Facoltà di Ingegneria dell Informazione Laurea Specialistica e Magistrale in Ingegneria Informatica Facoltà di Ingegneria dei Sistemi Laurea Magistrale in Ingegneria Biomedica Dipartimento di Elettronica e Informazione Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare Marco Masseroli, PhD marco.masseroli@polimi.it
Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare Elementi di Genetica e Biologia Molecolare Marco Masseroli, PhD marco.masseroli@polimi.it 2
Genetica molecolare 3
Indice Genetica molecolare DNA e sua struttura RNA e sua struttura Genoma - dei virus - batterico (dei procarioti) - degli eucarioti Duplicazione informazione genetica Struttura dei geni Espressione informazione genetica Trascrizione Diversi tipi di RNA Codice genetico Traduzione Controllo espressione genetica 4
Genetica molecolare DNA e sua struttura DNA è macromolecola più grande nella cellula: è polimero di 4 diversi tipi di monomeri, i nucleotidi, formati da: 1 molecola di zucchero con 5 atomi di carbonio (il deossiribosio, da cui nome DeoxyriboNucleic Acid - DNA) a cui sono legati: - 1 gruppo fosfato (da molecola di acido fosforico - P) - 1 molecola contenete azoto (N) (1 delle 4 basi azotate A, C, G, T) P Z B 4 5 3 O Z P 2 1 zucchero gruppo fosfato nucleotide B base azotata 5
Genetica molecolare DNA e sua struttura Catena del DNA: lunga sequenza di nucleotidi uniti da legame tra l acido fosforico di un nucleotide e lo zucchero del nucleotide successivo ( ponte zucchero-acido fosforicozucchero) Tale legame è detto 3-5 fosfodiesterico, dove 3 e 5 indicano il numero d ordine degli atomi di carbonio dello zucchero impegnati nel legame 4 5 3 O Z P 2 1 zucchero gruppo fosfato P 3 P Z B B schema catena del DNA B base azotata 5 Z AATCAGCTACCAAGGCA 6
Genetica molecolare DNA e sua struttura http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture36.html 7
Genetica molecolare DNA e sua struttura http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture36.html 8
Genetica molecolare DNA e sua struttura Cytosine Guanine http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture36.html 9
Genetica molecolare DNA e sua struttura http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture36.html 10
Genetica molecolare DNA e sua struttura Nel 1953, a Cambridge UK, statunitense James Watson e inglese Francis Crick definirono esatta struttura spaziale del DNA, basandosi su due tipi di risultati sperimentali: 1. La composizione in basi del DNA 2. Spettri di diffrazione dai raggi X di cristalli di fibre pure di DNA 11
Genetica molecolare DNA e sua struttura 1. Nel 1945-1950 statunitense E. Chargaff trovò che in ogni organismo (regole di Chargaff): quantità di Adenina (A) = quantità di Timina (T) quantità di Citosina (C) = quantità di Guanina (G) ovvero: A / T = C / G = 1 anche se (A + T) / (C + G) [detto percentuale di CG] varia da organismo a organismo 12
Genetica molecolare DNA e sua struttura 2. In stessi anni, inglese Rosalind Franklin, in collaborazione con M. Wilkins, ottenne prime foto spettri di diffrazione dai raggi X di cristalli di fibre pure di DNA, che mostravano: DNA con struttura ad elica con 2 periodicità caratteristiche, a 0.34 µm e a 0.034 µm lungo asse molecolare principale 13
Genetica molecolare DNA e sua struttura Watson e Crick combinarono le informazioni di Chargaff e della Franklin costruendo modelli tridimensionali di DNA Modello maggiormente in accordo con dati sperimentali era la doppia elica A temperatura, acidità (ph) e umidità caratteristiche delle cellule viventi DNA si dispone spontaneamente secondo struttura con seguenti caratteristiche: 1. Doppia elica di due catene polinucleotidiche avvolte a spirale destrorsa una sull altra rispetto all asse molecolare principale 2. Basi nucleotidiche disposte all interno della doppia elica, perpendicolarmente all asse molecolare principale, e scheletro zucchero-fosfato all esterno 14
Genetica molecolare DNA e sua struttura 3. Basi nucleotidiche interagiscono tra loro con deboli legami idrogeno (H): A e T unite da 2 legami H C e G unite da 3 legami H (A-T e C-G sono dette coppie di basi complementari) 4. Legami H anche tra diverse volute dell elica consolidano struttura 15
