RISOLUZIONE OIV-OENO 408-2011 STRUMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE PER L'IDENTIFICAZIONE DEL LIEVITO VINARIO SACCHAROMYCES CEREVISIAE E DI ALTRE SPECIE DI LIEVITI RELATIVE ALLA VINIFICAZIONE L ASSEMBLEA GENERALE Visto l'articolo 2 paragrafo 2, n. IV dell'accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, Su proposta del gruppo di esperti di Microbiologia DECIDE di adottare i seguenti strumenti di biologia molecolare per l'identificazione del lievito vinario Saccharomyces cerevisiae e di altre specie di lieviti relative alla vinificazione DECIDE, inoltre, di includere le seguenti Premesse nel promuovere gli strumenti di biologia molecolare per l'identificazione del lievito vinario Saccharomyces cerevisiae e di altre specie di lieviti legate alla vinificazione, nonché gli strumenti di biologia molecolare per l'identificazione dei batteri lattici [Oeno-MICRO 09-409] sull uva e nel vino Premessa [ad Oeno-MICRO 09-408 ed Oeno-MICRO 09-409] L'origine, lo sviluppo, i cambiamenti e la successione delle varie specie di lievito possono essere seguiti utilizzando specifiche tecniche molecolari che permettono la differenziazione e la tipizzazione dei ceppi di lievito. Recentemente, nello studio della microbiologia della vinificazione sono state impiegate diverse tecniche. Tali metodi sono sensibili e specifici, essendo volti a rispondere alle diverse esigenze, oltre ad essere semplici, rapidi, riproducibili, efficaci, affidabili e non costosi. L applicazione di metodi molecolari di identificazione può essere effettuata senza una previa coltura, oppure a seguito di arricchimento o anche a seguito di isolamento dei microrganismi. Ciò permette di conoscere meglio il sistema microbico che si sviluppa sulla superficie dell uva o del vino. La presente guida ha lo scopo di assistere i laboratori che svolgono analisi microbiologiche nel loro approccio all identificazione del lievito Saccharomyces cerevisiae e di altre specie di lieviti [Oeno-MICRO 09-408] relative alla vinificazione, nonché nell identificazione dei batteri lattici [Oeno-MICRO 09-409] presenti sull uva e nel vino. Le tecniche riportate trattano i principi generali delle tecniche molecolari disponibili. Per i metodi dettagliati si rimanda alla bibliografia. 1
Strumenti molecolari per l'identificazione del lievito vinario Saccharomyces cerevisiae e di altre specie di lieviti relative alla vinificazione Per l'identificazione e la caratterizzazione dei lieviti vinari in diverse fasi della vinificazione, dell invecchiamento e della conservazione possono essere utilizzati metodi coltura-dipendenti o coltura-indipendenti. METODI COLTURA-DIPENDENTI IDENTIFICAZIONE DI LIEVITI A LIVELLO DI SPECIE rdna PCR-RFLP (restriction fragments length polymorphism) Si tratta di un metodo coltura-dipendente, poiché richiede l'estrazione del DNA da una coltura pura. Tale metodo si basa sull'amplificazione di regioni specifiche di unità ripetute di rdna (tra cui gli spaziatori interni trascritti ITS1 e ITS2 e il gene 5.8S rrna integrato o il gene 265 rrna). Tali regioni hanno sequenze altamente conservate e sequenze che mostrano un alto grado di variabilità genetica tra lieviti di specie differenti. Nella maggioranza dei casi, i prodotti della PCR amplificati da ceppi della stessa specie e dello stesso genere presentano dimensioni molecolari identiche, e le specie dello stesso genere hanno dimensioni simili. Anche se della stessa dimensione, la sequenza di tali regioni amplificate differisce secondo le specie. Pertanto, la differenza di sequenza è messa in evidenza mediante l analisi di restrizione utilizzando differenti endonucleasi di restrizione come ad esempio: CfoI HaeIII, HinfI, DdeI, MboI. I profili di restrizione differiscono secondo le specie. L enzima DdeI è necessario per la differenziazione tra H. uvarum e H. Guilliermondii, come riportato da Esteve-Zarzoso et al. (1999) e Cadez et al., 2002, mentre