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FATTORI DI VIRULENZA E TOSSINE 2
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- Nello stomaco a causa del ph acido non risiedono molti batteri, man mano che il ph diventa meno acido, aumenta anche il numero di batteri presenti. - Nel colon si concentra la maggiore quantità e varietà di specie. - La composizione della flora endogena cambia sensibilmente con la dieta. La somministrazione di un antibiotico per via orale, distrugge la flora endogena, oltre all eventuale patogeno, lasciando la possibilità a microrganismi opportunisti di instaurarsi. 6
MECCANISMI DI DIFESA DEL CORPO UMANO DIFESE ASPECIFICHE: efficaci nell eliminazione della maggior parte dei microbi. La resistenza alla colonizzazione ed invasione da parte di patogeni è dovuta alla produzione di sostanze e a meccanismi che impediscono la colonizzazione DIFESE SPECIFICHE: rivolte verso particolari microrganismi rappresentate dal sistema immunitario Microflora endogena Saliva: presenza di lisozima pelle Rapido cambiame nto di ph Svuotamento del tratto urinario Cellule ciliate Ciglia e muco Sangue: proteine inibitorie Muco e fagociti acidità (ph 2) e presenza di sali biliari Microflora endogena DIFESA DELLE MUCOSE - Il singolo strato di cellule epiteliali è rivestito da uno spesso strato di mucina che intrappola le cellule microbiche prima che possano raggiungere l epitelio - Un microrganismo che riesce ad attaccarsi alle cellule può essere eliminato con la desquamazione - L arma specifica del sistema di difesa mucosale è il MALT (Mucosal-associated lynphoid tissue) costantemente attivo. Si tratta di un sistema immunitario indipendente da quello centrale. - L induzione del MALT determina anche una risposta immunologica a distanza 7
A seconda del distretto il SISTEMA IMMUNITARIO MUCOSALE si distingue in: GALT NALT BALT VALT mucosa intestinale mucosa nasale mucosa bronchiale mucosa vaginale Il GALT anatomicamente è formato da aggregati linfoidi prominenti detti PLACCHE DI PEYER, nell intestino tenue e aggregati linfoidi più piccoli diffusi nel colon. L induzione del GALT porta alla produzione di anticorpi di classe IgA-S (IgA di secrezione) che una volta secrete sulla superficie della mucosa prevengono l adesione dei patogeni alle mucose, formando immunomplessi eliminati poi dai movimenti cellulari e dalle secrezioni cellulari Oltre all immunità specifica costituita dal GALT, entrano in gioco una serie di fattori ASPECIFICI rappresentati ad esempio da: MUCINA ph ACIDO miscela di proteine e polisaccaridi il cui ruolo fondamentale è quello di intrappolare i microrganismi impedendone l accesso alle cellule epiteliali. Contiene proteine ad elevata attività antimicrobica come: LATTOFERRINA proteina che lega il ferro privando i microrganismi di tale elemento; LISOZIMA un enzima che digerisce la parete cellulare dei batteri DEFENSINE proteine capaci di aggregarsi nella membrana citoplasmatica microbica formando dei pori che alterano la continuità della membrana portando alla morte cellulare. ad esempio nello stomaco che rende il contenuto gastrico praticamente sterile 8
Probiotici batteri vivi che quando ingeriti conferiscono all organismo effetti benefici che vanno oltre quelli nutrizionali QUALI SONO I PREREQUISITI PER UN PROBIOTICO? L isolamento di ceppi probiotici avviene verificando alcune caratteristiche ritenute fondamentali e ormai generalmente riconosciute da diversi gruppi di ricerca. Essere di origine umana: Nella ricerca di nuovi ceppi probiotici si parte spesso da segmenti di intestino isolati chirurgicamente. Essere non patogeno Essere resistente ad acido gastrico I ceppi che devono essere testati, vengono cresciuti in presenza di acido gastrico (prelevato da soggetti sani) di cui viene misurato il ph prima dell utilizzo. Diversi Lattobacilli così isolati (L. salivarius) si mostrano in grado di superare la barriera acida dello stomaco. 9