Genetica molecolare DNA e sua struttura 5. Vi sono 10 coppie di basi (10 bp, base pair) ogni giro d elica; dato che le coppie sono distanziate di 0.034 µm, passo dell elica è di 0.34 µm (come da spettri raggi X); doppia elica ha diametro di 0.2 µm 6. Le due catene nucleotidiche sono antiparallele, ovvero con direzione opposta (una da 3 a 5, l altra da 5 a 3 ) 7. Doppia elica ha 2 solchi sulla superficie, uno maggiore e uno minore; In questi solchi avvengono interazioni con proteine coinvolte in replicazione DNA e trascrizione genica Video struttura DNA: http://www.youtube.com/watch?v=zghkhmoyc5i 16
Genetica molecolare DNA e sua struttura 17
Genetica molecolare DNA e sua struttura Doppia elica di Watson e Crick è detta forma B del DNA e si trova normalmente in cellule viventi (con molta acqua) Quando umidità è bassa, DNA assume struttura più larga e compatta (forma A) Vi sono anche altre forme di struttura di DNA, es. forma Z, con andamento a zig-zag dell ossatura zucchero-fosfato e più sottile e con avvolgimento sinistrorso 18
Genetica molecolare DNA e sua struttura Molecole di DNA sono molto lunghe: in ogni cellula umana vi è più di 1 m di DNA Essendo molto sottili e flessibili si avvolgono su se stesse occupando volume molto piccolo Fenomeno di ripiegamento DNA su se stesso è detto impacchettamento (packaging) o compattazione del DNA (video: http://www.youtube.com/watch? v=osti5pnihpa) 19
Genetica molecolare RNA e sua struttura Nelle cellule l RNA svolge ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine Strutturalmente l RNA rispetto a DNA: Formato da zucchero ribosio (anziché deossiribosio) Ha base azotata U (anziché T), che si appaia sempre con A (come T) Esiste sempre come catena singola, in cui le basi interagiscono tra loro formando strutture tridimensionali complicate, spesso non ancora ben note In alcuni esseri viventi privi di DNA (es. virus a RNA ), l RNA svolge ruolo fondamentale nella riproduzione dell individuo (es. virus del mosaico del tabacco - tmv) 20
Genetica molecolare RNA e sua struttura Esempi di Strutture di RNA 21
Genetica molecolare RNA e sua struttura Nelle cellule vi sono diversi tipi di RNA, con ruoli diversi: messanger RNA (mrna) ribosomial RNA (rrna) trasfer RNA (trna), circa 75-95 nucleotidi small nuclear RNA (snrna) small interfering RNAs (sirna), di 20-25 nucleotidi micro RNA (mirna), di 21-23 nucleotidi long noncoding RNAs (long ncrnas), >200 nucleotidi antisense RNAs mrna, rrna e trna svolgono ruoli fondamentali diversi nella sintesi proteica; gli altri RNA nella sua regolazione 22
Genetica molecolare Genoma Genoma: materiale genetico di un organismo Indica generalmente il DNA contenuto in ogni cellula (caratteristico della specie e organizzato in n cromosomi) Spesso per estensione il termine si riferisce anche all RNA e alle proteine (che derivano dal DNA) Dimensione e organizzazione genoma variano nelle specie Cellule batteriche (procarioti) hanno genoma aploide (n) Maggior parte cellule eucariote hanno genoma diploide (2n), con numero diverso di cromosomi nelle varie speci Vediamo organizzazione genoma in virus, batteri e cellule superiori 23
Genetica molecolare Virus e loro genoma Virus sono le più semplici forme di vita conosciute Non sono cellule autonome, ma parassiti cellulari obbligati: possono riprodursi solo all interno di altra cellula (sfruttandone sistemi enzimatici) Genoma virale: Composto da 1 molecola di acido nucleico (DNA o RNA) Racchiuso in involucro proteico (capside) di varie forme (icosaedrica, elicoidale o filamentosa, testa-coda) 24
Genetica molecolare Virus e loro genoma Esistono molti virus, divisi in 3 classi: Virus dei batteri, o batteriofagi o fagi Virus delle piante Virus degli animali Batteriofagi: capside con testa icosaedrica, contenente materiale genetico (DNA o RNA), con attaccato cilindro cavo (coda) alla cui base vi sono strutture filamentose (spikes) che permettono attacco di virus a parete cellula batterica Una volta legato, il virus inietta proprio materiale genico, dalla testa attraverso la coda, dentro la cellula, dove si riproduce (video: http://www.youtube.com/watch?v=gu8xeqi7yts) 25
Genetica molecolare Virus e loro genoma Struttura di un batteriofago e fasi della sua riproduzione 26
Genetica molecolare Virus e loro genoma Fagi che attaccano batterio Escherichia coli visti al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) in falsi colori Alcuni stanno iniettando il loro materiale genetico (verde) nella cellula 27
