AFLATOSSINE E AFLATOSSICOSI

Large Animals Review, Anno 10, n. 1, Febbraio 2004 3 AFLATOSSINE E AFLATOSSICOSI A. CERESER*, L. FAVERO**, S. PULZE***, A. BARBERIO** * Medico Veterinario Igienista L.P. - e-mail acereser@qualimenta.it * * Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Legnaro (PD), viale dell Università 10 049/8084266 e-mail abarberio@izsvenezie.it * * * Comando interregionale Carabinieri Vittorio Veneto - RTLA di Padova Riassunto Le aflatossine sono le più pericolose sostanze tossiche prodotte da miceti a causa della loro dimostrata azione cancerogena e mutagena per molte specie animali e per l uomo. In questo lavoro gli autori analizzano le modalità di contaminazione degli alimenti da parte di queste sostanze nelle diverse fasi di produzione. In particolare vengono descritti i principali fattori di rischio che determinano la contaminazione da aflatossine sui vegetali direttamente in campo, nelle fasi di stoccaggio e durante la preparazione di mangimi. Per quanto riguarda gli alimenti destinati al consumo umano sono state approfondite le tematiche relative alla contaminazione del latte con l aflatossina M 1, il derivato idrossilato dell aflatossina B 1, che si forma ad opera di ossidasi ed enzimi microsomiali epatici. Sono state poi illustrate le principali forme morbose conseguenti all intossicazione da aflatossine negli animali domestici e nell uomo. Infine sono riportate le misure di prevenzione da attuare per minimizzare o ridurre la contaminazione degli alimenti zootecnici da parte delle aflatossine. Summary Aflatoxins are the most dangerous toxins produced by moulds, considering their demonstrated carcinogenic and mutagenic activity against animals and human. In this paper the authors describe the food contamination ways by these toxins in the different steps of production. The main risk factors, responsible of crops contamination by aflatoxins, directly in the field, during storage and fodder preparation, are described. In relation with human foodstuffs, the problems concerning milk contamination by aflatoxin M 1, the AfB 1 hydroxylated metabolite, obtained by hepatic oxidases and microsomial enzymes, were investigated. The main diseases caused by aflatoxins ingestions in domestic animals and humans have been described. Finally preventive measures, to be applied with the aim of control or reduce animal feeding contamination by aflatoxins, are reported. INTRODUZIONE Le aflatossine sono le principali sostanze tossiche prodotte da miceti appartenenti al genere Aspergillus. La loro produzione è limitata a certi ceppi di Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. Gli aspergilli sono normalmente riscontrati come saprofiti che crescono su substrati vegetali non adeguatamente essiccati (soprattutto in condizioni di clima caldo umido), quali grani di cereali, arachidi e prodotti derivati (mangimi). Aspergillus flavus, uno dei principali produttori di AfB 1, può crescere sul mais come patogeno permettendo così la formazione di micotossine in campo. Gli alimenti che contengono aflatossine con maggiore frequenza sono: farina di arachide, mais e sottoprodotti, panelli di cocco, cotone e derivati, ma una cattiva conservazione può far comparire le aflatossine anche in prodotti non a rischio, tra cui soia, sorgo, frumento, avena ed orzo 1,2,3. Le aflatossine finora conosciute sono 6: B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 e M 2 (le ultime due originano come prodotti del metabolismo microbico, animale e umano). Sono composti eterociclici fluorescenti caratterizzati per metà da diidrofuranici o tetraidrofuranici legati ad una metà cumarinica (Fig. 1). Le aflatossine possono essere causa di tossicità acuta, nonché cancerogene, mutagene e teratogene per molte specie animali. Si ritiene che la cancerogenicità e mutagenicità di AfB 1 derivi dalla formazione di un epossido reattivo a livello della posizione 8-9 del terminale furanico, e dal suo successivo legame all acido nucleico; l azione di tale derivato dell acido nucleico può durare per alcune settimane dopo la formazione. L ordine di tossicità, cancerogenesi e mutagenesi è il seguente: AfB 1 > AfG 1 > AfB 2 > AfG 2 > AfM 1 > AfM 2. In comune con altri xenobiotici non polari, le aflatossine sono metabolizzate principalmente nel fegato ad opera di ossidasi ed enzimi microsomiali. La maggior parte dei

