La preservazione della fertilità femminile: aspetti tecnici G. Cafueri, L. Gianaroli, A.P. Ferraretti, M.C. Magli S.I.S.Me.R. - Unità di Medicina della Riproduzione - Bologna www.iiarg.com www.sismer.it
La preservazione della fertilità femminile: Recente sviluppo di tecniche atte a preservare la fertilità femminile in pazienti oncologiche con lo scopo di preservare i propri gameti per futuri tentativi di concepimento. Valida e recente alternativa per il trattamento dell infertilità età-dipendente o associata a fattori quali ridotta riserva ovarica e menopausa precoce.
Crioconservazione di embrioni Crioconservazione di ovociti Crioconservazione di tessuto ovarico Jeruss JS, Woodruff TK, Preservation of fertility in patients with cancer, N Engl J Med, 2009; 360: 902-11
Crioconservazione di embrioni metodo di comprovata efficacia richiede stimolazione ovarica per il prelievo di ovociti maturi e la successiva fertilizzazione necessità di un partner/ donatore problemi etici
Crioconservazione di ovociti tecnica in continuo sviluppo ovociti più sensibili al congelamento più di 200 bimbi nati da ovociti criconservati non necessario partner richiesta iperstimolazione ovarica
Crioconservazione di ovociti Il principale fattore che può inficiare la riuscita della crioconservazione degli ovociti è la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulare Incremento del processo di disidratazione cellulare influenzato da: presenza di crioprotettori all interno delle soluzioni di congelamento velocità di congelamento e scongelamento
Tipologie di Crioprotettori Penetranti (pm< 400) Non penetranti (pm> 1000) DMSO (dimetilsolfossido) glicerolo PROH (1,2 propanediolo) glicole etilenico zuccheri : saccarosio,fruttosio, glucosio, destrosio amido lipoproteine PVP (polivinilpirrolidone)
Crioprotettori penetranti Abbassano il punto di congelamento della soluzione Prevengono l esposizione dell ovocita alle alte concentrazioni di elettroliti intra ed extra-cellulari(si legano agli elettroliti e sostituiscono parzialmente l acqua) Interagiscono con le modificazioni di membrana Il loro ingresso all interno della cellula per osmosi causa una più veloce fuoriuscita dell acqua.
Crioprotettori non penetranti Molecole di grandi dimensioni che non penetrano la membrana Esplicano la loro azione aumentando la concentrazione di soluti extracellulare, creando un gradiente osmotico che spinge l acqua a fuoriuscire dalla cellula Favoriscono la disidratazione cellulare precedente al congelamento
Crioprotettori non penetranti La concentrazione del crioprotettore non permeante è fondamentale in quanto determina la velocità di disidratazione della cellula: più alta è la concentrazione più velocemente l acqua lascia il citoplasma per ristabilire l equilibrio osmotico del mezzo extracellulare
L azione protettiva del crioprotettore dipende da il tempo ottimale di esposizione dell ovocita al crioprotettore (abbastanza lungo da permettere una sufficiente disidratazione della cellula ma non troppo dal momento che si può alterare il ph intracellulare) dalla temperatura alla quale avviene l esposizione (la cellula è esposta inizialmente a basse concentrazioni di crioprotettore a T ambiente in modo da creare il giusto gradiente di concentrazione che da inizio alla deidratazione e ad un ingresso più lento del crioprotettore stesso)
Criopreservazione di ovociti possibili danni Cytoplasmic and Cytoskeletron damage Zona pellucida hardening Oocyte ageing Membrane permeability Meiotic spindle depolymerization Polar body degeneration/fusion Impact on oocyte physiology
Crioconservazione di ovociti Le metodiche utilizzate per crioconservare gli ovociti si dividono in: Congelamento lento Utilizzo del crioprotettore PROH Richiede un congelatore programmabile Tempo necessario circa 2 ore Vitrificazione Utilizzo dei crioprotettori DMSO e Etilen Glicole ad alta concentrazione Non richiede uno strumento specifico Tempo necessario circa 15 minuti a supporto (in genere 2-3 ovociti) Tecnica ormai consolidata Metodica relativamente recente La prima gravidanza al mondo ottenuta da un ovocita congelato con protocollo di vitrificazione venne riportata presso il S.I.S.Me.R. nel 1999 (Kuleshova et al., 1999)
Slow freezing Vitrification CPA concentration 1.5 M 3.0-5.0 M Volume 0.3-1.0 ml <1 µl Cooling rate ~0.5 C/min ~25000-50000 C/min Reduced osmotic injury No Yes Seeding Yes No need Procedure Complicated Simple Freezing machine Yes No need Costs High Less??? (no freezing machine needed, but expensive handling devices) Liquid nitrogen amount High Low
Slow-freezing/Rapid thawing 1 2 1 = Washing solution PBS + 30% Plasmanate 3 4-well dish 2 = Equilibration solution (10 min) 1.5 M PROH + 30% Plasmanate 3 = Loading solution 1.5 M PROH + 0.3 M SUC + 30 % Plasmanate Thawing solutions consist in a gradually decreasing concentration of PROH and a constant 0.3 M sucrose concentration: SOLUTION 1: 1.0 M PROH + 0.3 M SUC + 30% Plasm. (5 min) SOLUTION 2 : 0.5 M PROH + 0.3 M SUC + 30% Plasm. (5 min) SOLUTION 3 : 0.3 M SUC + 30 % Plasm. (10 min) SOLUTION 4 : PBS + 30 % Plasm. (10 min + 10 min at 37 C)