Genetica molecolare Virus e loro genoma Virus cellule eucariote: molto più numerosi, sia per animali che per piante (per piante meno importanti di macro-parassiti) Capsidi principalmente icosaedrici o filamentosi (a volte rivestiti da membrana lipidica derivata da cellula infettata a seguito di fuoriuscita delle particelle virali) Materiale genico (DNA o RNA) con grande varietà di struttura (singola o doppia elica, lineare o circolare, segmentato o intero) Maggior parte virus piante è a RNA 28
Genetica molecolare Virus e loro genoma Esocitosi di un nuovo virus da una cellula infetta. Virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) (rossi) fuoriescono da un linfocita infetto: fotografia al microscopio elettronico a trasmissione, in falsi colori 29
Genetica molecolare Virus e loro genoma Molti virus possono integrare proprio genoma in quello di cellula ospite, determinando a volte drastici cambiamenti (morfologia e fisiologia) sulla vita della cellula infettata Trasformazione cellulare: insieme dei fenomeni derivanti dall integrazione di virus nel DNA della cellula ospite Microfotografia ottica di tumore midollo osseo (mieloma) Cellule tumorali (in viola) hanno rimpiazzato maggior parte del tessuto sano; ciò che resta (cellule rosate) sta morendo 30
Genetica molecolare Virus e loro genoma Retrovirus (es. HIV [Human Immunodeficiency Virus]) Contengono 1 o 2 molecole di RNA Grazie a enzima trascrittasi inversa, RNA convertito in DNA a filamento singolo (forma intermedia) trasformato in doppia elica da enzima DNA polimerasi (attivo in nucleo cellulare); così trasformato genoma virus si può integrare in genoma della cellula ospite e riprodurre 31
Genetica molecolare Genoma batterico Cellule batteriche (procarioti) non hanno vero e proprio nucleo, ma struttura compatta (nucleoide) formato da 1 molecola di DNA (di solito circolare) lungo circa 1 mm (cellula batterica lunga circa 1 µm!!) Struttura esatta nucleoide batterico non nota, ma deve avere impacchettamento con numerosi ripiegamenti su se stesso (supercoiling) Lungo DNA batterico vi sono 2 000-2 500 geni in sequenza continua (senza interruzioni al loro interno) 32
Genetica molecolare Genoma batterico In molti batteri, oltre a genoma vero e proprio, vi sono anche piccole molecole circolari di DNA: i plasmidi: Conferiscono caratteristiche vantaggiose alla cellula Possono integrarsi in genoma cellulare e distaccarsene portando con se un assortimento variabile di geni Vari tipi di plasmidi, tra cui: Plasmide R (R = resistenza): determinano resistenza di cellule ai cationi di metalli pesanti o a molti antibiotici -> difficoltà trattamento infezioni batteriche - Se vi è plasmide R, in ambienti ricchi di antibiotico, si attivano geni resistenza (che vengono disattivati in ambiente povero di antibiotici per risparmiare energia) 33
Genetica molecolare Genoma batterico Plasmidi degradativi: permettono al batterio di metabolizzare composti chimici stabili (residui petrolio, pesticidi, ) -> impiego in recupero zone inquinate Fattore di fertilità (o fattore F): cellule che lo contengono sono dette maschi (F + ), le altre femmine (F - ) - Tramite pilus sessuale (struttura cilindrica in parete cellulare), cellule F + possono trasferire a cellule F - copia fattore F (coniugazione), trasformando F - in F + - Coniugazione permette trasferimento orizzontale di materiale genico 34
Genetica molecolare Genoma batterico 35
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Nucleo cellule eucariote molto più complesso di procariote Contiene varie molecole lineari di DNA, ognuna contenuta in un cromosoma Numero cromosomi non proporzionale a grandezza genoma: es. lievito di birra (il fungo saccharomyces cerevisiae) ha genoma di circa 20.000 Kb (kilobasi) suddiviso in 16 cromosomi, DNA umano ha 3.000.000 Kb ed è suddiviso in 23 cromosomi Cromosomi costituiti da cromatina, formata 50% da DNA, 50% da proteine e piccola parte di RNA Proteine più strettamente associate a DNA sono gli istoni (H1, H2A, H2B, H3, H4) 36
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Cromatina ha struttura simile a collana: filamento centrale con particelle sferiche (nucleosomi) di diametro circa 10 µm Ogni nucleosoma dista dal successivo per un tratto di DNA di circa 50-70 bp (linker) Avvolgimento DNA su nucleosoma spiega (in parte) come DNA sia impacchettato nei cromosomi 37