l'enzima MboI è necessario per distinguere C. zemplinina da C. stellata (Sipicki, 2004). Inoltre, per differenziare le specie del genere Saccharomyces e i relativi ibridi dovrebbero essere utilizzati altri enzimi di restrizione (Gonzales et al., 2006). Questa metodologia è già stata utilizzata per identificare circa 145 specie di lieviti appartenenti a 26 generi di lievito differenti e i profili di restrizione della maggior parte delle specie identificate sono riportati da Esteve-Zarzoso et al. (1999) e Zanol et al. (2010). Dati relativi all ITS-5.8S sono disponibili online (http://www.yeast-id.com). Esteve-Zarzoso et al., (1999) Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8 S rrna gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Int. J. Syst. Bacteriolo. 49, 329-2
337. Fernández-Espinar et al. (2000) RFLP analysis of the ribosomal transcribed spacers and the 5.8 S rrna gene region of the genus Saccharomyces: a fast method for species identification and the differentiation of flor yeasts.. Antoine Van Leeuwenhoek 78: 87-97. De Llanos et al. (2004) Identification of species of genus Candida by RFLP analysis of the 5.8 S rrna gene and the two ribosomal internal transcribed spacers.. Antoine Van Leeuwenhoek 85: 175-185. Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rdna restriction analysis as a tool to characterise non-saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol 102, 49-56. Zanol G., Baleiras-Couto M.M., Duarte F.L. (2010) Restriction profiles of 26S rdna as a molecular approach for wine yeasts identification. Ciência e Técnica Vitivinícola 25: 75-85. Cadez N., Raspor P., de Cock A.W.A.M., Boekhout T., Smith M.Th. (2002) Molecular identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and Kloeckera. FEMS Yeast Research 1, 279-289. Sipiczki M. (2004) Species identification and comparative molecular and physiological analysis of Candida zemplinina and Candida stellata. J. Basic Microbiol. 44 (6), 471 479. González S.S., Barrio E., Gafner J., Querol A. (2006) Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces kudriavzevii in wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, 1221 1234. Sequenziamento della regione D1/D2 dopo amplificazione PCR Si tratta di un metodo coltura-dipendente, poiché richiede l estrazione del DNA da una coltura pura. Si basa sull amplificazione della regione D1/D2 del gene 26S rrna e sul successivo sequenziamento dell amplicone ottenuto. La sequenza della regione D1/D2 differisce più dell 1% tra specie diverse e meno dell 1% tra ceppi appartenenti alla stessa specie. La sequenza della regione D1/D2 del gene 26S rrna consente di compiere una differenziazione all interno dell ampia varietà di specie di lieviti conosciute. La sequenza della regione D1/D2 del gene 26S rrna permette la classificazione e l identificazione filogenetica degli isolati incogniti, giacché il database esistente è di gran lunga il più grande tra i geni dei lieviti. 3
Kurtzman e Robnett (1997) Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene. J Clin Microbiol. 35, 5 ::1216-23. Kurtzman e Robnett (1998) Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie Van Leeuwenhoek. 73, 4,: 331-71. Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rdna restriction analysis as a tool to characterise non-saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol 102, 49-56. IDENTIFICAZIONE DEI LIEVITI VINARI A LIVELLO DI CEPPO RFLP (restriction fragments length polymorphism) del DNA mitocondriale (mtdna) Il DNA mitocondriale (mtdna) del S. cerevisiae è una piccola molecola di 65-80 Kb il cui grado di variabilità può essere osservato mediante l analisi di restrizione. L alto grado di polimorfismo del mtdna consente di analizzare la variabilità di specifici ceppi vinari di S. cerevisiae. Si tratta di uno dei metodi più utilizzati al fine di caratterizzare i lieviti vinari isolati durante la fermentazione alcolica. Querol et al (1992) e