ACQUA e LC-MS Enrico Raffo Fondazione AMGA Milano, 14 marzo 2012

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1 Interferenti Endocrini in acque destinate al consumo umano: un esperienza di collaborazione fra gli istituti di ricerca e le aziende acquedottistiche in Italia ACQUA e LC-MS Enrico Raffo Fondazione AMGA Milano, 14 marzo

2 Cosa sono gli Interferenti Endocrini o Endocrine Disruptors? vasto gruppo eterogeneo di sostanze che, imitando gli effetti degli ormoni naturali o interferendo con essi, interagiscono con il sistema endocrino e possono provocare: insorgenza di tumori. alterazioni degli organi e delle funzioni del sistema riproduttivo; Di quali sostanze si tratta? ormoni naturali animali o vegetali composti di sintesi (pesticidi organoclorurati, difenili policlorurati, diossine, alchilfenoli, derivati dei policarbonati e resine epossidiche, ftalati, organostannici, etc). Un approfondito esame della bibliografia sull argomento ha portato ad un primo rapporto intitolato Stato dell arte sulla presenza nelle acque destinate al consumo umano di sostanze denominate Endocrine Disruptors (2006). Fondazione AMGA ha promosso la formazione di un gruppo di studio formato da Esperti appartenenti ad Enti, Istituti di Ricerca ed Acquedotti con l obiettivo mettere a punto un modello di comportamento ed opportune linee guida per i gestori degli acquedotti italiani (2007) 2

3 Endocrine Disrupters found in European water resources (Final Report ENV.D.1/ETU/2000/0083) Enviromental pollutants Source Ground water Surface water Raw water Treated water Environmental pollutants bisphenol A nonylphenol benzo-α-pirene bisphenol A nonylphenol octylphenol nonylphenol octilphenol benzo-α-pirene bisphenol A nonylphenol stirene phtalates Concentration (µg/l) 0,007 4,2 0,2 4 4,1 0,27 0,29 0,005 0,0007 0,12 2,1 0,193 1,2 Endocrine Disrupters found in European water resources (Final Report ENV.D.1/ETU/2000/0083) HORMONES and PHYTOESTROGENS Source Ground Water Surface Water Raw water Treated water HORMONES and PHYTOESTROGENS 17α-ethinylestradiol estrone 17α-ethinylestradiol estriol 17β-estradiol estrone 17α-ethinylestradiol 17β-estradiol estrone β-sitosterol stigmasterol Concentration (ng/l) 0, ,33 0,11 21,7 1,4 0,2-2,

4 Da quanto emerso dal rapporto ENV.D.1/ETU/2000/0083 si è deciso di monitorare inizialmente i seguenti IE: Alchilfenoli ( es. Nonilfenolo, Octilfenolo, ) 17 alfa-etinilestradiolo 17 beta-estradiolo Estrone Bisfenolo A Mediterranea delle Acque S.p.A. - Genova Publiacqua S.p.A. - Firenze Hera S.p.A. - Bologna SMAT S.p.A. - Torino ACSM Reti Gas Acqua srl - Como Acquedotto Pugliese S.p.A. - Bari ABBANOA S.p.A. - Cagliari VERITAS S.p.A. - Venezia 4

5 Alle Aziende partecipanti all indagine, all avvio dell indagine, è stato inviato un Questionario per raccogliere le principali informazioni circa: tipologia di acqua trattata; fonti di rischio che incidono sulla risorsa; trattamento utilizzato; caratteristiche tecniche dell acquedotto. I casi studio sono stati trattati in forma anonima mediante l attribuzione di sigle ( es. Q, X, W,..), conosciute esclusivamente dal coordinamento e dalle singole strutture. L indagine ha monitorato oltre il 28 % delle risorse di acqua superficiale utilizzata in Italia dai Gestori di Acquedotti. Caso Studio Totale acqua distribuita (m 3 /anno) Acqua grezza utilizzata Superficiale (%) Profonda (%) Bari Bologna Como Firenze Genova Torino Cagliari Venezia

6 Università di Genova Dipartimento di Scienze della Salute Dipartimento di Biologia Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale Università di Pisa Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie ed Epidemiologia Università di Trento Dipartimento di Ingegneria Civile ed Ambientale Istituto Superiore Sanità Roma Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Le prove sono state condotte nel periodo Campagna Data Standard Luglio Impianti Dicembre Impianti Giugno Impianti Ottobre Impianti Novembre Impianti Luglio Impianti Novembre 2010 Nuovi casi Aprile