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Durante particolare fase della divisione cellulare (metafase) i cromosomi assumono forma a X, con 2 elementi lineari (cromatidi) uniti in punto detto centromero, che divide ogni cromatide in 2 bracci p (braccio corto) e q (braccio lungo) Posizione relativa centromero, lunghezza di cromatidi e dimensioni cromosoma identificano clinicamente i diversi cromosomi (che costituiscono cariotipo dell organismo) Ad estremità di cromatidi vi sono i telomeri (dal greco, punta fine ) 38
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti 39
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Cariotipo umano maschile Cariotipo umano femminile 40
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Con colorazioni artificiali, zone del cromosoma ricche di basi A e T si tingono di scuro, zone con abbondanza di G e C restano chiare, generando assetto "a striscie (bande) Ogni banda ha nomenclatura (es. 6p21.3) che indica sua posizione, come su una mappa, specificando: cromosoma braccio regione banda sottobanda 41
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Es. 6p21.3 indica: 6: numero del cromosoma (cromosoma 6) p: braccio più corto del cromosoma 2: gruppo di bande (regione) visibile sul braccio a partire dal centromero 1: banda all'interno del gruppo, contando dal centromero verso il telomero 3: sottobanda, una banda sottile visibile all'interno di banda più spessa, contata a partire dal centromero Ovvero, posizione 6p21.3 indica la terza sottobanda della prima banda osservabile sul secondo gruppo di bande localizzato sul braccio corto del cromosoma 6 http://homepages.uel.ac.uk/v.k.sieber/human.htm 42
Genetica molecolare Genoma degli eucarioti Non tutto materiale genetico cellula eucariota è in nucleo Piccola frazione di DNA circolare si trova in organelli cellulari: i cloroplasti (in cellule vegetali, deputati a fotosintesi) e i mitocondri (producono energia chimica per la cellula) Geni extranucleari di cloroplasti e mitocondri, essendo nel citoplasma sono trasmessi alla prole solo dalla cellula uovo (che ha molto più citoplasma dello spermatozoo) -> eredità materna, non mendeliana 43
Genetica molecolare Duplicazione genica Per garantire la trasmissione dell informazione genetica da una generazione all altra, prima di duplicazione cellulare il DNA viene copiato (duplicazione o replicazione del DNA) Processo identico in procarioti ed eucarioti Molecola DNA si replica secondo modello semiconservativo: Ogni molecola figlia ha 1 filamento DNA molecola madre e 1 filamento di nuova sintesi 44
Genetica molecolare Duplicazione genica Modello di duplicazione semiconservativa prevede: Apertura a cerniera della doppia elica Esposizione singole basi sui due filamenti che agiscono come stampo Appaiamento di basi di nucleotidi liberi nella cellula con quelle complementari di filamenti stampo (legami H) Nucleotidi di basi appaiate si legano uno all altro a formare nuovo filamento Alla fine, 2 doppie eliche, ognuna con: 1 elica parentale 1 elica di nuova sintesi 45
Genetica molecolare Duplicazione genica Zona apertura doppia elica e sintesi nuovo filamento è detta forca replicativa (per sua forma) 46
Genetica molecolare Duplicazione genica Duplicazione non contemporanea su tutta lunga molecola DNA, ma solo in una zona alla volta, a partire da posizione prestabilita (origine della duplicazione), secondo specifica successione: 1. Apertura localizzata doppia elica ad opera di enzimi specifici 2. Copiatura tramite appaiamento fra basi e polimerizzazione nucleotidi grazie a enzima DNA polimerasi (III e I) in direzione da 5 a 3 su entrambi i filamenti di DNA 47
Genetica molecolare Duplicazione genica Su filamento orientato da 5 a 3 (leading strand) copiatura in modo continuo Su filamento orientato da 3 a 5 (lagging strand) copiatura da 5 a 3 deve avvenire a tratti (okasaki fragments) che sono poi uniti uno all altro da enzima DNA ligase 3. Richiusura doppia elica per opera di numerosi altri enzimi specifici Video DNA replication: http://www.youtube.com/watch?v=tev62zrm2p0 48
Genetica molecolare Struttura geni Sequenza di 3 basi (tripletta) = codone In procarioti: gene 5 upstream downstream 3 promoter (regulatory nucleotide sequence) start codon stop codon 5 In eucarioti: upstream open reading frame (ORF) introns Promoter & transcription exons factor binding sites start codon (codifying (regulatory nucleotide sequences) nucleotide sequences) downstream stop codon 3 49
