ATOMIC FORCE MICROSCOPY (AFM)
Scanning probe microscopy Strumenti basati sulla interazione a corto raggio Costruiscono un immagine del campione in osservazione attraverso l interazione di una sonda con gli strati atomici superficiali microscopia di superficie Scanning Tunneling microscopy (STM) Atomic Force Microscopy (AFM) Binnig and Rohrer 1982 Binnig, Quate and Gerber (1986) (Nobel prize in 1986)
STM Utilizza la corrente di tunnel tra punta e campione conduttore AFM Utilizza la forza di interazione tra gli atomi Metalli Semiconduttori Molecole biologiche (es. DNA) Strutture non periodiche Materiali sia isolanti sia conduttori Alta versatilità Semplicità di utilizzo Alta risoluzione (0.1Å verticale, 1.0Å laterale) Non distruttività Nessuna preparazione del campione
FORZE COINVOLTE Forze separazione punta-campione: 10-13 N - 10-6 N Forze di Van der Waals (di dispersione) Repulsione ionica Forze di attrito Forze di adesione Forze elettrostatiche Forze magnetostatiche Tra due atomi uniti da legame covalente alla distanza di ~0.1 nm agisce una forza di circa 10-9 N Le misure eseguite con l impiego dell AFM non sono distruttive.
Un microscopio a forza atomica è costituito da: sensore a fotodiodo registra i movimenti del raggio laser in rapporto a quelli del cantilever sensore a leva (cantilever) risente delle interazioni con il campione Servocontrollo (feedback) regola la distanza tra superficie della punta e campione in base al sistema di acquisizione scanner piezoelettrico che consente di muovere il campione in tutte e tre le direzioni
Principio di funzionamento
Piezoscanner (PZT) Elettrodi esterni A) B) Elettrodo interno A) Potenziale applicato tra i quattro elettrodi esterni e quello interno B) Potenziale applicato tra due elettrodi esterni e quello interno
DETECTOR Posiziona il laser sulla punta Massimizza l intensità del laser
PUNTE a) c) b) a) punta normale (normal tip), costituita da una piramide schiacciata alta ~3 µm con raggio di curvatura di ~30 nm b) superpunta (supertip), prodotta mediante bombardamento elettronico di una punta normale. La superpunta è più lunga e sottile di una punta normale ed ha anche un migliore raggio di curvatura c) ultralever, ancora più sottili e lunghe (100 µm) delle superpunte e possono avere raggi di curvatura fino a ~10 nm. Le più diffuse sono la punta standard di nitruro di silicio (Si3N4) e le punte di silicio.
PUNTE Punte di nitruro di silicio piramidali o tetraedriche
PUNTE La necessità di ricoprire la punta si basa essenzialmente su tre motivi: la punta non ricoperta è ricca di gruppi silanolici liberi che potrebbero adsorbire contaminanti capaci di alterare la composizione della superficie senza copertura la punta è molto più fragile e tende a rovinarsi con un suo uso prolungato impedendo di usare la punta per un elevato numero di analisi poiché la superficie è altamente idrofila essa potrebbe alterare l equilibrio del campione soprattutto in campioni particolarmente delicati come quelli biologici
Copertura delle punte Tiolialcani: copertura con cromo seguita da ricopertura in oro funzionalizzato con gruppi alchiltiolici che possono essere variamente modificati. La ricopertura in metallo aumenta notevolmente lo spessore della punta riducendo la risoluzione dello strumento Organosilani: interagiscono direttamente con i gruppi OH con la formazione di un film protettivo costituito da una rete di legami Si-O-Si. Questo metodo protegge la punta senza bisogno di ricorrere alla ricopertura con metalli. Particelle colloidali: Il metodo più diffuso consiste nel ricoprire la punta direttamente con microsfere di silicone
CANTILEVERS I cantilevers sono lunghi alcune centinaia di µm La costante elastica (k) dei cantilevers deve essere inferiore a quella di un sistema di atomi in un solido (~ 10 N/m). 10-3 < K < 10 N/m Essa dipende da forma, dimensioni e materiale Cantilevers più spessi e corti sono più rigidi ed hanno frequenze di risonanza più alte (range 1-100 Hz)
Modalità di lavoro Contact mode-forze repulsive (pochi Å) force mode (punta ad altezza costante) segnale dal piezoelettrico deflection mode (punta ad altezza costante) segnale dal fotodiodo height mode (punta ad oscillazione costante) Non-contact mode-forze attrattive la punta è mantenuta a distanza (tra 5 e 15 nm) dal campione e oscilla secondo forze di attrazione del campione stesso Tapping mode la leva è fatta oscillare vicino a frequenza di risonanza in modo che abbia contatto transiente con la superficie del campione
Curva forza-distanza Nel contact mode, la leva è mantenuta a distanza inferiore a pochi angstroms dalla suoerficie del campione e la forza di interazione è di tipo repulsivo. Nel non-contact mode, il cantilever è mantenuto alla distanza di 10-100 angstroms dal campione e la forza di interazione è di tipo attrattivo. Diagramma dell andamento di energia potenziale tra campione e sonda
Contact mode E modalità più utilizzata e richiede cantilever morbidi. FORZE IN GIOCO: Forza repulsiva di Van der Waals Forze capillari attrattive Forza esercitata dal cantilever (dipende da costante di elasticità)
Contact mode: altezza costante Distanza mantenuta costante: è misurata la forza necessaria per mantenere la leva ad altezza costante ALTA PROBABILITA DI DANNEGGIAMENTO PUNTA E CAMPIONE
Contact mode: oscillazione (o forza) costante Ampiezza di oscillazione mantenuta costante: è misurata la forza necessaria per mantenere costante la deflessione della leva E misurata la forza di interazione tra superficie e punta
Lateral force AFM (LFM) Le forze laterali di attrito (frizione) determinano torsione della punta
Contact Mode AFM Vantaggi: - Alta velocità di scansione - risoluzione atomica - facilità di scansione di campioni con molti cambiamenti nella topografia verticale Svantaggi: - Forze laterali possono distorcere l immagine - Forze capillari dovute ad uno strato fluido possono causare notevoli impedimenti alla interazione sonda-campione - La combinazione di queste forze riduce la risoluzione spaziale e può causare danno di campioni più morbidi
Non-contact mode Forze misurate più deboli di quelle misurate in modalità contact Distanza punta-campione 10-100 Å Alla punta viene applicata una piccola oscillazione vicina a frequenza di risonanza 100-400 khz Oscillazione del cantilever dipende da frequenza di risonanza, da costante elastica e da forza di repulsione Le deboli forze in gioco vengono misurate analizzando i cambiamenti in ampiezza, fase e frequenza delle oscillazioni della punta.