Vitrification (Kuwayama method) CM ES ES ES 3 min 3 min 9 min VS 1 min Re-warming Equilibration Solution (ES): 7,5% DMSO 7,5% ETHYLENE GLYCOL 10% HSA Vitrification Solution (VS) 15% DMSO 15% ETHYLENE GLYCOL 10% HSA 0.5 M Sucrose Thawing Solution (TS): 1 M Sucrose + 10 % HSA at 37 C for 1 min Dilution Solution 1 (DS1): 0.5 M Sucrose + 10 % HSA for 3 min Dilution Solution 2 (DS2): 0.25 M Sucrose + 10 % HSA for 3 min
Fattori importanti per la crioconservazione di ovociti Accanto all ottimizzazione del protocollo di congelamento degli ovociti, è stato dimostrato che il tempo che intercorre tra la somministrazione dell hcg e il congelamento degli ovociti gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale e nel successo della gravidanza (S.I.S.Me.R.) Il tempo ottimale di congelamento è tra 39 e 40 ore dopo la somministrazione dell hcg. Ferraretti et al., Factors affecting thawed oocyte viability suggest a customized policy of embryo transfer, Fert Steril 2010, 94: 1308-1313
Ovociti congelati PROH vs freschi Ovociti scongelati hanno comunque minor probabilità di essere fertilizzati e svilupparsi in zigoti di buona qualità e, conseguentemente, in embrioni rispetto ad ovociti freschi, indipendentemente dall età della paziente. I ridotti tassi di fertilizzazione e di cleavage che si osservano negli ovociti congelati rispetto ai freschi suggeriscono che, sebbene gli ovociti sopravvivano allo scongelamento, il processo di congelamento lento ha un impatto negativo sul potenziale di sviluppo dell ovocita stesso. Magli et al., Impact of oocyte cryopreservation on embryo development, Fert Steril 2010, 93: 510-516
Ovociti vitrificati vs freschi Cobo et al., Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method, Fert Steril 2008, 89: 1657-1664
Ovociti vitrificati vs freschi Rienzi et al., Embryo development of fresh versus vitrified metaphase II oocytes after ICSI: a prospective randomized sibling-oocyte study, Hum Reprod 2010, 25: 66-73
Crioconservazione del tessuto ovarico La corticale ovarica è una struttura estremamente complessa che comprende diversi istotipi cellulari e follicoli in vari stadi di sviluppo con cellule di diverse dimensioni (cellule tecali, cellule della granulosa, ovociti), strutture extracellulari compatte (cellule dello stroma) e formazioni cavitate (antro-follicolari, vasi sanguigni). Campione fresco Campione congelato/scongelato
Tecnica di prelievo di tessuto corticale ovarico - Congelamento lento - Vitrificazione S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Molecular Human Reproduction 2012, 18: 59 67
Vitrificazione del tessuto ovarico Biopsia del tessuto corticale ovarico Tessuto tagliato in piccoli frammenti Frammenti per analisi I frammenti attraversano differenti concentrazioni di soluzione di vitrificazione Il cryotube chiuso è immerso in azoto liquido I frammenti vengono posti in un cryotube vuoto
Crioconservazione del tessuto ovarico: risultati clinici Ø Ad oggi in tutto il mondo sono nati più di 20 bambini da trapianto di tessuto ovarico, fresco o congelato. S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59 67 Ø In alcuni casi il tessuto ovarico trapiantato ha permesso una ripresa della funzionalità ovarica per più di 7 anni. Andersen et al., Long-term duration of function of ovarian tissue transplants: case reports, Reprod Biomed Online 2012 25: 128-32 S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59 67
..alternative Ø Coltura e IVM di follicoli primordiali: 2 step culture system : coltura di tessuto seguita da isolamento di follicoli e coltura degli stessi. In alternativa, utilizzo di una matrice di supporto 3D. Abir et al., In vitro maturation of human primordial ovarian follicles: clinical significance, progress in mammals, and methods for growth evaluation, Histol. Histopatho 2006, 21: 887-98 Picton et al., The in vitro growth and maturation of follicles, Reproduction 2008, 136: 703-15 Telfer et al., A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin, Hum Rep 2008, 23: 1151-8 Woodruff TK, Preserving fertility during cancer treatment, Nat Med 2009, 15: 1124-5 Ø Xenotrapianto: tessuto ovarico umano in topi SCID. Kim et al., Assessment of the integrity of human oocytes retrieved from cryopreserved ovarian tissue after xenotransplantation, Hum Reprod 2005, 20: 2502-8 Nottola et al., Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue: an ultrastructural study, Fertil Steril 2008, 90: 23-32
Conclusioni La criopreservazione di ovociti è efficiente abbastanza da essere utilizzata come metodo di preservazione della fertilità? Negli ultimi anni il miglioramento delle tecniche di congelamento ha significativamente migliorato l efficienza della criocorservazione degli ovociti La crioconservazione degli ovociti è un metodo promettente, soprattutto utilizando la procedura di vitrificazione. Per determinare l efficacia e la sicurezza di questa metodica è necessario, però, verificare la performance in pazienti infertili in tutte le classi di età (pazienti giovani e non)