Genetica molecolare Struttura geni Genoma umano contiene circa 3 miliardi di basi (3.000 Mb), ma solo 25.000-30.000 geni Regione codificante ha circa 90 Mb (solo 3% del genoma) Più del 50% del genoma sono sequenze ripetute: Tandem repeats (10-15% DNA, da 1 a migliaia di bp): le ripetizioni sono adiacenti (es. ATTCGATTCGATTCG) Interspersed repeats (35-40% DNA, da 100 a 10 000 bp): le ripetizioni sono sparse lungo tutto il DNA Molte sequenze ripetute sono diverse nei diversi individui 50
Genetica molecolare Espressione genica Termine espressione genica [Crick 1958] indica processo biologico con cui informazione genetica in un gene è trasferita da DNA a RNA a proteina (principio centrale della Biologia Molecolare) Informazione è trasferita solo unidirezionalmente: Da DNA a RNA: trascrizione Da RNA trascritto a proteina: traduzione Sempre vero anche se retrovirus possono trasferire informazione da RNA a DNA 51
Genetica molecolare Trascrizione In trascrizione, informazione in DNA guida sintesi molecola RNA da 5 a 3 Solo 1 elica DNA usata per sintesi di un RNA (elica stampo) Molecola RNA sintetizzata ha stessa sequenza di tratto di altro filamento DNA (elica codificante), con però nucleotidi con base U (uracile) al posto di nucleotidi con base T (timina) Elica stampo e codificante non sono le stesse per tutti RNA Sintesi è catalizzata da enzima RNA polimerasi 52
Genetica molecolare Trascrizione RNA polimerasi è diversa in procarioti ed eucarioti In procarioti RNA polimerasi: Formata da 5 subunità (2 α = α 2 ; 1 β; 1 β ; e 1 σ) Trascrive tutte classi di RNA della cellula (mrna, rrna, trna, ) In procarioti, in trascrizione vi sono 3 fasi distinte: 1. Inizio trascrizione: - enzima RNA polimerasi si lega (con sua subunità σ) a promotore del gene - si distacca subunità σ e inizia trascrizione 53
Genetica molecolare Trascrizione 2. Polimerizzazione polinucleotide RNA (allungamento): - enzima continua sintesi RNA fino a raggiungere zona di stop del gene (terminatore) 3. Distacco dell RNA prodotto e termine trascrizione: - enzima si dissocia da DNA e da RNA che resta libero (video: http://www.youtube.com /watch?v=tocc6zu8d9a) 54
Genetica molecolare Trascrizione In eucarioti trascrizione è processo più complesso: 3 diversi tipi di RNA polimerase (RNA polimerase I, RNA polimerase II, RNA polimerase III) Ogni tipo riconosce e trascrive un set di geni diverso (geni per mrna, geni per rrna, geni per trna, ) 55
Genetica molecolare Trascrizione Servono anche molte altre proteine (fattori trascrizionali), specifiche per ogni polimerase, che posizionandosi in zone opportune del DNA (siti di legame di fattori di trascrizione), quando queste sono tridimensionalmente accessibili, favoriscono attacco RNA polimerasi specifica e trascrizione gene (video: http://www.youtube.com/watch?v=wsofh466lqk) 56
Genetica molecolare Trascrizione RNA polimerase sintetizza RNA in modo continuo (non può saltare una parte di catena di DNA stampo) In eucarioti geni (formati da introni ed esoni) sono trascritti per intero, producendo un trascritto primario (RNA precursore o pre-rna) Complessi processi molecolari (splicing), tipici degli eucarioti, eliminano da trascritto primario sequenze RNA di introni, producendo RNA maturo, che attraverso membrana del nucleo migra al citoplasma dove è tradotto (video: http://www.youtube.com/watch?v=fvuawbgw_pq) 57
Genetica molecolare Trascrizione Si possono avere splicing diversi (Splicing alternativo) exons (codifying nucleotide sequences) introns transcription splicing 1 splicing 2 Gene (DNA) Transcript (mrna) Alternative splicings splicing 3 1 gene => more than 1 transcript 58
Genetica molecolare Trascrizione In gene con alternative splicing, maggior parte degli esoni è sempre inclusa nell mrna finale Si possono avere 4 tipi diversi di eventi di splicing alternativo, che generano diversi trascritti finali: esoni cassetta: intero esone viene trascritto solo in alcuni casi Isoforme di introni/esoni: i confini di introni e/o esoni possono essere diversi, con troncamento/estensione ritenzione di introni: introni possono essere contenuti nel trascritto finale esoni mutuamente esclusivi: esoni diversi possono essere inclusi in trascritti finali diversi 59
