Anemie emolitiche autoimmuni
La diagnosi di anemia emolitica autoimmune si basa sulla rilevazione di anticorpi e/o proteine del complemento sui globuli rossi del paziente, ovvero sulla positività al test di Coombs diretto La fase iniziale del test va eseguita con siero antiglobuline ad ampio spettro contro IgG e complemento. Se il test risulta positivo si procede utilizzando sieri antiglobuline monospecifici per identificare la classe anticorpale coinvolta ed il tipo di proteina complementare eventualmente presente Normalmente anticorpi anti IgM ed anti IgA sono raramente ricercati Sono pertanto possibili tre diverse condizioni : Test di Coombs positivo per sole immunoglobuline per immunoglobuline + complemento per solo complemento
AEAI da anticorpi caldi Laboratorio : DAT+ solo IgG : 20% IgG + C' : 67% solo C' : 13% IAT + per presenza di IgG e/o Complemento La specificità dell'anticorpo è, nella maggior parte dei casi, difficilmente identificabile, spesso relativa ad antigeni del sistema Rh, che determina una reattività di panagglutinina Questo anticorpo reagisce con tutti i campioni di sangue nei test di compatibilità pretrasfusionale rendendo di fatto non trasfondibile il paziente Il titolo dell'anticorpo deve essere valutato per stabilire l'evoluzione del quadro clinico, un alto titolo indica che i globuli rossi sono tutti ricoperti di anticorpo (emolisi in atto) e che la sua sintesi non diminuisce La presenza di globuli rossi opsonizzati può creare difficoltà nella determinazione del gruppo
Sono presenti forme di AEAI da anticorpi caldi associate ad agglutinine IgM che sono attive tra 20 e 30 C con estensione fino a 37 C. In questi casi è tipicamente presente una autoagglutinazione. Sono anticorpi deboli di difficile identificazione con basso titolo, di solito < 64, che non vanno confusi con le IgM delle forme da anticorpi freddi La presenza degli autoanticorpi è rilevabile nel 90% dei pazienti
Tecniche di assorbimento, eluzione, titolazione La panagglutinina determina : mascheramento di eventuali alloanticorpi presenti nel siero dei pazienti la impossibilità di ottenere un cross - match che risulti sicuramente negativo Cosa fare: La riduzione del titolo dell' autoanticorpo presente nel siero (o la sua totale eliminazione) con assorbimento è la tecnica di laboratorio generalmente applicata La specificità dell'anticorpo, se determinabile, si ottiene solo con una analisi dell' eluato eseguito sui globuli rossi autologhi o su quelli usati per l'assorbimento
Assorbimento con globuli rossi autologhi Si toglie l'autoanticorpo per evidenziare la presenza di un eventuale alloanticorpo Occorre trattare le emazie del paziente con enzimi proteolitici (ficina o papaina) e/o agenti tiolitici (ZAPP) che dissociano le immunoglobuline dalla membrana eritrocitaria liberando i siti antigenici e favorendo il legame con l'anticorpo autologo Siero ed emazie pretrattate sono mescolati ed incubati a 37 C per almeno 30 minutiil siero assorbito viene separato per centrifugazione a 1000 g e, dopo un ulteriore assorbimento, viene esaminato con un test all'antiglobulina Il test deve contenere necessariamente un controllo autologo che deve risultare negativo a conferma della efficacia del'assorbimento. Se il test è negativo si può escludere la presenza di anticorpi immuni e il siero può essere utilizzato nelle prove di compatibilità
Attenzione. Il siero assorbito è privo di autoanticorpi, ma non il paziente Le prove crociate col siero assorbito ci dicono che i globuli rossi del donatore non hanno antigeni incompatibili per anticorpi immuni, non che sfuggiranno all'attacco degli autoanticorpi del paziente E' tuttavia possibile procedere con la terapia trasfusionale perchè l'avvenuto autoassorbimento indica una alta affinità dell'auto anticorpo per le proprie emazie e quindi una possibilità ridotta di un suo legame con i globuli rossi del donatore La terapia trasfusionale nei pazienti con AEAI è sempre una scelta prevalentemente clinica,non di laboratorio, ed è utilizzata solo secondariamente a sostegno della terapia immunosopressiva, che rimane quella di elezione
Assorbimento con globuli rossi allogenici Se il paziente è stato recentemente trasfuso, l'uso delle emazie autologhe è fortemente limitato dalla presenza di globuli rossi del donatore che potrebbero possedere antigeni specifici per eventuali alloanticorpi. Per ottenere il risultato precedente occorre suddividere il siero del paziente in varie aliquote per diverse procedure. I globuli rossi per l'assorbimento non devono contenere antigeni per i quali gli alloanticorpi sono clinicamente significativi : DCEce, K, Fy(a), Fy(b), Jk(a), Jk(b) I sieri sono assorbiti con la metodica precedente e sono successivamente analizzati con una normale ricerca anticorpi Es. paziente A+ con panagglutinina in cui si sospetti, sulla base degli score di reazione nel pannello di identificazione, la presenza di un anti K. La forte anemizzazione del paziente non consente di ottenere globuli rossi autologhi in quantità opportuna per un autoassorbimento Si procede con emazie di donatore. Quali scegliere? A+ K- o B+ K- (se si vogliono togliere anche le IgM naturali anti B)