López et al (2001) hanno semplificato il metodo d analisi: è richiesta soltanto l estrazione del DNA totale da un isolato in coltura pura e l analisi di restrizione con gli enzimi di restrizione Hinf I o Rsa I (Guillamón et al., 1994, Schuller et al 2004; Lopes et al 2006). La presente tecnica permette un alta capacità d identificazione del ceppo in tempi brevi. Può essere utilizzata dall industria vinicola, poiché è una tecnica rapida, sicura e non necessita di strumentazione PCR. Querol et al (1992) A comparative study of different methods of yeast strain characterization. Syst. Appl. Microbiol. 15: 439-446. Guillamón et al (1994) Rapid characterization of four species of the Saccharomyces sensu stricto complex according to mitochondrial DNA patterns. Int. J. Bacteriol. 44: 708-714. López et al (2001) A simplified procedure to analyse mtdna from industrial yeast. Int. J. Food Microbiology 68: 75-81. Schuller D, Valero E., Dequin S., Casal (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiology Letters 231, 19-26. 4
Lopes C.A, Lavalle T.L, Querol A., Caballero A.C. (2006) Combined use of killer biotype and mtdna-rflp patterns in a Patagonian wine Saccharomyces cerevisiae diversity study. Antonie van Leeuwenhoek 89, 147 156. Amplificazione delle sequenze Delta (δ) Le sequenze Delta sono elementi di 0,3 Kb (334 bp) che affiancano i retrotrasposoni Ty1 in S. cerevisiae. All interno del genoma del lievito sono state trovate tra 35 e 55 copie di sequenze delta, come parte dei retrotrasposoni Ty1 o come elementi isolati. Tuttavia, tali sequenze delta sono concentrate nelle regioni genomiche che si legano ai geni trna. Il numero e l ubicazione di questi elementi presentano una certa variabilità intraspecifica che Ness et al (1993) hanno utilizzato per l elaborazione di primer specifici: δ 1 e δ 2 utili per la differenziazione del ceppo S. cerevisiae. Legras e Karts (2003) hanno ottimizzato questa tecnica mediante la progettazione di due nuovi primer: δ 12 e δ 21 collocati accanto a δ 1 e δ 2. L utilizzo di δ 12 e δ 21 o di δ 12 con δ 2 rivela maggiori polimorfismi che si riflettono in più bande sul gel dell elettroforesi. Legras e Karts (2003) hanno identificato 53 ceppi commerciali utilizzando la combinazione di δ 12 e δ 21 o δ 12 con δ 2. Shuller et al. (2004) sono stati in grado di differenziare un gran numero di ceppi di lieviti vinari mediante l utilizzo dei primer δ 12 e δ 2. Ness et al, (1993) Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62: 89-94. Legras e Karst (2003) Optimisation of interdelta for Saccharomyces cerevisiae strain characterization. FEMS Microbiol. Lett. 221 : 249-255. Schuller et al, (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231: 19-26. Genotipizzazione per mezzo di microsatelliti I microsatelliti sono brevi sequenze nucleotidiche ripetute in tandem lunghe da 1 a 10 pb. Tali sequenze sono diffuse in tutto il genoma del lievito, sia nelle regioni di codificazione sia in quelle di non codificazione ma con una percentuale più bassa nelle regioni di codificazione. I marker microsatellitari sono dei loci polimorfi per i quali la diversità degli 5
alleli permette di differenziare i ceppi di una stessa specie di lieviti. I vari loci sono noti e possono essere usati per tipizzare ceppi di S. cerevisiae (Legras et al. 2005). I profili ottenuti da una combinazione di almeno sei microsatelliti permettono un efficace differenziazione di ceppi di S. cerevisiae. I marker microsatelliti sono frequentemente usati come marker genetici in studi di mappatura genetica e di genetica della popolazione. La combinazione di sei loci microsatelliti è indicata come una tecnica altamente discriminante e riproducibile, in grado di rivelare al tempo stesso relazioni geografiche e tecnologiche tra ceppi. Questi loci polimorfici possono essere facilmente usati per determinare il profilo dei ceppi di S. cerevisiae durante la fermentazione. Schuller et al. (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231: 19-26. Legras et al. (2005) Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization of Saccharomyces cerevisiae strains. Int J Food Microbiol. 