Genetica molecolare Trascrizione Eventi di splicing alternativo Cassette exon Intron/exon isoform Intron retention normal alternative normal alternative 1 alternative 2 normal alternative Mutually exclusive exons normal alternative 60
Genetica molecolare Trascrizione Splicing è processo non ancora ben noto In alcuni casi, complessi molecolari formati da piccole molecole di RNA e proteine (SNRNP Small Nuclear RiboNucleoProtein) tagliano: - prima ad estremità 5 di introne in corrispondenza di dinucleotide GU - poi ad estremità 3 ove vi è dinucleotide AG Poi si ha riunione esoni confinanti con introne eliminato Vi sono introni anche in geni non per mrna (es. per rrna) che seguono regola GU-AG senza usare SNRNP; eliminano da soli introni (autosplicing); tali RNA sono detti riboenzimi 61
Genetica molecolare Trascrizione Dopo lo splicing, processo di trasformazione di mrna primario in mrna maturo viene completato stabilizzando mrna (formato da sole parti corrispondenti agli esoni) aggiungendovi: - all estremità iniziale un cappello di 7 Metil Guanina - all estremità finale una coda di Adenine (poli A tail) In questa fase possono avvenire complessi fenomeni che portano a degradazione di mrna impedendone successiva traduzione e quindi silenziando l espressione del gene mrna maturo esce dal nucleo, attraverso la membrana nucleare, e si trasferisce nel citoplasma, dove avviene la sua traduzione 62
Genetica molecolare Diversi tipi di RNA RNA ribosomiale (rrna): Componenti strutturali e funzionali dei ribosomi, organelli cellulari molto grandi e di forma ovoidale (in eucarioti e procarioti) in cui avviene sintesi proteica RNA di trasferimento (trna): Piccole molecole di acido nucleico (75-95 nucleotidi) Funzione di trasporto degli aminoacidi (che verranno usati nella sintesi proteica) verso le molecole di mrna legate ai ribosomi 63
Genetica molecolare Diversi tipi di RNA trna ha struttura a trifoglio, con tratti appaiati in doppia elica alternati a tratti senza appaiamento di basi (anse) - Braccio accettore, (con estremità 3 ) ove si attacca particolare aminoacido - Zona dell anticodone, formata da sequenza di 3 basi complementare a codone mrna da tradurre, che durante traduzione si appaia a tale codone 64
Genetica molecolare Diversi tipi di RNA RNA messaggero (mrna): mrna prodotti durante trascrizione, stabiliscono la sequenza di aminoacidi di proteina che codificano Molecole intermedie tra geni e proteine In procarioti, mrna tradotti subito dopo essere trascritti In eucarioti, subiscono varie modificazioni, tra cui lo splicing (in inglese, tagliare e cucire) prima di essere tradotti rrna, trna e mrna prodotti in trascrizione partecipano tutti a traduzione 65
Genetica molecolare Codice genetico Codice genetico: insieme di regole che definiscono come informazione in sequenza di nucleotidi di mrna (scritta con le 4 basi azotate A, G, C, U) è tradotta in sequenza aminoacidica di proteina codificata (scritta con 20 aminoacidi) E universale : vale per quasi tutte le cellule (tranne per geni di mitocondri di alcuni organismi) Scoperto nel 1964 con test che dimostra che ribosoma si attacca a mrna solo se molecola mrna ha almeno 3 basi 4 basi nucleotidiche -> 4 3 = 64 possibili triplette (codoni) In 1966 si da ad ogni codone una funzione di codifica: Inserimento specifico aminoacido Inizio o fine messaggio 66
Genetica molecolare Codice genetico * + trp * + 67
Genetica molecolare Codice genetico Caratteristiche codice genetico: Ciascun aminoacido è codificato da tripletta di basi Triplette sono lette (cfr. open reading frame - ORF) una di seguito all altra, senza interruzioni Ogni tripletta può codificare solo uno dei 20 aminoacidi - Quasi tutti aminoacidi codificati da più di 1 tripletta Alcune triplette strumentali : AUG codifica Met (unico codone) e indica quasi sempre inizio messaggio (tripletta di start ) UAA, UAG, UGA (triplette di stop ) non codificano alcun aminoacido, ma fine di messaggio (gene) 68
Genetica molecolare Codice genetico Codice genetico basato su triplette Splicing e soprattutto splicing alternativo può far variare la lettura di triplette all interno di trama aperta di lettura (ORF) In stesso spazio si hanno diverse codifiche contemporanee (compressione della codifica) Alcuni trascritti alternativi sono tessuto-specifici, ovvero sono espressi solo in un tipo specifico di cellula (es. muscolare, o nervosa, o ) Meccanismi di codice genetico e splicing alternativo permettono codificare e produrre molte proteine (funzioni) diverse a partire dallo stesso DNA! Principale causa errore stima 100 K geni anziché 25-30 K 69