Essere resistente alla bile Gli acidi biliari vengono prodotti nel fegato dal colesterolo e secreti nel duodeno dalla cistifellea. Gli acidi biliari mostrano attività anti-batterica inibendo la crescita in vitro di E. coli, Enterococcus sp., Klebsiella sp. I ceppi di cui si vuole stabilire la capacità probiotica vengono cresciuti in presenza di diverse concentrazioni di sali biliari (0.3-7.5%). Le piastre vengono incubate a 37 C in condizioni anaerobiche ed osservate dopo 24-48 h. Vengono ulteriormente caratterizzati i ceppi in grado di crescere in presenza di concentrazioni fisiologiche di sali biliari. Essere capace di aderire alle cellule epiteliali dell intestino Prerequisito fondamentale è la capacità di aderire al tessuto epiteliale intestinale. L adesività dei ceppi in esame viene valutata in vitro utilizzando linee cellulari eucariotiche (Caco-2, HT29) in grado di riprodurre le caratteristiche morfologiche e fisiologiche degli enterociti umani. L adesività viene misurata rispetto ad un ceppo di controllo ben caratterizzato (L. rhamnosus GG-LGG). Produrre sostanze antimicrobiche Diversi composti metabolici prodotti dai batteri lattici mostrano attività antimicrobica (acidi organici, acidi grassi, batteriocine). I ceppi isolati da campioni di tessuto umano vengono testati per la loro capacità di produrre sostanze antimicrobiche, contro diversi batteri indicatori: Listeria, Bacillus, Entercoccus, Staphylococcus, Clostridium, E. coli, Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus. Si osserva su piastra la comparsa di un alone di inibizione della crescita del batterio indicatore, intorno alla colonia del potenziale probiotico. 10
Sui ceppi selezionati sulla base delle caratteristiche sopra descritte possono essere effettuati dei test in-vivo, prima su sistema murino, poi umano, per valutare: La capacità di persistere, anche per brevi periodi, nel tratto gastro-intestinale Viene testata la sopravvivenza al transito attraverso il tratto gastrointestinale, somministrando una quantità nota di cellule a topi e contando il numero di cellule prodotte nelle feci ed il tempo di escrezione. La capacità di modulare la risposta immunitaria Mostrare resistenza a diversi processi tecnologici (vitalità ed attività nei mezzi utilizzati per la somministrazione) Probiotici Patogeni invasivi - Formano una barriera protettiva - Producono sostanze che inibiscono la crescita dei patogeni e stimolano il sistema immunitario - Contribuiscono alla digestione dei micronutrienti - Sintetizzano vitamine e nutrienti - Riducono il colesterolo - Contribuiscono a mantenere le normali funzioni intestinali - Producono sostanze tossiche - Possono invadere le cellule epiteliali della mucosa - Possono causare un danno cellulare massivo - Possono invadere altri tessuti e organi - Abbassano le difese immunitarie - Peggiorano le condizioni generali dell intestino 11
EFFETTI DEI PROBIOTICI - Prevenzione e trattamento delle infezioni intestinali - Diarrea infantile sostenuta da rotavirus - Diarrea associata all assunzione di antibiotici, infezioni del tratto gastrointestinale dovute alla prevalenza di patogeni opportunisti; l instaurarsi di una infezione sostenuta da Clostridium difficile o la proliferazione eccessiva di Candida albicans sono spesso associate ad un trattamento prolungato con antibiotici. La somministrazione di probiotici si è rivelata utile sia nel trattamento che nella prevenzione di questi problemi. - Diarrea del viaggiatore da ceppi enterotossigenici di E. coli - Gastriti associate alla presenza di Helicobacter pylori Studi in vitro hanno dimostrato la capacità di L. acidophylus e L. rhamnosus di inibire Helicobacter - Costipazione; -Allergie ad alcuni alimenti: evidenze che enzimi prodotti da L. rhamnosus contribuiscono alla degradazione di antigeni rendendoli non allergenici -Modulazione del sistema immunitario: diverse specie di lattobacilli e bifidobatteri aumentano la produzione di IgA - Intolleranza al lattosio; Diverse evidenze suggeriscono che la dieta svolge un ruolo significativo nell eziologia del cancro del colon. Studi recenti hanno dimostrato come l equilibrio della flora endogena possa essere considerato un valido sistema di prevenzione. Un ampio consumo di Lattobacilli e Bifidobatteri può essere infatti correlato ad una bassa incidenza di cancro del colon. I meccanismi con cui i probiotici esercitano questa funzione possono essere diversi e non ancora ben conosciuti: - alterazione delle condizioni fisico-chimiche nel colon; - capacità di degradare potenziali sostanze cancerogene; - produzione di sostanze antitumorigene e antimutageniche; - stimolazione del sistema immunitario dell ospite. 12