4 Aflatossine e aflatossicosi Tabella 1 Fattori che influenzano la sintesi di micotossine in fase di stoccaggio Fattori biologici Fattori chimici Fattori ambientali Tipo di ceppo Tipo di substrato Temperatura Microflora competitiva Agenti antifungini Attività dell acqua Dimensione dell inoculo Gas atmosferici Intensità luminosa FIGURA 1 - Struttura chimica delle aflatossine (modificato da Goldblant L.A. Aflatoxin, Food science & technology ed., London, 1969). metaboliti primari prodotti da queste attività enzimatiche, sono in seguito coniugati con acido glucuronico o solfato, ed eliminati con l urina e/o con le feci. 1. CONTAMINAZIONE DEGLI ALIMENTI DA AFLATOSSINE a) In campo Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus possono teoricamente produrre micotossine in qualsiasi derrata alimentare che consenta la loro crescita. I livelli più elevati di contaminazione sono stati riscontrati in mais, arachidi, noci brasiliane, pistacchio, semi di cotone e copra. I livelli più bassi di contaminazione sono stati osservati in mandorle, noce pecan, noci, uva passa, spezie e fichi. Diverse coltivazioni mostrano una certa resistenza alla contaminazione da aflatossine in campo: soia, fagioli, legumi, manioca, sorgo, miglio, frumento, avena, orzo e riso. La formazione naturale di aflatossine è maggiore ai tropici e nelle aree con clima simile. L arachide è una coltivazione particolarmente predisposta all invasione da A. parasiticus e, in misura minore, da A. flavus. È stato dimostrato che il suolo infestato potrebbe essere la principale fonte di contaminazione. I semi di cotone possono essere facilmente infestati da A. flavus, con successiva formazione di alti titoli di aflatossine. Anche per il mais A. flavus è la specie fungina di maggior importanza per la produzione di aflatossine. Negli Stati Uniti, ad esempio, la contaminazione in campo è un problema causato soprattutto da A. flavus, il quale colonizza esternamente la pannocchia e successivamente invade le cariossidi in via di sviluppo. Oltre all infestazione da parte di insetti e il conseguente danno alle cariossidi che contribuisce alla penetrazione fungina e allo sviluppo di tossine, sono fattori importanti la temperatura ambientale, il danno meccanico, lo stress da siccità e la varietà. Per l Italia, le aflatossine sono soprattutto un problema connesso con l importazione di derrate da Paesi a clima caldo umido, mentre la contaminazione dei prodotti locali è poco frequente e a livelli piuttosto contenuti, sia per motivi climatici, sia per le tecniche agronomiche, di raccolta e di conservazione dei prodotti stessi 4. Tuttavia, l andamento climatico di questi ultimi anni, con estati calde e siccitose, ha favorito lo sviluppo di funghi produttori di aflatossine anche in Italia 1. b) In fase di stoccaggio Dopo il raccolto e durante le fasi di trasporto, stoccaggio e produzione di derrate di origine vegetale, la crescita di muffe tossigene e la produzione potenziale di micotossine vengono ad essere influenzate da diversi fattori, quali il livello di umidità, la temperatura, l aerazione, le condizioni di conservazione (Tab. 1). La prevenzione dello sviluppo di micotossine durante la conservazione si basa essenzialmente sullo stretto controllo dell umidità della granella. Ciò richiede l assenza di insetti, che possono creare un microclima favorevole per la crescita