Genetica molecolare Traduzione Traduzione è processo complesso che coinvolge molti componenti cellulari, tra cui ribosomi (rrna), mrna, trna I trna (adattatori) sono congiunzione tra nucleotidi di mrna e aminoacidi di proteina: Tratto anticodone si lega a codone (es. UUU) su mrna che codifica per specifico aminoacido (Phe) In estremità 3 di trna si lega covalentemente e specificamente solo quell aminoacido (Phe) 70
Genetica molecolare Traduzione Traduzione uguale in procarioti ed eucarioti; ha 3 fasi (vedi video: http://www.youtube.com/watch?v=5bledd-pstq): 1. Inizio: - Ribosoma si attacca a mrna in corrispondenza di tripletta di inizio (AUG) - Riconoscimento di tripletta AUG di mrna da parte di tripletta complementare del trna specifico (anticodone) - Attacco di trna che porta aminoacido corrispondente a tripletta AUG (Met) 71
Genetica molecolare Traduzione 2. Sintesi: - Processo continua - Ribosoma si sposta lungo mrna - 1 sola tripletta per volta disponibile per attacco con trna specifico - Aminoacidi portati da trna si trovano vicini - Quando ribosoma si sposta, si ha formazione legame peptidico tra ultimo aminoacido trasportato da trna e aminoacido precedentemente trasportato (ultimo di catena peptidica che si sta formando) - Spostandosi ribosoma, catena proteica si allunga 72
Genetica molecolare Traduzione 3. Termine: - Quando ribosoma arriva in corrispondenza di tripletta di stop (UAA, UAG, UGA): si distacca da mrna libera catena proteica 73
Genetica molecolare Traduzione Ogni ribosoma costruisce 1 sola proteina per volta In batteri (procarioti), che necessitano sintesi di molte copie stessa proteina in breve tempo (alcuni minuti): Più ribosomi (poliribosomi) traducono in successione contemporaneamente stesso mrna (spostandosi uno di seguito all altro in stessa direzione di sintesi) Ribosomi possono iniziare a tradurre mrna prima ancora che sia completata sua sintesi (dato che non vi sono fenomeni di splicing e non vi è vero e proprio nucleo) - in batteri trascrizione e traduzione sono accoppiate 74
Genetica molecolare Traduzione Poliribosomi e accoppiamento di trascrizione e traduzione 75
Genetica molecolare Riassunto dogma centrale Organism Cells DNA (genetic code) Chromosomes (kariotype) Nucleotides (A,T,C,G) trnas Ribosomes (rrna) Amino acids (ALA, ARG, ASN, ASP, CYS, GLN, GLU, GLY, HIS, ILE, LEU, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, TRP, TYR, VAL) Genes (transcription) mrnas (translation) Proteins GENOME TRANSCRIPTOME PROTEOME 76
Genetica molecolare Riassunto dogma centrale open reading frame (ORF) 5 3 promoter & transcription factor binding sites (regulation nucleotide sequence) transcription Gene (DNA) Transcripts (mrna) translation Proteins Functional effect 77
Genetica molecolare Riassunto dogma centrale Sintesi proteica Video riassuntivo: http://www.youtube.com/watch?v=4pkjf7oumyo 78
Genetica molecolare Controllo espressione geni Geni di cellula codificano un pool di informazione biologica Non tutti geni sempre necessari alla vita di cellula Solo geni costitutivi (codificanti enzimi metabolismo basale necessari per la vita della cellula) sono sempre espressi Altri geni espressi quando serve Espressione geni è regolata da necessità cellula: condizioni ambiente e funzioni da svolgere, es.: Batterio Escherichia coli (E. coli), che si trova in intestino umano e ricava energia da vari zuccheri), se disponibile glucosio (facilmente utilizzabile) regola suoi geni per produrre solo enzimi per il glucosio, spegnendo geni codificanti enzimi per altri tipi di zuccheri 79
Genetica molecolare Controllo espressione geni In cellule vegetali, attivazione geni della fotosintesi in risposta alla luce solare 80
Genetica molecolare Controllo espressione geni In organismi pluricellulari: L ambiente di una cellula è l organismo stesso: singole cellule rispondono a stimoli (sostanze, es. ormoni) prodotte da altre cellule dell organismo Vi è anche meccanismo regolazione differenziale che porta, a partire da una stessa cellula, ad avere diverse cellule specializzate (tutte con stesso DNA) - In uomo, 250 tipi di cellule con diversa morfologia e funzione (es. linfociti, miociti, ) - Diversità stabilita geneticamente molto presto in sviluppo zigote (non reversibile ); solo cellule staminali possono differenziarsi in cellule specializzate 81
