Università di Genova Dipartimento per lo Studio del territorio e delle sue Risorse - DIPTERIS Fondazione AMGA Gruppo Test Biologici APPLICAZIONE DEL TEST BIOLOGICO E-SCREEN ASSAY E RISULTATI Prof. Laura Canesi (Responsabile scientifico) Dott. Rita Fabbri Laboratorio di Biomarker/Bioassays: Responsabile Prof. Gabriella Gallo
E-SCREEN (cell proliferation assay) (Soto et al., 1995). Il test utilizza una linea cellulare epiteliale di carcinoma mammario umano (cellule MCF/7) particolarmente responsiva agli estrogeni (17β-estradiolo - E2) Utilizzabile per evidenziare la presenza di: - IE ad azione estrogenica : proliferazione cellulare - IE ad azione anti-estrogenica : proliferazione indotta da E2
MECCANISMI D AZIONE DEGLI ESTROGENI E SOSTANZE AD AZIONE ESTROGENICA NELLE CELLULE UMANE ESTRADIOLO IE PROLIFERAZIONE
MECCANISMI D AZIONE DEGLI ESTROGENI E SOSTANZE AD AZIONE ANTI-ESTROGENICA NELLE CELLULE UMANE ESTRADIOLO IE x x PROLIFERAZIONE
Linea cellulare MCF-7 Linea cellulare stabilizzata umana proveniente da adeno-carcinoma mammario Cellule a crescita indefinita con facile riproducibilità Estrema resistenza e sensibilità agli estrogeni in quanto provviste di recettori Dopo ripetute divisioni cellulari viene mantenuta la sensibilità dei recettori Tra i test in vitro utilizzati per lo screening degli IE ad azione estrogenica/antiestrogenica, l E-screen rappresenta il più elevato livello di complessità biologica, in quanto permette di evidenziare effetti estrogeno-dipendenti di sostanze individuali e in miscela, e dei loro eventuali metaboliti, in cellule umane.
La linea cellulare umana MCF/7 presenta elevata espressione dei recettori per gli estrogeni ER e ER. Minervini et al. Toxicology Letters (2005)
Pertanto, queste cellule risultano particolarmente sensibili sia agli estrogeni naturali che a sostanze chimiche ad azione estrogenica (interferenti endocrini) che possono interagire coi tali recettori e indurre una risposta biologica, la PROLIFERAZIONE CELLULARE, facilmente misurabile. CONTROLLO +ESTROGENI
Procedura E-SCREEN Giorno 0 Quando la coltura è a subconfluenza (70%) seminare 5000 cellule MCF7/pozzetto in 200 µl/mezzo in piastra da 96 pozzetti in mezzo privo di estrogeni e senza rosso fenolo Giorno 1 Cambio del mezzo con terreno sperimentale contenente le sostanze da saggiare Controllo negativo in assenza di estrogeni Controllo positivo in presenza di 17 beta estradiolo a differenti concentrazioni Campione: Sostanze chimiche o estratti da matrice ambientale Campione + antiestrogeno Tamoxifene Giorno 6 Test colorimetrico dell MTT
Al termine del tratttamento, la vitalità cellulare viene valutata mediante un test colorimetrico (MTT assay) Il test è basato sulla capacità degli enzimi mitocondriali delle cellule viventi di convertire il substrato 3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)2,5-difeniltetratiazolio bromuro, giallo, solubile in acqua, in un formazano blu scuro, insolubile.
Valutazione dell attività estrogenica I parametri che indicano l estrogenicità sono: n max di cellule ottenute a seguito di trattamento con E2 o con il campione incognito PE = n cellule nel controllo negativo (privo di E2) PE campione RPE = x 100% MAX PE estradiolo Per campioni provenienti da matrici ambientali : EC50 Estradiolo EEQ (ng/l) = EC 50 campione
E-SCREEN: Curva di estrogenicità per E2 Una curva standard di estrogenicità è stata costruita utilizzando 7 diverse concentrazioni di E 2 (da 10-14 a 10-8 M). L attività estrogenica dei campioni viene espressa come Effetto Proliferativo (PE), calcolato come rapporto tra l effetto massimo indotto dalla sostanza test e il controllo in assenza di E2(PE =1). E-Screen assay reporting limit (LOR): 1 ng/l la più bassa concentrazione alla quale si osserva una risposta significativamente diversa dal bianco sperimentale (MeOH+20%) - Effetti prevenuti dall antiestrogeno TAMOXIFENE (100% inibizione a 100 nm)
La curva è stata analizzata mediante regressione non lineare (equazione logistica a 4 parametri) (GraphPad Prism software package, GraphPad Inc.). Dall analisi di questi dati abbiamo ottenuto il valore medio di EC 50 E 2 = 4,21 ng/l; tale valore è in accordo con quanto riportato nella metodica originale. L elaborazione statistica permette inoltre di esprimere i dati ottenuti con composti ad attività agonista in termini relativamente quantitativi ed esprimere i risultati ottenuti in PE anche in termini di Estradiolo Equivalenti (EEQs) ng/l.
RISULTATI : ESTROGENICITA La metodica è stata applicata agli estratti ottenuti dai campioni in ENTRATA e in USCITA dagli impianti di potabilizzazione utilizzati a diverse concentrazioni, in modo da ottimizzare la sensibilità e riproducibilità del metodo.
CAMPIONI IN ENTRATA: Un attività estrogenica significativa è stata riscontrata solo occasionalmente in alcuni campioni questa, quando espressa in estradiolo equivalenti o EEQ, risulta comunque generalmente 0.06 ng/l, fatta eccezione per alcuni alcuni campioni della VI campagna (0,1-0,9 ng/l).
CAMPIONI IN USCITA: Un attività estrogenica significativa è stata riscontrata solo in alcuni campioni questa, quando espressa in estradiolo equivalenti o EEQ, risulta comunque generalmente 0.06 ng/l in tutti i campioni.
Nel complesso, i dati ottenuti dai 9 impianti durante 6 cicli di campionamento indicano che un attività estrogenica significativa è stata riscontrata solo in alcuni campioni in uscita (26% del totale) Qualità dell acqua in uscita: I campioni in Uscita non sono comunque considerabili in fasce di rischio in quanto presentano valori di EEQ 0.06 ng/l di acqua analizzata I risultati sono in accordo con quelli ottenuti mediante l applicazione dello YES ASSAY.
Limiti e vantaggi dei test biologici E evidente ogni test non è in grado di identificare tutte le complesse interazioni e meccanismi di risposta che gli ormoni inducono negli organismi pluricellulari, e che nessun singolo test può predire tutti gli effetti delle sostanze attive dal punto di vista ormonale. D altra parte, è riconosciuto a livello internazionale che tali test costituiscono un valido strumento per uno screening di primo livello per evidenziare l attitudine di composti o matrici complesse a riconoscere i recettori estrogenici umani, legarsi ad essi ed indurre una catena di reazioni biomolecolari caratterizzate da una relazione dose-risposta i cui prodotti sono strumentalmente misurabili. pertanto, questi test forniscono informazioni rilevanti dal punto di vista scientifico e igienico-sanitario.
CONCLUSIONI Il presente studio rappresenta il primo esempio di applicazione dei test biologici di Estrogenicità a campioni di acqua potabile erogati da diversi Enti Acquedottistici in Italia. I dati ottenuti indicano che il 74% dei campioni di acqua in uscita sono da considerarsi negativi per attività estrogenica all E-Screen assay, il che indica nel complesso una buona qualità dell acqua erogata dagli impianti e destinata alla rete idrica I risultati ottenuti pongono una base importante per un confronto con altre realtà europee.