fungina, nessuna migrazione di umidità, nessuna condensazione e nessuna presenza di roditori, che possono determinare un aumento localizzato del livello di umidità in seguito alla minzione. Gli aspergilli e i penicilli sono normalmente riscontrati come saprofiti che crescono in cereali o prodotti derivati non adeguatamente essiccati. Essendo specie xerofile, il contenuto di acqua relativamente basso determina un ambiente particolarmente adatto a loro. Di conseguenza, le micotossine da Aspergillus e Penicillium (ocratossina A, citrinina, citreoviridina, acido ciclopiazonico, patulina, acido penicillico, rubrotossine A e B) sono le principali tossine che si formano ex novo in queste condizioni. Al contrario, le tossine da Fusarium (tricoteceni) ed altre si formano in campo e sono, quindi, presenti per una precedente contaminazione. Per quanto concerne specificatamente le aflatossine, mentre la loro produzione in condizioni naturali si verifica nelle aree tropicali o con clima simile, è possibile che ciò avvenga anche a climi temperati o più freddi, in particolare a seguito di pratiche di stoccaggio presso le aziende zootecniche. Senza dubbio la presenza di aflatossine in Europa deriva soprattutto dall importazione i prodotti agricoli contaminati provenienti da Paesi Terzi. c) Nei mangimi Le concentrazioni più elevate di aflatossina sono state riscontrate in mangimi ad alto tasso di umidità, stoccati in modo inidoneo, soprattutto in Paesi a clima caldo 2. Inoltre la politica agricola dell UE, con il mantenimento di prezzi relativamente alti per l acquisto di cereali, ha incoraggiato l uso di oil meals, così come di altri prodotti, quali cassava, citrus meal, melasso e polpe di bietola, che possono sostituire i cereali in alcune razioni alimentari. La produzione di mangime con l impiego di questi ingredienti offre ulteriori opportunità per lo sviluppo fungino e di mico-

Large Animals Review, Anno 10, n. 1, Febbraio 2004 5 tossine. Il raffreddamento non adeguato del pellet può favorire lo sviluppo di umidità e, quindi, di muffe. Anche trasporto e stoccaggio di mangimi sfusi in allevamento offrono possibilità di contaminazione dei mangimi con muffe tossinogene. L UE ha stabilito con la Direttiva 99/29/CE dei limiti di presenza di micotossine, negli alimenti ad uso zootecnico, limitatamente all AfB 1. Attualmente essi prendono in considerazione 6 materie prime (arachidi, copra, noce di palma, semi di cotone, mais e prodotti derivati) e fissano dei limiti variabili fra 50 e 5 ppb (Tab. 2). I risultati di un indagine condotta nella UE su oltre 400 campioni di mangime 5 in diverse stagioni di più anni consecutivi (dal 1987 al 1990) hanno evidenziato che solamente il 5% dei prodotti risulterebbe superiore a 10 µg/kg (Tab. 3). Le materie prime più contaminate erano la crusca di riso, il girasole e i semi di cotone provenienti da paesi dell Asia e del Sud America. La stessa indagine, condotta però su circa 180 campioni di mangime complementare, ha evidenziato che solo il 53% degli stessi possiede un livello di AfB 1 < 0,5 ppb mentre il restante 47% evidenzia un livello di AfB 1 compreso tra 0,5 e 9,5 ppb. Tabella 2 Limiti massimi consentiti di aflatossine nei mangimi secondo la normativa dell U.E. (dir. 99/29 CE) Mangimi e materie prime Contenuto massimo di Aflatossina B 1 per mangimi in mangime al tasso di umidità del 12% (µg/kg = ppb) Arachidi, copra, palmisti, semi di cotone, babassu, granturco e loro derivati 20 Altre materie prime per mangimi 50 Mangimi completi per animali da latte 5 Mangimi complementari per animali da latte 5 d) Negli alimenti trasformati I mangimi contaminati da aflatossine possono determinare la presenza nel latte e nei prodotti derivati 6,7 di AfM 1, un derivato idrossilato della AfB 1. L AfM 1 compare nel latte di vacca entro 12 ore dal consumo di AfB 1 ; la quantità di AfM 1 presente