Genetica molecolare Controllo espressione geni Regolazione genica nei batteri Conoscenze derivano da studi di francesi François Jacob e Jaques Monod (1960-64) su uso lattosio in Escherichia coli Premio Nobel in 1965 per modello regolazione proposto 82
Genetica molecolare Controllo espressione geni Lattosio è disaccaride (zucchero di 2 monomeri, glucosio e galattosio) che per essere utilizzato deve entrare in cellula ed essere scisso nelle 2 molecole componenti Scissione lattosio realizzata da 3 enzimi codificati da 3 geni: lacz -> β-galatosidasi lacy -> lattosio-permeasi laca -> lattosio-transacetilasi In assenza lattosio, in cellula 5 molecole ciascun enzima Se lattosio unica fonte energia, sintesi enzimi rapidamente stimolata (enzimi inducibili): in pochi minuti 5.000 molecole 83
Genetica molecolare Controllo espressione geni Geni lacz, lacy e laca che determinano struttura dei 3 enzimi (geni strutturali) sono consecutivi su cromosoma batterico e trascritti in stesso mrna A monte dei 3 geni vi è gene lacl che regola (down) i 3 geni: sua eliminazione porta a sintesi continua dei 3 enzimi lacl codifica proteina (repressore) che si lega a zona sul cromosoma, detta operatore (o), tra promotore (p) dei 3 geni e primo di tali geni (lacz) L insieme di o, p, lacz, lacy e laca è detto operone lac (operone = gruppo di geni sotto controllo comune) 84
Genetica molecolare Controllo espressione geni Meccanismo regolazione operone lattosio In assenza di lattosio, repressore legato a operatore impedisce a RNA polimerasi di trascrivere i 3 geni strutturali 85
Genetica molecolare Controllo espressione geni Se lattosio è presente, si lega a repressore, ne cambia la conformazione 3D impedendogli di restare legato a operatore Repressore si stacca da DNA permettendo trascrizione geni di operone (lacz, lacy e laca) e sintesi dei 3 enzimi per scissione lattosio Quando lattosio è completamente consumato, repressore si riattacca a operatore e sintesi 3 enzimi si interrompe 86
Genetica molecolare Controllo espressione geni Video su funzionamento operone lac: http://www.youtube.com/watch?v=obwtxdi1zvk&nr=1 http://www.youtube.com/watch?v=aetuaee0c-i 87
Genetica molecolare Controllo espressione geni Regolazione genica in organismi superiori Meccanismi fondamentali uguali a quelli in batteri, ma più complessità di regolazione Espressione gene regolata da proteine (fattori di trascrizione) che legano siti DNA a monte di gene (Transcription Factor Binding Sites) e capaci di favorire o bloccare legame RNA polimerasi a promotore gene Esempio complessità regolazione è la regolazione di proteina (metallotioneina) che protegge cellule da effetti tossici metalli liberi in ambiente (es. cadmio) Piccole quantità metallotioneina sempre presenti in cellula Incremento sua sintesi indotto da presenza metalli pesanti 88
Genetica molecolare Controllo espressione geni Regolazione di metallotioneina Gene di metallotioneina è trascritto da RNA polimerasi II Molti tratti DNA a monte gene coinvolti in sua espressione: Sito di attacco polimerasi Sequenze (potenziatori, o enhancers) che agiscono favorendo trascrizione gene - Forse controllano espressione tessuto-specifica gene Oltre a zone con influenza continuativa, altre zone regolano in risposta a stimoli specifici (da interno o esterno cellula) Per metallotioneina tali zone (elementi di risposta ai metalli) modulano trascrizione in base a concentrazione metalli 89
Genetica molecolare Controllo espressione geni Con concentrazione elevata di metalli tali siti DNA occupati da proteine regolatrici (fattori di trascrizione) che attivano RNA polimerasi II: Gene è acceso e molta metallotioneina è sintetizzata Quando metallotioneina ha ridotto concentrazione metalli: Proteine regolatrici si staccano da DNA, gene si spegne Fattori di trascrizione hanno ruolo chiave in regolazione: Hanno struttura (o parte di struttura) che permette loro di entrare in solchi DNA e interagire con basi nucletidiche (DNA binding proteins) - Loro strutture più comuni sono il motivo elica-giroelica e lo zinc-finger 90
Genetica molecolare Controllo espressione geni zinc-finger elica-giro-elica zinc-finger video: http://www.youtube.com/watch?v=grl_rdb30gy 91