102: 73 83. Schuller e Casal (2007) The genetic structure of fermentative vineyard-associated Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis. Antonie van Leeuwenhoek 91:137 150. METODI COLTURA-INDIPENDENTI PCR QUANTITATIVA (qpcr) OBIETTIVO Individuazione e quantificazione rapida dei lieviti a livello di specie nel mosto o nel vino. Questo metodo si basa sull uso di primer per lieviti universali disegnati sui domini variabili D1/D2 del gene 26S rrna. Si tratta di una delle poche sequenze di geni disponibili per tutte le specie di lieviti ascomiceti conosciute. La quantificazione è possibile a partire dalla determinazione del numero di cicli di polimerizzazione necessario per superare il segnale soglia. Più la concentrazione di DNA della specie bersaglio è elevata nel campione, meno il numero di cicli necessari per superare il segnale soglia è elevato. Le curve di calibrazione permettono una determinazione precisa. 6
La presente tecnica è stata usata per la quantificazione delle cellule di Candida stellata, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, e Saccharomyces cerevisiae in fermentazione mista sia in un mezzo sintetico sia nel vino. L analisi è risultata lineare su 5 ordini di grandezza e il limite di rivelazione è stato di circa 10 2 CFU/ml. La presenza di altri microrganismi vinari non-target (sia lieviti sia batteri) nei campioni non ha influito significativamente sull analisi qpcr. Un metodo rapido qpcr è stato sviluppato per individuare e quantificare i diversi lieviti non Saccharomyces, utilizzando primers specie-specifici per C. zemplinina, T.delbrueckii, I. orientalis e M. pulcherrima (Zott et al., 2010). Hierro, Esteve-Zarzoso, Gonzalez, Mas and Guillamon et al. (2006) Real-Time Quantitative PCR (qpcr) and Reverse Transcription-qPCR for Detection and Enumeration of Total Yeasts in Wine. Appl. Environ. Microbiol. 72(11): 7148 7155. Zott K, Claisse O, Lucas P, Coulon J, Lonvaud-Funel A, Masneuf-Pomarede I (2010) Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR. Food Microbiology 27:559-567. PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) OBIETTIVO Identificazione dei lieviti a livello di specie nel mosto o nel vino Il presente metodo si basa sull amplificazione dei lieviti 26S rdna utilizzando primer universali U1 ( contenente una coda GC clamp) e U2. I frammenti di amplificazione sono separati sulla base della lunghezza e della composizione nucleotidica in un gel denaturante di poliacrilammide (gradiente da 20 a 60% di urea e formammide). I frammenti di amplificazione che presentano un certo interesse sono asportati direttamente dal gel e sequenziati per l identificazione delle specie microbiche facendo riferimento alla banda di sequenza 26S rdna dei lieviti. Uno dei vantaggi è la possibilità di identificare lieviti vitali ma non coltivabili per i quali il DNA è amplificato. La presente tecnica è stata utilizzata per l identificazione di popolazioni microbiche sia in campioni di uva sia di vino ed ha portato all identificazione di varie specie di lieviti (Candida diversa, Candida sorboxylosa, Candida stellata, Dekkera bruxellensis, 7
Hanseniaspora occidentalis, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia hanoiensis, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Issatchenkia terricola, Kluyveromyces thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii). Popolazioni di lieviti vinari superiori a 10 3 cellule/ml sono state adeguatamente rivelate e identificate mediante PCR-DGGE. La PCR-DGGE non è uno strumento quantitativo. Cocolin L, Heisey A, and Mills D.A. et al. (2001) Direct Identification of the Indigenous Yeasts in Commercial Wine Fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 52:1:49-53. 8