7 Invio materiale da parte di Fondazione Amga ai Laboratori dei Casi Studio (Standard interni, colonnine SPE, Vetreria, ) Campionamento eseguito dai singoli acquedotti Estrazione e preparazione estratti per analisi chimiche e biologiche Invio estratti preparati a Fondazione Amga per analisi chimica e test biologici Università di Pisa Dip. Patologia Sperimentale Infettivologia, Epidemiologia Istituto Superiore di Sanità - Roma Università di Genova: Dipartimento per lo Studio del Territorio e delle sue Risorse Dipartimento Scienze della Salute Messa a punto, da parte ISS del metodo per la preparazione dei campioni sia per l analisi chimica che biologica 1 litro di campione a ph 2 Filtrazione Estrazione in fase solida: fase tipo HLB Eluizione: 2x3 ml miscela Metanolo:Acetone:Acetato di Etile 40:40:20 Evaporazione eluato sotto flusso di azoto, ripresa del residuo con 0,5 ml di miscela acqua:metanolo (50:50) Test Biologici LC-MS/MS 7

8 Limite di Sensibilità Strumentale (LOD) e di Report (LOR) Composto LOD ng/l LOR ng/l 17 β-estradiolo Estrone Bisfenolo A α-etinilestradiolo octilfenolo Nonilfenolo Concentrazioni IE rilevate all ingresso impianti (valutati complessivamente) Composto Minimo (ng/l) Massimo (ng/l) Valore medio (ng/l) Frequenza di rilevamento Numero di campioni 17 β-estradiolo Estrone Bisfenolo A α-etinilestradiolo octilfenolo

9 Concentrazioni IE rilevate all uscita impianti (valutati complessivamente) Composto Minimo (ng/l) Massimo (ng/l) Valore medio (ng/l) Frequenza di rilevamento Numero di campioni 17 β-estradiolo Estrone Bisfenolo A α-etinilestradiolo octilfenolo La procedura è applicabile anche per l estrazione di composti Perfluorurati nella acque da destinare al consumo umano: Perfluorooctanoate (PFOA); Perfluorooctanesulfonate (PFOS); Perfluoro-n-pentanoic acid (PFPEA) Perfluorohexanesulfonate (PFHxS); Perfluorohexanoate (PFHxA); Perfluoroheptanoate (PFHpA); Perfluorononanoate (PFNA); Perfluorodecanoate (PFDA); Perfluoroundecanoate (PFUnA); Perfluorobutane sulfonate (PFBS) Perfluorohexanesulfonate (PFHxS) Perfluorododecanoic acid (PFDoDA) 9

10 Messa a punto nell Università di Genova (DCCI), di un metodo per il campionamento passivo che utilizza la tecnologia denominata Polar Organic Chemical Integrative Sampler (POCIS*) Membrana: Polieteresolfone (PES), porosità dichiarata 0.1µm Fase adsorbente di due tipi: Isolute ENV / Ambersorb 1500 / SX-3Biobeads Oasis HLB 10

11 Recupero fase stazionaria Eluizione diclorometano/metanolo/toluene [8:1:1] Analisi GS/MS o LC/MS C w = C s M ads /R s T C w = concentrazione analita nell acqua (ng/l) C s = concentrazione analita nella fase adsorbente (ng/g) M ads = massa della fase adsorbente (g) R s = Sampling rate dell analita (l/day) T = tempo esposizione (days) Bisfenolo A misurato nei POCIS e stima della concentrazione dell acqua BPA (ng/pocis) IN-2 A 42.2 IN-2 B 50.0 IN-4 A IN-4 B 88.3 Concentrazione BPA 17 giorni ng/l Concentrazione BPA 30 giorni 35.9 ± 2.7 ng/l OUT-4 A OUT-4 B < LOQ* < LOQ* * = LOQ 0.8 ng/ml 11

