Tecniche Centrifugative Metodologie Biochimiche 29 Novembre 2015 Il materiale contenuto in queste diapositive è ad esclusivo uso didattico per l università di Teramo
Centrifugazione Permette la separazione meccanica di materiali solidi dal liquido e di materiali solidi tra loro sottoponendoli ad una forza centrifuga. Materiali di FORMA, DIMENSIONI, DENSITÀ diversa, posti in un campo centrifugo, sedimentano con velocità diversa Utile per la separazione delle biomolecole e degli organuli cellulari. cellule organuli subcellulari macromolecole
Differenze tra le centrifughe: Velocità max alla quale sono sottoposti i campioni, Presenza o assenza di vuoto Possibilità di regolare la temperatura Volume massimo dei campioni e dei singoli tubi Esempi di centrifughe disponibili in commercio: Centrifughe preparative di grandi capacità e basse velocità Centrifughe preparative refrigerate e ad alta velocità Ultracentrifughe analitiche Ultracentrifughe preparative Centrifughe per uso chimico su larga scala Microcentrifughe da laboratorio
Centrifughe e loro utilizzo Piccole centrifughe da banco. Generalmente la loro velocità massima è tra 4.000 e 6.000 rev min 1 Microcentrifughe. 8.000-13.000 rev min 1 Centrifughe preparative da banco 6.000 rev min 1 Centrifughe refrigerate ad alta velocità 25.000 rev min 1 Ultragentrifughe 60.000-70.000 rev min 1
Centrifughe Microcentrifuga Camera d acciaio Rotore Ultracentrifuga Centrifuga Pompa a Refrigerazione Motore vuoto
Tipi di rotore I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra rmax e rmin Il tempo richiesto per la sedimentazione è minore per rotori ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso A BRACCI OSCILLANTI AD ANGOLO FISSO AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE
Quando si mette a punto un protocollo di centrifugazione è necessario ricordare > è la densità di una struttura biologica, > è la sua velocità di sedimentazione. > è la massa di una particella biologica, > è la velocità con cui essa si muove nel campo > è la densità del sistema tampone biologico, < sarà la velocità di movimento di una particella > è il coefficiente frizionale, < è la velocità > è la forza centrifuga, > è la velocità di sedimentazione densità particella = densità del mezzo velocità di sedimentazione è uguale a zero
Preparativa: permette di separare e purificare cellule intere, organuli subcellulari e macromolecole biologiche come acidi nucleici e proteine. Le tecniche centifugative Analitica: permette di studiare le caratteristiche di sedimentazione del campione e di determinare il grado di purezza o la massa molecolare. Richiede quantità minime di materiale e utilizza rotori e sistemi di rilevamento più sensibili e molto più costosi.
CENTRIFUGAZIONE PREPARATIVA CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE Si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle con diversa forma e densità Il materiale è separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato Si tratta di una metodica adoperata per l'isolamento degli organuli cellulari a partire da omogenati di tessuto SOVRANATANTE SOVRANATANTE SOVRANATANTE 600 g 1 25,000 g 2 100,000 g 3 300,000 g CITOSOL 10 min 10 min 60 min 120 min OMOGENATO (filtrato per rimuovere le cellule non lisate) PELLET 1 Nuclei PELLET 2 Mitocondri Cloroplasti PELLET 3 Microsomi Poliribosomi PELLET 3 Ribosomi Virus Lisosomi Perossisomi Frammenti di membrane Grandi Macromolecole
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA Il gradiente di densità può considerarsi come una colonna di una soluzione in cui la densità è crescente man mano che si ragginge il fondo della provetta. Caratteristiche del gradiente di densità: Riduce al minimo le perturbazioni dovute ai moti convettivi, evitando il rimescolamento. Permette di separare particelle con dimensioni simili con diversa densità.