varia da animale ad animale, da giorno a giorno e da lattazione a lattazione 2. Il carry over del singolo animale è 3,3-3,5 volte maggiore ad inizio lattazione che a lattazione avanzata ed è linearmente correlato con il livello produttivo. Una quota importante di questa differenza può essere spiegata dalla differente produzione di latte, ma vi è anche un contributo dovuto alla più alta concentrazione di AfM 1 nel latte ad inizio lattazione. L ipotesi che vi sia una permeabilità passiva dal sangue alle cellule alveolari della ghiandola mammaria dipendente dalla concentrazione dell AfM 1, può spiegare la dipendenza del carry over dal livello produttivo. Ad esempio, bovine con infezione della mammella da stafilococchi hanno un elevata escrezione di AfM 1 e le infezioni aumentano la permeabilità degli alveoli 1. Per gli alimenti contaminati è stata trovata una relazione lineare tra ingestione di AfB 1 e livello di AfM 1 nel latte (Tab. 1) così espressa: AfM 1 (ng/l latte) = [1,19 x AfB1 (mcg/bovino/giorno)] + 1,9 1. Poiché AfM 1 è probabilmente cancerogena, la sua presenza nel latte è fonte di notevole preoccupazione per i consumatori. Inizialmente si riteneva che i processi di trasformazione del latte fossero in grado di ridurre il livello di AfM 1 riscontrabile. In seguito, studi condotti in Olanda 5 hanno evidenziato che il contenuto di AfM 1 nel latte non è influenzato dal trattamento termico di pastorizzazione o di sterilizzazione. L AfM 1 è legata alla frazione proteica del latte, per cui è presente nei formaggi ed in altri latticini prodotti con latte contaminato, è stabile nei latti fermentati e nei formaggi molli ed è stata riscontrata nel latte in polvere, nei gelati e sorbetti 1. L Unione Europea con il regolamento 1525/9898 e successive modifiche, ha fissato in 50 ng/l (ppt) il limite massimo consentito per l AfM 1 nel latte. Tabella 3 Contaminazione da aflatossine nei magimi rilevati nel corso degli anni 1987-90 nell UE [European Commission - Directorate General XII Science, Research and Development (1994). Mycotoxins in Human Nutrition and Health ] Periodo di raccolta Periodo di Numero di Numero di campioni contenenti Aflatossina B 1 (µg/kg) dei campioni produzione campioni raccolti < 0,5 0,5 9,5 10 19,5 20-29,5 > 30 Autunno 87 Estivo 87 75 11-1 - Primavera 88 Invernale 153 105 38 5 4 1 Autunno 89 Estivo 103 78 20 2 3 - Primavera 90 Invernale 86 64 17 1 4 - Totale 429 322 86 8 12 1 % 100% 75% 20% 2% 3% -

6 Aflatossine e aflatossicosi 2. AFLATOSSICOSI a) Aflatossicosi negli animali domestici Per aflatossicosi si intende l avvelenamento a seguito dell ingestione di aflatossine contenute in cibo o mangime contaminato. Le contaminazioni più rilevanti si sono verificate in tree nuts, arachidi ed altri semi oleosi, inclusi i semi di mais e di cotone. Le aflatossine di maggior interesse (B 1, B 2, G 1 e G 2 ) sono normalmente rinvenute assieme, in proporzioni variabili, in diversi cibi e mangimi, tuttavia, l AfB 1 è di solito predominante ed è pure quella dotata di maggior tossicità. Tra gli animali, quelli da cortile sono risultati i più sensibili, mentre i poligastrici i più resistenti; la sensibilità è maggiore, progressivamente, per: suino> bovino>cavalloovino. I ruminanti variano nella loro suscettibilità alle micotossine: l aflatossicosi per esempio è stata descritta nelle capre, mentre le pecore paiono molto resistenti e si è visto che la maggior parte di aflatossine loro somministrata viene degradata 8. Negli animali le aflatossicosi possono manifestarsi con sintomatologia acuta o cronica (Tab. 4). L intossicazione acuta in genere porta a morte in tempi variabili, ma relativamente brevi; il fegato appare pallido, aumentato di volume, con necrosi a carico del parenchima 9. Vi può essere glomerulonefrite e congestione polmonare. FIGURA 2 - Relazione tra il consumo giornaliero di AfB 1 