Riassumendo, l'assorbimento serve per : Isolare singoli anticorpi da sieri con anticorpi multipli Rimuovere gli autoanticorpi per evidenziare eventuali alloanticorpi Definire le caratteristiche antigeniche di eritrociti attraverso il legame con anticorpi specifici presenti in un siero Definire la specificità di un anticorpo attraverso il suo assorbimento da parte del corrispondente antigene eritrocitario
Tecniche di eluizione La reazione antigene anticorpo è una reazione debole e reversibile legata al rapporto tra Ka e Kd. Ogni fattore chimico-fisico che modifichi tale equilibrio genera una dissociazione dell'immunocomplesso Agendo sul ph, modificando la temperatura,operando direttamente con mezzi chimici (etere, cloroformio) si altera la complementarietà strutturale ottenendo il distacco dell'anticorpo dall'antigene eritrocitario L'eluato così ottenuto (salina + ATC) viene esaminato come un qualunque siero con il test all'antiglobulina
Titolazione anticorpale La titolazione è un metodi semiquantitativo per deyterminare la concentrazione di un anticorpo in un siero o per confrontare l'espressione antigenica tra cellule diverse Di norma è utilizzata per: Valutare l' attività anticorpale in pazienti immunizzati per decidere eventuali interventi terapeutici (es. in donne gravide immunizzate per indagini invasive) caratterizzare anticorpi ad alto titolo e bassa affinità definire la specificità di un autoanticorpo La tecnica si basa sulle diluizioni al raddoppio del siero in esame con salina, ogni diluizione viene esaminata con test all' antiglobulina L' ultima diluizione ancora reattiva costituisce il titolo del siero
Laboratorio Autoagglutinazione a temperatura ambiente, aumenta a 4 C, si annulla a 37 C Non va confusa con l'autoagglutinazione a volte presente nelle AEAI da anticorpi caldi dovuta alla presenza di IgM attive a 37 C La sola autoagglutinazione non costituisce criterio diagnostico Test preliminare: siero paziente + g.r. Test in salina,20 C, 30' è positivo se sono presenti crioagglutinine, improbabile la loro presenza se il test è negativo
Coombs diretto: sugli eritrociti del paziente è presente solo complemento ( C3d,C4d) Coombs indiretto: dopo la ricerca anticorpi preliminare a T.A. si procede con un test in salina a 4 C a lunga incubazione (>2h) esaminando il siero con emazie test dello stesso gruppo del paziente. crioagglutinine Questa scelta è obbligata in quanto la specificità delle è contro gli antigeni dei sistemi I/i e H/h Procedura (es paziente A+) A1+ Siero (titolo) puro 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64... 1:4096 4+ 3+ 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ ng A2+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ ng ng 0+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ ng F0 +/- +/- ng ng ng ng ng ng FA ng ng ng ng ng ng ng ng Autologhi 2+ 2+ 2+ 1+ 1+ 1+ ng ng globuli rossi test
Interpretazione dei risultati L'anticorpo ha specificità anti I
Le crioagglutinine interferiscono con l'esecuzione di : Ricerca anticorpi irregolari Determinazione gruppo ematico Prove di compatibilità Vanno rimosse con semplici procedure: Lavaggio ripetuto delle emazie a 37 C (per la determinazione del gruppo) Autoadsorbimento del siero a 4 C Adsorbimento del siero con stromi eritrocitari (non idoneo per CM) Denaturazione delle IgM nel siero mediante agenti sulfidrilici (DTT ditiotreitolo) E' preferibile eseguire le prove di compatibilità utilizzando tutti i reattivi a 37 C
Emoglobinuria parossistica a frigore È la forma più rara di anemia emolitica autoimmune. In passato era tipicamente associata con la sifilide mentre attualmente tale associazione è rara' Generalmente I'emoglobinuria parossistica a frigore si manifesta come affezione acuta e transitoria secondaria ad una infezione virale soprattutto nei bambini Nei soggetti anziani si può presentare anche come una malattia cronica idiopatica
Nel siero è caratteristicamente presente un autoanticorpo IgG descritto come una emolisina bifasica, in quanto si lega a bassa temperatura agli eritrociti e provoca l'emolisi solo quando le emazie raggiungono i 37 C. Su questo fenomeno si basa il test di Donath Landsteiner. diagnostico per questa malattia Questo autoanticorpo possiede la caratteristica di sensibilizzare le emazie fissando il complemento, ma la sensibilizzazione non avviene "in vitro" a temperatura superiore a 15'C. Il test di Coombs diretto evidenzia sui globuli rossi esclusivamente proteine del complemento che possono essere eluite L'anticorpo ha specificità anti P