Realizzazione dei gradienti Soluti usati: Sali di metalli pesanti (Cloruro di Cesio) Molecole organiche (Glicerolo e Saccarosio) Polimeri (Ficoll, Percoll, Destrano) Sostanze ad alto peso molecolare Forma dei gradienti: CONTINUI Mediante un formatore di gradiente Usato per esempio per isolare proteine, acidi nucleici DISCONTINUI Mediante stratificazione della soluzione concentrazione e densità crescente Usato per esempio per isolare virus e ribosomi
Metodi di centrifugazione in gradiente di densità ZONALE ISOPICNICA La Centrifugazione Zonale Sfrutta le differenze di dimensione e forma delle particelle. Le particelle sono stratificate alla sommità del gradiente. Sotto l azione della F.C. le particelle si disporranno in zone del gradiente contenenti ciascuna particelle con stessa velocità di sedimentazione. La separazione dipende dal tempo (se si centrifuga per molto tempo le particelle si stratificano tutte sul fondo essendo la densità del gradiente inferiore alla densità delle componenti da separare). La corsa deve essere terminata prima che ogni particella raggiunga il fondo del tubo altrimenti si ha un rimescolamento delle frazioni stesse.
Centrifugazione zonale All inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.
La Centrifugazione Isopicnica (isodensità) o della densità all equilibrio Sfrutta la densità delle particelle (e non la forma o la dimensione) Il gradiente comprende tutti i valori di densità delle particelle da separare. La particella si arresterà nella zona del gradiente la cui densità è pari a quella della particella. È una separazione dipendente solo dalla differenza di densità e non dal tempo. A volte il gradiente non è preformato ma si forma per effetto della F.C. sulle molecole del soluto. Gradienti continui e discontinui. Es. Separazione diverse forme di DNA in base alla diversa densità specifica (esperimento di Meselson e Stahl)
Centrifugazione isopicnica con gradiente All inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A), durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del gradiente uguale alla loro.
Coefficienti di sedimentazione delle principali strutture biologiche: Proteine 2-25 S Acidi nucleici 3-100 S Virus 40-1000 S Lisosomi 4000 S Mitocondri 20 X 10 3 70 X 10 3 S Membrane 100 X 10 3 S Nuclei 4000 X 10 3-40000 X 10 3 S coefficiente di sedimentazione S = Svedberg = 10-13 sec. Il coefficiente di sedimentazione è espresso in secondi e dipende dalla temperatura, dalla densità e dalla viscosità della soluzione. Poiché gli studi di velocità di sedimentazione vengono condotti impiegando svariati sistemi soluto-solvente, per convenzione si usa correggere il coefficiente di sedimentazione trovato sperimentalmente in quel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui densità e viscosità fosse pari a quello dell'acqua a 20 C:
Organello Diametro (mm) Densità (g/cm 3 ) Nucleo 5-10 1.40 Mitocondrio 1-2 1.18 Lisosoma 1-2 1.13 Ribosoma 0.02 1.61 Organelli 1.09 1.11 1.15 1.19 100,000 g Lisosomi (1.13) Mitocondri (1.18) Densità 1.22 1.25 4 ore (all equilibrio) Perossisomi (1.23)
ESERCITAZIONE: Isolamento di mitocondri da fegato bovino mediante centrifugazione in gradiente di densità Materiali Pinzette d acciaio e bisturi Piastra petri da 100 mm Pipette da 5 e 10 ml Tubi da centrifuga 6 Falcon da 15 ml Omogeneizzatore elettrico Garza chirurgica Imbuto di vetro Micropipette e puntali Pasteur di vetro e di plastica Reagenti Saccarosio TES EGTA 1M KOH Percoll 100% Cocktail inibitori delle proteasi