e la risultante concentrazione di AfM 1 in latte di bovina, in base a dati sperimentali pubblicati. I limiti di confidenza del 95% per l inclinazione della linea calcolata sono rappresentati da linee tratteggiate (WHO, 1979, tratto da Patterson - 1977 - Mycotoxic, fungi, mycotoxins, mycotoxicoses.) L intossicazione cronica è invece caratterizzata da inappetenza, rallentamento nella crescita, diminuzione di peso, depressione e sintomi nervosi quali spasmi muscolari, atassia locomotoria, perdita di equilibrio 10. Il fegato è in genere congesto con zone di emorragie e necrosi; se l intossicazione è prolungata, si possono verificare processi cancerogeni a carico dell organo. I reni sono congesti, e a volte si nota enterite emorragica. L AfB 1 è un cancerogeno molto potente in svariate specie, inclusi i primati non umani, uccelli, pesci e roditori. In tutte le specie, il fegato è il bersaglio principale dell affezione acuta. Il metabolismo gioca un ruolo molto importante nel determinare la tossicità dell AfB 1 ; diversi studi dimostrano che questa aflatossina necessita di una attivazione metabolica per esercitare l effetto cancerogeno e che questi effetti possono essere modificati inducendo o inibendo la funzione mista del sistema ossidasi. b) Aflatossicosi nell uomo Anche l uomo, come gli animali, può intossicarsi: quasi tutti i prodotti di origine vegetale possono costituire un substrato per la crescita micotica e quindi favorire lo sviluppo di aflatossine, costituendo di conseguenza una potenziale fonte diretta di contaminazione per il cibo destinato all uomo 11. Uno dei principali casi di aflatossicosi nell uomo è avvenuto in più di 150 villaggi di distretti contigui di due regioni confinanti dell India nord occidentale nell autunno del 1974 7. Secondo un rapporto di questo focolaio, 397 persone furono colpite e 108 morirono. In questo episodio, il mais contaminato rappresentava il principale costituente della dieta e furono trovati livelli di aflatossina da 0,25 a 15 mg/kg. Il consumo giornaliero di AfB 1 era stimato essere di almeno 55 µg per chilo di peso corporeo per un numero non precisato di giorni. La sintomatologia mostrava febbre alta, ittero rapido e progressivo, edema degli arti, dolore, vomito e fegato ingrossato. Un ricercatore evidenziò una particolare caratteristica di questo episodio: la comparsa dei segni clinici nella popolazione di un villaggio era stata preceduta da una malattia simile nei cani domestici, seguita da morte dei soggetti colpiti. Un secondo episodio di aflatossicosi è stato segnalato in Kenia nel 1982. Ci furono 20 ricoveri in ospedale con una mortalità del 60%; l assunzione giornaliera di aflatossina era stata stimata essere di almeno 38 µg per chilo di peso corporeo per un numero non definito di giorni. Tabella 4 Aflatossicosi: sintomi clinici nelle diverse specie animali RUMINANTI SUINI EQUINI UCCELLI Polmonite acuta Polmonite acuta Polmonite acuta Sintomi respiratori Congiuntivite Tonsillite Congiuntivite Sintomi nervosi Placentite Congiuntivite Placentite Anoressia Aborto Placentite Aborto Gastroenterite Aborto Diarrea cronica Ulcere gastrointestinali Mastite Granulomi cutanei

Large Animals Review, Anno 10, n. 1, Febbraio 2004 7 Nei Paesi sviluppati la contaminazione da aflatossine negli alimenti raramente è a livelli tali da causare aflatossicosi nell uomo. In considerazione di ciò, gli studi di tossicità umana per ingestione di aflatossine si sono focalizzati sul loro potenziale cancerogeno. È stata dimostrata la stretta associazione cancro epatico ed ingestione di aflatossine 9, come anche la correlazione con altre patologie epatiche e non da ultimo, pare, con la Sindrome di Reye (encefalopatia con degenerazione grassa dei visceri) 12. Oltre ai prodotti vegetali, un ulteriore fonte di contaminazione per l uomo deriva dal fatto che, quando gli animali ingeriscono