrebbero essere preparate subito prima del Test ELISA. Tutti i reagenti devono essere agitati vigorosamente prima dell uso. Preparare solo i volumi necessari per il numero di pozzetti che verranno utilizzati. Non rimettere i reagenti nella provetta/bottiglietta originale. È raccomandato l utilizzo di contenitori monouso quando si maneggiano i reagenti, per minimizzare il rischio di contaminazione. Preparazione di 1X Wash Solution: aggiungere 1 volume di 20X Wash Solution con 19 volumi di acqua distillata. Preparazione dello Standard di Aflatossina M1 (0,030 ng/ml): 1. Preparare 1X PBS, aggiungere 1 volume di 10X PBS a 9 volumi di acqua distillata. 2. Preparare 2 ml Soluzione standard di Aflatossina M1 [1 ng/ml] aggiungendo 20 µl di Aflatossina-M1 Standard [10 ng/ml] a 180 µl di 1X PBS. 3. Vortexare Aflatossina M1 Standard [1 ng/ml]. 4. Preparare 2 ml di Aflatossina M1 Standard [0,030 ng/ml] aggiungendo 60 µl di Aflatossina-M1 Standard [1 ng/ml] a 1,940 ml di 1X PBS. 5. Vortexare Aflatossina M1 Standard [0,030 ng/ml]. Protocollo Test ELISA Protocollo validato SOLO su campioni di latte e latte in polvere. Calcolare le strip che verranno usate e aliquotare i reagenti come nell esempio seguente: Component Volume per Reaction Aflatossina M1-HRP Coniugata 115 µl 1X Soluzione di Lavaggio 1 ml Stop Buffer 100 µl TMB Substrato 100 µl 1. Aggiungere 200 µl di Aflatossina M1 Standard (0,030 ng/ml) in duplicato in due pozzetti. 2. Aggiungere 200 µl di ogni campione in duplicato in diversi pozzetti. 3. Incubare la piastra per 5 minuti a 37 C. 4. Travasare attentamente o aspirare la soluzione dai pozzetti e scartare il liquido. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare delicatamente per asciugarla su pezzi di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro. 5. Aggiungere115 µl di Aflatossina M1-HRP coniugata in ogni pozzetto. 6. Incubare la piastra per 5 minuti a 37 C. 7. Travasare attentamente o aspirare la soluzione dai pozzetti e scartare il liquido. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare delicatamente per asciugarla su pezzi di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro. 8. Aggiungere 100 µl di substrato TMB. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Cronometrare la reazione facendo partire il timer subito dopo l aggiunta del substrato. Agitare la soluzione oscillando manulmente la piastra per 1 minuto durante l incubazione a [11] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
temperatura ambiente. Non rimettere il substrato nella confezione originale per evitare potenziali contaminazioni. Se il TMB substrato nella bottiglietta dovesse mostrare una qualunque colorazione, ciò è indicativo di un deterioramento e perciò la soluzione deve essere scartata. È consigliato coprire la micropiastra durante l incubazione. 9. Dopo l incubazione, aggiungere 100 µl di Stop Buffer per bloccare la reazione enzimatica. 10. Leggere le piastre il più presto possibile in seguito all aggiunta dello Stop Buffer su un lettore di micropiastre a lunghezza d onda di 450 nm. Prima della lettura, pulire il fondo della piastra con una salvietta per assicurarsi che né umidità né impronte digitali interferiscano con le letture. Calcolo dei risultati È possibile ottenere i risultati semi-quantitativi da una semplice comparazione tra il valore medio dell assorbanza del campione ignoto e il valore medio dell assorbanza dell Aflatossina M1 Standard [0.030 ng/ml]. Se (CampioneOD450nm)>(StdOD450nm) il campione ignoto contiene meno di 0,030 ng/ml (30 ppt) di Aflatossina M1. Se (CampioneOD450nm)<(StdOD450nm) il campione ignoto contiene più di 0,030 ng/ml (30 ppt) di Aflatossina M1. Si raccomanda di eseguire analisi ulteriori su campioni che mostrano una contaminazione >30 ppt utilizzando il Protocollo Standard (Vedere capitolo 3). [12] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
6 Risoluzione dei problemi Nessuno sviluppo del colore o nessun segnale con gli standard Possibili cause I reagenti sono stati usati nell ordine scorretto o è stato saltato un passaggio. Sono stati usati anticorpi sbagliati o anticorpi deteriorati. Il TMB Substrato è deteriorato. Azioni raccomandate Seguire attentamente il protocollo e ripetere il saggio. Assicurarsi che gli anticorpi utilizzati siano gli stessi inclusi nel kit. Tutti gli anticorpi sono kit e lotto specifici. Utilizzare un nuovo set di substrato BioO. Bassa lettura di Densità Ottica (OD) Possibili cause I reagenti erano scaduti o mescolati con un diverso numero di lotto. La soluzione di lavaggio NON è stata preparata correttamente. Sono stati eseguiti troppi cicli di lavaggio. I tempi di incubazione sono stati troppo corti. La temperatura del laboratorio era troppo bassa. I reagenti e le piastre erano troppo fredde. Il lettore era alla lunghezza d onda errata o era malfunzionante. Il kit ha subito stress termici eccessivi. Le piastre del saggio erano deteriorate. Azioni raccomandate Verificare le date di scadenza e il numero di lotto. Usare la soluzione di lavaggio per il kit e assicurarsi che sia preparata correttamente. Assicurarsi di eseguire il numero di lavaggi delle istruzioni nel protocollo. Cronometrare i tempi separatamente per ogni piastra per assicurare un accurato tempo d incubazione. Seguire il protocollo. Mantenere il laboratorio con temperature tra i 20 e i 25 C. Non utilizzare i saggi sotto correnti di aria condizionata o vicino a finestre fredde. Assicurarsi che piastre e i reagenti siano portati a temperatura ambiente. Mantenere i componenti del kit fuori dalla scatola per minimo 1 ora prima di iniziare il saggio. Assicurarsi che la lunghezza d onda sia 450 nm per il saggio e leggere la piastra nuovamente. Verificare la calibrazione del lettore e l allineamento