Non-contact Mode AFM Vantaggi: -Sulla superficie del campione è esercitata una debole forza e non è recato danno ai campioni più morbidi -Ideale per lo studio di materiali elastici -Vengono eliminate le forze di attrito Svantaggi: - Bassa risoluzione laterale, limitata dalla separazione punta-campione - Velocità di scansione più bassa per evitare il contatto con lo strato fluido - Solitamente applicabile a campioni estremamente idrofobici, ricoperti da un minimo strato fluido
Tapping mode E una specializzazione del non-contact mode: Modalità complementare fra Contact AFM e Non-Contact AFM La punta oscilla entrando anche in contatto con la superficie del campione
Tapping mode
Tapping mode Diverso materiale
Tappping Mode AFM Vantaggi: - Elevata risoluzione laterale (1 nm to 5 nm). - Bassa forza di interazione e minore danno a campioni morbidi in aria. - Assenza di forze laterali Svantaggi: - Velocità di scansione più bassa rispetto al contact mode
APPLICAZIONI Studio di superfici cellulari Struttura di aggregati proteici Studio di legami ligando-recettore Struttura di acidi nucleici
Voltaggio di deflessione cantilever FORZE ADESIVE DI CONTATTO 3 2 surface 4 Approach Retract 1 ADHESION or pull-off force Distanza di separazione 1) a larghe distanze tra punta e campione non ci sono interazioni tra i due 3 1 Lontano dalla superficie 2) muovendo il campione verso la punta si evidenziano interazioni tra i due che si riflettono nel movimento della leva e della punta Attrazione alla 2 superficie 3) avvicinando ulteriormente il campione la leva si flette Cantilever si flette 4) allontanando il campione dalla punta la leva si deflette a causa delle forze di adesione tra i due fino al distacco 4 Rilascio
Se non sussistono interazioni di adesione tra campione e punta all avvicinarsi del campione alla punta non si registrano forze di adesione e si assiste solo alla flessione della leva dovuta alla semplice pressione del campione sulla punta ma non si verifica nessun fenomeno di flessione della leva allontanando il campione.
A B Superficie di spore dormienti (A) e germinative (B) di Aspergillus Oryzae Saccharomyces cerevisiae 50 nm 50 nm Superficie di spore di Aspergillus nidulans Superficie di conidi di Ceratocystis fimbriata 200nm
Funzionalizzazione di punte anticorpi recettori enzimi La deflessione misura la forza di legame
Biotinylated proteins were separated by electrophoresis and fixed with crosslinking chemicals on the gel, followed by direct force measurement between the biotinylated proteins on the gel and a streptavidin-modified tip of an AFM cantilever.
Funzionalizzazione con streptavidina della punta AFM ricoperta d oro utilizzando PEG come cross-linker PEG cross-linking Thiol solution Streptavidin derivatization
BSA Immagine di sezione di gel colorato con Coomassie Brillant Blue 500ng di BSA-Strept sono stati applicati in SDS PAGE
Curve di forza contr no-inter Calibrazione dello strumento adesione singola forza di attrazione multipla forza di attrazione
Results Force curves analyzed on the various conditions of gel surfaces; on gels containing biotinylated BSA (A),on gels containing biotinylated BSA ininhibition condition (B), on gels containing normal BSA (C), and on normal gels (D). Approach and release curves are shown in gray and black color,respectively.
Results Comparison of unbinding force distribution. Histogram of unbinding force on normal gel (graydashedlines), on the gel containing BSA (graylines) and on the gel containing biotinylated-bsa (blacklines). Specified amounts of proteins were applied for gel electrophoresis, such as 500ng for (A) and (B), 500 pg for (C) and 5pg for (D). As a negative control experiment, free biotin was added in the experimental buffer for force measurement to make the histogram of (B).
Results Comparison of the detection limit of proteins with different methods. Scanned images and optical density profiles of CBB and silver stained electrophoresis gel (A), and stained dot-blot (B). The f 100 ratio values in our proposed method (C). The frequency to obtain an interaction force larger than 100pN was divided by the total frequency to obtain an interaction force to get f 100 ratio values.
Le proteine Munc-18-1, SH3 e PX sono state ottenute come fusione con GST Le punte ed il supporto sono derivatizzati con GSH Phox homology domain (PX)