cibo contaminato, possono diventare veicolo di tossine nel latte (metabolita M 1 ) e carne. In particolare, le polveri del latte sono risultate particolarmente contaminate 13, malgrado il loro scarso contenuto in acqua: tali contaminazioni sono legate per lo più alla lavorazione (impianti), alla confezione (macchine) e allo stoccaggio (magazzini). Il Comitato Scientifico per gli Alimenti dell UE con il Regolamento 2001/466/CE ha adottato quanto previsto dal WHO IARC 14, che ha definito l AfM 1 come un possibile cancerogeno genotossico; il suo potere cancerogeno è stato stimato essere circa 10 volte più basso rispetto all AfB 1, tuttavia, poiché il consumo di latte e prodotti derivati nell uomo può essere considerevole, in particolare tra i neonati ed i bambini, i rischi di esposizione all aflatossina abbisognano di una attenta considerazione. 3. PREVENZIONE La contaminazione da micotossine degli alimenti zootecnici viene generalmente evitata o controllata da buone pratiche di coltivazione, raccolta e stoccaggio degli alimenti zootecnici. Il controllo si attua evitando di raccogliere i cereali a stagione più avanzata o in condizioni di terreni umidi o pesanti, con un appropriata coltivazione del terreno e rotazione delle colture, selezionando varietà di piante resistenti 10, trattando le piante specificatamente con anticrittogamici 2 e con l adozione di misure atte a minimizzare l attacco degli insetti 1, in quanto questi fungono da vettori meccanici delle spore e i danni sulle cariossidi sono fattori predisponenti per la crescita del fungo. Dopo il raccolto, durante la fase di stoccaggio lo sviluppo fungino e la produzione di tossine vengono ridotte essenzialmente controllando la temperatura, l umidità (non superiore al 14%), la ventilazione nonché gli insetti nei siti di stoccaggio. Qualora l adozione di misure preventive fallisca, la concentrazione di AfB 1 negli alimenti zootecnici può essere ridotta ricorrendo a trattamenti fisici, chimici e biologici. I trattamenti fisici comprendono la pulizia ed il lavaggio con bicarbonato, la separazione dei semi contaminati da quelli sani e trattamenti con il calore o con radiazioni ionizzanti. Tra i metodi chimici che hanno evidenziato una certa efficacia contro le aflatossine sono il bisolfito di sodio e l ammoniaca 1. Un metodo alternativo alla decontaminazione fisica o chimica delle granaglie è di minimizzare l effetto delle tossine nell animale modificando la sua dieta. Questi metodi comprendono tra l altro l aggiunta di aromatizzanti o di sostanze chimiche che influenzano il metabolismo o il destino delle micotossine nel corpo dell animale (BHT, BHA, etossichina, oltipraz), il trattamento con inoculo microbico o l uso di argille (allumina, sepiolite, silice, zeoliti, alluminosilicati) o carbone attivo negli alimenti contaminati 1. La prevenzione dei pericoli connessi con l acquisto di mangimi o materie prime contaminati è senza dubbio più complesso, considerando anche le difficoltà legate al campionamento di questi prodotti e quindi all affidabilità del risultato analitico, a causa della non omogeneità di distribuzione delle tossine nell alimento contaminato, con la conseguenza di possibile ottenimento di falsi negativi. Solo un approccio quale quello fornito da un sistema di autocontrollo, che individui un punto critico nella qualificazione dei fornitori e delle forniture, insieme alla loro tracciabilità durante l intero processo produttivo, come previsto dal regolamento CE 178/02, può costituire un valido sistema di prevenzione 15. Parole chiave Aflatossine, micotossine, aflatossicosi, alimenti zootecnici. Key words Aflatoxins, mycotoxins, aflatoxicoses, animal feedings. Abbreviazioni usate Af: aflatossina UE: Unione Europea Bibliografia 1. Piva G., Pietri A., Masoero F., Meschini M. (1998). 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