Soluzioni da preparare il giorno prima dell esperimento Buffer PERCOLL (BP) in H 2 O bd. (250 ml) 300 mm Saccarosio (PM: 342.3) 10 mm TES (PM: 229.2) 0.2 mm EGRA (PM: 380.35) Portare a ph 6.8 con KOH 1M Soluzione 46% (w/v) di Saccarosio in BP (100 ml) Buffer di Omogeneizzazione (HBM) in H 2 O bd (250 ml) 300 mm Saccarosio (PM: 342.3) 5 mm TES (PM: 229.2) 0.2 mm EGTA (PM: 380.35) Portare a ph 7.2 con KOH 1M
Soluzioni da preparare il giorno prima dell esperimento SOLUZIONE A (2.28% Saccarosio) Soluzione 46% di Saccarosio in BP 20X 2.28% (w/v) 10 ml : 500 µl di Soluz. 46 % Saccarosio in BP 9.5 ml di BP SOLUZIONE B (4.4% Saccarosio) Soluzione 46% di Saccarosio in BP 10.45X 4.4% (w/v) 10 ml : 957 µl di Soluz. 46 % Saccarosio in BP 9.043 ml di BP SOLUZIONE C (4.4 % Saccarosio) Soluzione 46% di Saccarosio in BP 3X 15.3% (w/v) 10 ml : 3.3 ml di Soluz. 46 % Saccarosio in BP 6.7 ml di BP
Il giorno dell esperimento preparare le seguenti soluzioni: Soluzione A* (10 ml) 8.2 ml di soluzione A + 1.8 ml di Percoll (100%) 18% (v/v) Soluzione B* (10 ml) 7 ml di soluzione B + 3 ml di Percoll (100%) 30% (v/v) Soluzione C* (10 ml) 4 ml di soluzione C + 6 ml di Percoll (100%) 60% (v/v)
Procedura Controllare che la centrifuga sia accesa e verificare che sia inserito il rotore ad angoli fisso. Aggiungere il cocktail di inibitori delle proteasi (100X) a 15 ml di HBM Sminuzzare il fegato in piccoli pezzi nella piastra petri tenuta in ghiaccio Addizionare i pezzetti di fegato nel potter in cui sono stati aggiunti precedentemente 5 ml di HBM Omogeneizzare a velocità 7 (circa 20 srokes) Aggiungere altri 10 ml di HBM Filtrare l omogenato attraverso 4 strati di garza da chirurgia con un imbuto di vetro Dividere l omogenato in 2 tubi da 15 ml Centrifugare a 760xg, per 10 min Recuperare il surnatante e scartare il pellet Centrifugare a 8740xg, per 10 min
Nel frattempo preparare i tubi con gradiente di Percoll discontinuo: aggiungere con una pasteur prima 4 ml di soluzione C*, poi 4 ml di B* ed infine 4 ml di A*. Dopo la seconda centrifugata, recuperare il pellet e risospenderlo in 350 µl di HBM Caricare il pellet risospeso con HBM nei tubi conteneti il gradiente Centrifugare a 8740xg, per 10 min a 4 C Recuperare i mitocondri nell interfaccia tra A* e B*con una pasteur di vetro. Unire i mitocondri recuperati a 10 ml di HBM in ghiaccio Centrifugare a 6800xg, per 10 min Risospendere il pellet in 500 µl di HBM in ghiaccio I mitocondri estratti potranno essere a questo punto utilizzati per altre indagini sperimentali!
R C F = Forza Centrifuga Relativa F orza centrifuga Forza gravità m ω 2 r m g ω 2 r g R C F Ci dice di quante volte l accelerazione a cui è sottoposta una particella è più grande della forza di gravità Sostituendo: g = 980 cm s -2 ω = 2π rpm 60 R C F 4π 2 3600 rpm 2 r 980 cm/sec 2 R C F 1,118 10-5 rpm 2 r
Esercizi: Calcolare i grammi di Saccarosio, TES e EGTA per preparare 500 ml di Buffer Percoll. 300 mm Saccarosio (PM: 342.3) 10 mm TES (PM: 229.2) 0.2 mm EGRA (PM: 380.35) Calcolare il campo centrifugo relativo (RCF) esercitato nella parte alta e nella parte bassa di una provetta da centrifuga posta in un rotore ad angolo fisso, assumendo che le dimensioni del rotore siano: il raggio minimo (r min ) di 3 cm e il raggio massimo (r max ) di 7cm, assumendo che il rotore giri ad una velocità di 10000 rpm.