Monitoraggio mediante test biologici: applicazioni nella matrice acquosa D. Reali

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1 Università di Pisa - Dip.Patologia sperimentale, BMIE Monitoraggio mediante test biologici: applicazioni nella matrice acquosa D. Reali Stato dell arte sui rapporti tra ED, farmaci e prodotti per l igiene personale ed acque destinate al consumo umano AMGA, Genova 20 giugno 2006

2 TEST BIOLOGICI Tier 1 Screening assays Tier 2 Testing assays Amphibian (Frog) metamorphosis Receptor binding in vitro assays (AR, ER) Aromatase Fish screen Hershberger Pubertal female/male Steroidogenesis Uterotrophic 15-day adult intact male Amphibian reproduction Avian 2-Generation Fish lifecycle Invertebrate lifecycle Mammalian 2-Generation

3 Targets degli estrogeni ovaie vagina utero ghiandole mammarie prostata ghiandola pituitaria ipotalamo cellule di Leyding reni cellule di Langerhans fegato ossa macrofagi cellule linfoidi cellule endoteliali cellule gliali cellule di Schwann

4 Estrogen receptor (ER) binding Misurano in vitro il legame a Recettori Estrogenici o l attività trascrizionale legame dipendente usano recettori isolati da cellule umane o di ratto due tipi di ER α β α + β - Sistema Nervoso Centrale, vasi sanguigni, ossa, cuore, mammella, ovaio, utero, testicoli, prostata α - fegato β - polmoni, reni, vescica, intestino

5 AF-1 DNA Ligand / AF-2 A/B C D E F ERα N C ERβ N- -C (23) (86) (24) (58) (12)

6 REPORTER GENE ASSAYS Reporter gene ceppi di lievito o linee cellulari di mammifero transfettate con un vettore di espressione contenente il recettore degli ormoni (ER, AR, tiroidei, ecc.) un vettore contenente un promotore ERE sensibile agli ormoni legato ad un gene reporter che codifica per una proteina facilmente rilevabile (β-( galattosidasi, luciferasi,, ecc.)

7 Yeast Estrogen Screen (YES) S. cerevisiae RMY326 ER-ERE ERE (Picard et al.,, 1998 Microbiol Lett) GPD gene her α estrogeno o xenobiotico legame al recettore estrogenico α umano CYC1 gene reporter (Lac-Z) ERE trascrizione substrato incolore (ONPG) β-galattosidasi

8 Attività agonista capacità di legarsi al recettore estrogenico e stimolare l attività trascrizionale con produzione di proteina Attività antagonista inibizione dell attività trascrizionale estradiolodipendente per competizione sul recettore

9 Criteri per la standardizzazione del metodo Per ciascun composto: 3 repliche per esperimento 15 esperimenti diversi in giorni diversi Criteri di positività: - la variabilità dovuta al trattamento (dose) deve essere significativamente maggiore alla variabilità intersperimentale (MANOVA analisi multifattoriale varianza) - significativa relazione dose-risposta con un range di dosi (LRA regressione lineare, MRT multiple range test) livello di significatività p< 0.05

10 Curva dose risposta Estradiolo E 2 DES NG DMT MXC BHC Dietilstilbestrolo Methoxychlor Esaclorocicloesano Miller units Concentration (M) variabilità intersperimentale <

11 SENSIBILITA EC 50 = concentrazione necessaria per produrre il 50% della risposta massima indotta dal 17 β-estradiolo 10 nm (E2) EC 50 (E2): 0,50 nm (Reali et al., 2004) 0,45 nm (Breithofer( et al., 1999) 0,23 nm (Breinholt( & Larsen,, 1998) 1,50 nm (Rehman et al., 1998) 0,20 nm (Arnold et al., 1996)

12 Reali et al., Ann Ig,, 2004 SPECIFICITA RIE (efficienza di induzione relativa)= attività massima indotta dal composto rispetto al controllo 17 β-e 2 10 nm (%) Composti 17 β-estradiolo Dietilstilbestrolo Aldrina Colchicina PCB 101 PCB 118 DDT DDE Deltametrina Dieldrina Esaclorocicloesano Metossicloro Genisteina Naringenina Naringina Quercetina Toxaphene Concentrazione (M) RIE ,74 < 3,94 18,35 85,9 2,77 3,06 30,7 2,47 15,0 57,8 82,6 72,3 2,93 7,7 0,66

13 Scala di valutazione dell attività estrogeno-mimetica RIE attività < 10 Negativa Debolmente positiva > 20 Positiva

14 COMPOSTI VEGETALI Reali et al., Phytomedicine,, 2005 Composto (conc M) RIE ISOFLAVONI agonista antagonista Inibizione E2(%) Daidzeina 63,42 n.d. Genisteina 82,88 n.d. Genisteina 7 glc 75,55 n.d. Isoprunetina 38,09 52,6 Isoprunetina 4,7 glc 1,44 23,2 Isoprunetina 7 glc 34,79 38,7 FLAVONI Luteolina 4,20 77,0 Luteolina 4 glc 65,99 20,0 Luteolina 7 glc 46,55 29,1 Licoflavone C 82,38 10,5

15 MATRICI ACQUOSE Direttiva Quadro 2000/60/CE azione comunitaria in materia di acque individua tra gli inquinanti di cui è prioritario il rilevamento sostanze che possono avere ripercussioni sulle funzioni steroidea, tiroidea, riproduttiva o su altre funzioni endocrine del biota stabilisce un programma di azione della Comunità Europea nel campo della politica delle acque superficiali