MECCANISMI DELL ATTIVITA PROBIOTICA EFFETTI BIOCHIMICI BATTERIOCINE proteine o complessi proteici prodotte da una specie batterica con effetto antagonistico su specie strettamente correlate al batterio produttore ACIDI GRASSI A CATENA CORTA COMPETIZIONE PER I NUTRIENTI metaboliti di Lattobacilli e Bifidobatteri il cui accumulo riduce il ph inibendo la crescita di patogeni e batteri potenzialmente pericolosi ADESIONE ED AGGREGAZIONE A LIVELLO DELLA MUCOSA INTESTINALE: AggH proteina di superficie isolata da L. reuteri un ceppo capace di autoaggregazione ACIDI LIPOTEICOICI sono coinvolti nell adesione di L. johnsonii alle cellule Caco-2 Mub adesina che consente l adesione di L. reuteri al muco S-layer struttura proteica costituita da un unica proteina organizzata in monostrato che riveste la cellula batterica 13
LATTOBACILLI - Bacilli Gram+, non formano spore, generalmente immobili. - Possono essere divisi in sottogruppi sulla base della via che utilizzano per fermentare il glucosio (omofermentanti o eterofermentanti) - Costituiscono la lora batterica dominante dei foraggi insilati, hanno un ruolo fondamentale nella produzione di formaggi, di salumi, nel settore enologico - Sono una componente fondamentale della flora batterica del tratto gastrointestinale di tutti gli animali a sangue caldo -Sono microrganismi GRAS (Generally Regarded as Safe) Lactobacillus acidophilus BIFIDOBATTERI - Costituiscono un genere separato sulla base della loro morfologia, biochimica, costituenti della parete cellulare composizione del DNA; - Bacilli GRAM+, non formano spore, costituiscono fino al 25% della microflora endogena del tratto gastrointestinale; - Contribuiscono sensibilmente ai processi fermentativi dei carboidrati nel colon. Insieme ai Lattobacilli sono i primi colonizzatori del tratto intestinale alla nascita. La flora endogena si diversifica nel tempo anche grazie all esposizione ad altri alimenti. Compaiono Clostridi, Bacteroides, Enterobatteri, Streptococchi. 14
LC1 un latte fermentato contiene il ceppo Lactobacillus johnsonii LA1 - A seguito dell assunzione di un latte fermentati contenente L. johnsonii il numero di lattobacilli presenti nelle feci aumentava fino a dieci volte - Studi in vitro hanno dimostrato la capacità di L. johnsonii di impedire l adesione di diversi patogeni come E. coli (EPEC), Yersinia pseudotubercolosis, S. typhimurium - In seguito al consumo si è osservata nel sangue un aumento della attività fagocitaria - Il brodo di coltura di L. johnsonii ha dimostrato in vitro un effetto battericida nei confronti di Helicobacter pylori, un latte fermentato contenente L. johnsonii è in grado di diminuire la densità di colonizzazione e l infiammazione nello stomaco Bacillus subtilis COME PROBIOTICO Spore di B. subtilis sono da molti anni in commercio come probiotico ENTEROGERMINA - l utilizzo delle spore come probiotici non è limitato al consumo umano, ma è esteso anche all allevamento di pollame in sostituzione degli antibiotici - la somministrazione orale di spore è in grado di prevenire tutti gli aspetti dell infezione quando i polli vengono infettati con un ceppo enteropatogeno di E. coli Studi recenti hanno esaminato la composizione di diversi preparati probiotici attualmente in commercio, rivelando una scarsa rispondenza delle specie presenti rispetto alle indicazioni del prodotto 15
ALIMENTI PROBIOTICI Accanto al latte fermentato e allo yoghurt, alimenti noti per le loro proprietà probiotiche, sempre maggiore attenzione è rivolta alla produzione di alimenti che possano fungere da veicoli di specie probiotiche: - Ceppi produttori di batteriocine vengono utilizzati per la produzione di formaggi che risultano quindi naturalmente protetti dalla proliferazione di specie patogene - Produzione di formaggi (Cheddar) con ceppi di Lattobacilli (L. salivarius e L. paracasei) isolati dall uomo e caratterizzati per le loro potenzialità probiotiche. I dati dimostrano che il Cheddar così ottenuto può essere utilizzato per somministrare probiotici al consumatore. 16