12 Utilizzo nell Università di Pisa di un test biologico a breve termine in vitro che utilizza la linea ricombinante di lievito S. cerevisiae RMY326 Yeast Estrogen Screen assay (YES) utilizza un ceppo di lievito in cui è stato inserito: -un gene che esprime il recettore umano α per gli estrogeni presente anche in altre specie animali -un gene che esprime un elemento di risposta agli estrogeni (ERE) -un gene reporter che codifica la produzione di un enzima, la β-galattosidasi Il test evidenzia la capacità di un composto o di una miscela di riconoscere il recettore α umano per gli estrogeni, di legarsi ad esso e di attivare l ERE, conseguentemente indurre la trascrizione del gene reporter con produzione di β-galattosidasi, misurabile per mezzo di spettrofotometro L attività estrogenica (agonista) elicitata dallo xenobiotico viene calcolata relativamente (%) a quella indotta dall E 2 10 nm e può essere espressa in Equivalenti di Estradiolo (EEQs) ng/l L attività antiestrogenica (antagonista) elicitata dallo xenobiotico viene calcolata come inibizione (%) dell attività indotta dall E 2 1nM Yeast Estrogen Screen assay Attività agonistica ( estrogenica) RIE Relative Inductive Efficiency % EEQ ng/l Estradiol Equivalent * equivalente a E M Curva dose-risposta standard 17 beta estradiolo (calcolata con GraphPad Prism 4.0) 12

13 Utilizzo nell Università di Genova di un test biologico per la valutazione dell attività estrogenica mediante E-SCREEN assay L E-SCREEN (Estrogen screen) assay utilizza una linea cellulare epiteliale di carcinoma mammario umano (cellule MCF-7) particolarmente responsiva agli estrogeni. Il test si basa sulla determinazione dell attività proliferativa (PE = Proliferative Effect) indotta da un campione in confronto a quella indotta dall estrogeno naturale, il 17bestradiolo. Dei test in vitro utilizzati per la valutazione dell attività estrogenica/antiestrogenica, l Escreen rappresenta il più elevato livello di complessità biologica, in quanto permette di evidenziare effetti estrogeno-dipendenti (agonista/antagonista) di sostanze individuali e in miscela, e dei loro eventuali metaboliti, in cellule umane. Il test è stato utilizzato per valutare la sensibilità e specificità nel rilevare gli analiti scelti per la sperimentazione, ed è stato successivamente applicato all analisi di estratti di matrici acquose. 13

14 Una curva standard di estrogenicità è stata costruita utilizzando 7 diverse concentrazioni di E2 (da a10-8 M). L attività estrogenica dei campioni viene espressa come effetto proliferativo (PE) calcolato come rapproto tra l effetto massimo indotto dalla sostanza test e il controllo in assenza di E2 (PE=1) E-Screen assay reporting (LOR): 1 ng/l Concentrazione alla quale si osserva una risposta significativamente diversa dal bianco sperimentale (MeOH 20%) Un attività estrogenica significativa è stata riscontrata solo occasionalmente in alcuni campioni, quando espressa in Estradiolo Equivalenti (EEQ) risulta generalmente 0.06 ng/l, fatta eccezione per alcuni campioni della VI campagna ( ng/l) 14

15 Un attività estrogenica significativa è stata riscontrata solo occasionalmente in alcuni campioni, quando espressa in Estradiolo Equivalenti (EEQ) risulta generalmente 0.06 ng/l in tutti i campioni Utilizzo nell Università di Genova (DISSAL) di un test biologico per la valutazione del potenziale genotossico di acque contenenti Interferenti Endocrini Il test valuta il legame del BPA al DNA Miscela e incubazione di un estratto del campione di acqua in esame con DNA e sistema di attivazione metabolica (S-9 mix) Estrazione del DNA dalla miscela di reazione Rilevazione degli addotti al DNA mediante tecnica 32 P postlabeling e 32 P imaging Quantificazione degli addotti al DNA ed espressione dei risultati (addotti/10 8 nucleotidi) 15

16 Conclusioni Le acque superficiali possono essere la fonte più facilmente contaminata da IE provenienti da acque reflue, da percolati di discariche, da acque di scorrimento di aree agricole o adibite ad allevamenti di bestiame e da acque di riuso Si possono riscontrare IE in acque da destinare e destinate al consumo umano a concentrazioni molto basse (ng/l) ma generalmente i trattamenti di potabilizzazione hanno dimostrato un sostanziale abbattimento dei potenziali IE nelle acque grezze. Le tracce di IE determinate nelle acque indicano, per i composti valutati, l assenza di rischio per la salute umana, ma è necessario da parte dei sistemi di gestione idrica un aggiornamento costante sul piano scientifico di potenziali contaminanti e gestione del rischio (Water Safety Plans) associato ad una costante collaborazione con enti di ricerca e controllo. 16

17 Grazie per l attenzione Domande? 17