16 Progetto Min. Amb.. N PR1/A Convalidazione e messa a punto di metodologie alternative ed innovative per lo studio della qualità ecologica dell ambiente acquatico Messa a punto protocollo sperimentale di estrazione Acqua Sigma ultrapura + DES 13 µg/l Resine XAD-2 1) Condizionamento con metanolo 2) Filtrazione v=50ml/min min 3) Asciugatura con N 2 4) Eluizione con metanolo/n-esano esano 5) Evaporazione in Rotavapor 6) Risospensione in 1ml DMSO Cartucce C18 1) Condizionamento metanolo/n-esano esano 2) Filtrazione v=20ml/min min 3) Eluizione con metanolo/n-esano esano 4) Evaporazione in Rotavapor 5) Risospensione in 1ml DMSO Recovery efficiency 98% (GC)

17 ACQUE SUPERFICIALI (45 c.) 20 litri acqua di mare e di transizione vantaggi e limiti XAD-2 C 18 maggiore lavoro di preparazione tempi più lunghi di estrazione passaggio in flusso di azoto maggiore recupero frazione organica minor lavoro di preparazione maggiore velocità di estrazione si intasano facilmente minore recupero frazione organica SONO STATE UTILIZZATE LE RESINE XAD-2 prefiltrazione del corpuscolato grossolano

18 SITI DI CAMPIONAMENTO Isola Palmaria Range attività agonista antagonista RIE % inib Foce fiume Magra Range attività agonista antagonista RIE % inib Porto di Livorno Range attività agonista antagonista RIE % inib Porto di Viareggio Range attività agonista antagonista RIE % inib Reali et al., Mar Poll Bull, 2005 Foce fiume Arno Range attività agonista antagonista RIE % inib

19 Progetto Min. Amb. Prot.. N SvS/C7/8735 Ambiente marino e prodotti ittici di allevamento: Tutela ambientale e qualità Acqua marina Impianti a terra e off-shore Alimento Pesce (spigola, orata) da acquacoltura 17 % campioni (n.57) attività estrogenica > 10% E 2 Rie max 49 % 20% campioni (n.30) attività estrogenica > 10% E 2 Rie max 32 %

20 MANGIMI per acquacoltura RIE N Campioni min max analizzati 30 0,67 8,20 tossici 20 %

21 Prodotti ittici da cattura (42 c.) Pesce edule da areali di pesca del Mar Mediterraneo 38% campioni attività estrogenica > 10% E 2 RIE max 42 % Reali et al., Envir Health,, 2006

22 Cosa è emerso? MIGRANTI TECNOLOGICI RIE E 2 Silicone PVC PE Tygon Teflon PET

23 MIGRANTI TECNOLOGICI Materiale Entità della cessione Polietilene ++ etilesanolo, dibutilmetilfenolo, isobenzofuranone, diisottilftalato, tetrametilfenilbicicloeptadiene, metilciclopentanone Polivinilcloruro ++++ etilesanolo, benzisotioazolo, metilundecene, isobenzofuranone, metilciclopentanone, dibutilftalato Silicone +++ etilesanolo, esametilciclotrisilossano, dibutilftalato, acido diclorobenzoico Teflon +/- estere butilico dell acido benzoico tracce Tygon + etilesanolo, dibutilftalato, dimetilbenzen-metanolo, tetrametilfenilbicicloeptadiene Laboratori ARCHA S.r.L. Pisa Polietilenetereftalato N.R.

24 Acque destinate all alimentazione umana ACQUE MINERALI NATURALI Volume: 1,5 litri Filtrazione: cartucce C18 Fattore di concentrazione: 100x RIE N Campioni min max 28 0,98 12,73 a concentrazione 200x tutti gli estratti hanno parzialmente inibito la crescita delle cellule di lievito

25 Acque condottate Volume: 20 litri Filtrazione: cartucce C18 Fattore di concentrazione: 200x RIE da ACQUE SUPERFICIALI POTABILIZZATE 9,57 da ACQUE DI FALDA trattate con Cloroderivati 7,87 Negative RIE < 10 E 2

26 L attività estrogenica di un composto può essere espressa mediante la determinazione degli Equivalenti di Estradiolo (EEQs) (ng/l) necessari per elicitare la stessa risposta nel test RIE Curva dose-risposta dell'e Concentrazione (M) EEQs acque superficiali 13,6 108,9 ng/l (Reali et al., 2005)

27 .CONCLUDENDO..Yeast Reporter Gene Assay è un test sensibile, riproducibile, applicabile su varie matrici, utilizzabile efficacemente come test per lo screening di I livello della presenza in matrici acquose di composti chimici o miscele di essi in grado di mimare gli estrogeni eni naturali.consente di disegnare una mappa del grado di inquinamento di ecosistemi acquatici sulla base della quale indirizzare analisi chimiche e ricerche con test di II livello su quei siti in cui il rischio ecologico sia più rilevante.ha permesso di evidenziare la presenza di contaminanti tecnologici pertanto è da ritenersi utile per lo screening della presenza di migranti chimici da packaging per alimenti fluidi e da materiali usati nell industria di processo, da materiale costitutivo o di rivestimento di condotte idriche..infine può rilevare la presenza di sostanze estrogeno mimetiche e in estratti di alimenti di origine animale

28 Andreas Kortenkamp - London Centre of Toxicology The Prague Declaration on Endocrine Disruption E sufficiente l evidenza scientifica per poter passare allo screening di campo limitazione dell esposizione in attesa dello sviluppo di metodiche raffinate e sofisticate che richiedono tempo e ingenti investimenti economici..noi condividiamo.d.reali@med.unipi.it..b.pinto@med.unipi.it