della lampada. Tenere nota di quante volte il kit è stato estratto dal congelatore. Controllare se il kit è stato lasciato a temperature estreme troppo a lungo. Refrigerare sempre le piastre in contenitori chiusi con dessiccanti per mantenerle stabili. Prevenire la formazione della condensa lasciandole equilibrare a temperatura ambiente (20-25 C) mentre sono nella confezione. [13] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Alto rumore di fondo o alta Densità Ottica (OD) Possibili cause Nella soluzione di lavaggio è stata utilizzata acqua di scarsa qualità. Il TMB substrato era deteriorato. Ci sono stati insufficienti lavaggi o scarse performance di lavaggio. Lettore era malfunzionante o leggeva il bianco non correttamente. Ciò è altamente probabile se le letture delle OD erano alte e il colore non era intenso. La temperatura del laboratorio era troppo alta. I reagenti erano mischiati o preparati scorrettamente. Azioni raccomandate Se la qualità dell acqua è dubbia, provare sostituendo con una fonte alternativa di acqua distillata per preparare la soluzione. Assicurarsi che il substrato fosse incolore prima di essere aggiunto alla piastra. Eseguire il numero di lavaggi indicati sul protocollo. Assicurarsi che almeno 250 µl di Wash Buffer sia stata distribuita nei pozzetti per il lavaggio. Verificare le performance del lavapiastre (se automatico); riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Verificare le performance del lettore usando una piastra contenente un calibratore e controllando l allineamento della lampada. Verificare la procedura di lettura del bianco ed eventualmente rieseguirne la lettura. Mantenere la temperatura ambiente tra i 20 e i 25 C. Evitare l utilizzo del test nei pressi di fonti di calore o esposizione diretta al sole. Assicurarsi che siano stati usati i reagenti corretti, che le soluzioni di lavoro siano state preparate correttamente e che non si siano verificate contaminazioni. Alta variabilità Intra-piastra Possibili cause La pipetta multicanale non funzionava correttamente. È stato eseguito non correttamente il lavaggio o la macchina lavapiastre è malfunzionante. Sono stati cronometrati male i tempi quando sono stati aggiunti gli standard, i reagenti o i campioni alla piastra. Azioni raccomandate Verificare la calibrazione delle pipette e controllare che i puntali siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino e dispensino egual volumi. Controllare le performance della macchina lavapiastre. Controllare i componenti della macchina. Riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Assicurarsi che tutti i materiali siano pronti all uso. Usare una pipetta multicanale per aliquotare i reagenti su più pozzetti quando possibile. Non interrompersi mentre si aggiungono standard, reagenti e campioni. [14] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016
Alta variabilità Inter-piastra Possibili cause È stato eseguito non correttamente il lavaggio. È stato eseguito non correttamente il lavaggio. La pipetta multicanale non funzionava correttamente. Piastre, reagenti, standard e campioni erano a temperature diverse. I reagenti usati erano di lotti differenti o i kit avevano differente data di scadenza. Azioni raccomandate Cronometrare il tempo separatamente per ogni piastra per assicurarsi di un accurato tempo di incubazione. Assicurarsi di eseguire il numero di lavaggi indicati nel protocollo. Controllare i componenti della macchina lavapiastre. Riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Verificare la calibrazione della pipetta e controllare che i puntali siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino e dispensino egual volumi. Assicurarsi di lasciare sufficiente tempo alle piastre, reagenti, standard e campioni per raggiungere la temperatura ambiente (20 25 C). Volumi maggiori richiedono maggiore tempo per andare a temperatura. Se si usa un bagno d acqua per velocizzare il procedimento, assicurarsi che sia mantenuta a temperatura ambiente; non usare un bagno caldo per scaldare reagenti, campioni e standard. Etichettare attentamente ogni reagente per assicurarsi che i reagenti non vengano mescolati. Kit con diverse date di scadenza possono generare diversi range di lettura della densità ottica, tuttavia, i valori delle assorbanze relative possono essere comparati molto bene. In generale, un valore con meno di 0.6 sullo standard zero può indicare un certo grado di deterioramento dei reagenti. Uno o più punti della curva standard sono fuori dal Range Possibili cause Gli Standard sono stati aggiunti nell ordine scorretto o registrati in posizione sbagliata. Gli standard erano contaminati o mescolati con altri standard. È stato eseguito non correttamente il lavaggio o la macchina lavapiastre è malfunzionante. Sono stati cronometrati male i tempi quando sono stati aggiunti gli standard, i reagenti o i campioni alla piastra. La pipetta multicanale non funzionava correttamente. Azioni raccomandate Seguire il protocollo e rifare correre il saggio. Assicurarsi che gli standard siano aliquotati e registrati correttamente. Usare un nuovo set di standard. Aggiungere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. Eseguire correttamente i lavaggi. Controllare i componenti della macchina lavapiastre. Riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Assicurarsi che tutti i materiali siano pronti all uso. Aggiungere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. Usare una pipetta multicanale per aliquotare i reagenti su più pozzetti quando possibile. Verificare la calibrazione delle pipette e controllare che i puntali siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino e dispensino egual volumi. [15] Manuale utente - MaxSignal M1 ELISA Kit Rev. 2 1/04/2016