ISTRUZIONI PER L'USO TERRENI SU PIASTRA PRONTI ALL'USO PA-257303.04 Rev.: Sep 2011 USO PREVISTO è un terreno selettivo per l'isolamento di microrganismi Gram-positivi da materiali clinici e non clinici. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodo microbiologico. Ellner et al. nel 1966 hanno elaborato un preparato a base di agar sangue, che è stato denominato agar Columbia. 1 Questo terreno, caratterizzato da colonie più estese e crescita più rigogliosa rispetto ad altre basi agar sangue, è utilizzato per terreni contenenti sangue e preparati selettivi. Ellner et al. hanno scoperto che un terreno contenente 10 mg di colistina e 15 mg di acido nalidixico per litro su base agar Columbia, arricchito con sangue di montone 5%, supporta la crescita di stafilococchi, streptococchi emolitici ed enterococchi, mentre inibisce la crescita di Proteus, Klebsiella e Pseudomonas. 1-3 Nel corso degli anni, la resistenza dei batteri agli antibiotici è aumentata. Ciò è vero in particolare per i bacilli Gram-negativi che dovrebbero essere inibiti, ma spesso producono crescita, sull'agar Columbia CNA con 5% di sangue di montone. Per assicurare una buona selettività di questo terreno, BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood, Improved è stato supplementato con una piccola quantità di aztreonam, un monobattame che agisce unicamente contro la maggior parte dei batteri gram-negativi, senza influenzare i microrganismi gram-positivi. 4-6 Nel BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood, Improved II, la concentrazione di acido nalidixico è stata ridotta a 5,5 mg/l per aumentare il recupero di cocchi gram-positivi, soprattutto stafilococchi, dai campioni clinici L'agar Columbia fornisce un terreno con una base altamente nutritiva. L'aggiunta degli agenti antimicrobici, colistina, acido nalidixico e aztreonam, rende il terreno selettivo per i microrganismi Gram-positivi, streptococchi e stafilococchi in particolare. Il sangue di montone consente di rilevare le reazioni emolitiche, che sono particolarmente utili per la diagnosi presuntiva degli streptococchi. 2,3,7-9 REAGENTI Formula* per litro di acqua purificata Digerito pancreatico di caseina 12,0 g Agar 13,5 g Digerito peptico di tessuto animale 5,0 Colistina 10,0 mg Estratto di lievito 3,0 Acido nalidixico 5,5 Estratto di carne bovina 3,0 Aztreonam 3,0 Amido di granturco 1,0 Sangue di montone defibrinato 5% Cloruro di sodio 5,0 ph 7,3 ± 0,2 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento. PRECAUZIONI. Solo per uso professionale. Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento, incrinature o altri segni di deterioramento. Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 8 C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono PA-257303.04 Page 1 of 5
essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana se conservate in luogo pulito a 2 8 C. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL UTENTE Inoculare il terreno con i ceppi elencati in basso. (per ulteriori informazioni, v. ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Incubare a 35 2 C per 18 24 h, in atmosfera aerobica arricchita con anidride carbonica. Ceppi Risultati della crescita Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crescita da buona a eccellente, possibile beta emolisi Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Crescita da buona a eccellente, alfa emolisi Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Crescita da buona a eccellente, beta emolisi Enterococcus faecalis ATCC 29212 Crescita da buona a eccellente Proteus mirabilis ATCC 12453 Inibizione da parziale a completa; nessuna sciamatura Non inoculate Rosso (color sangue) PROCEDURA Materiali forniti (piastre impilate Stacker da 90 mm). Microbiologicamente controllate. Materiali non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie. Tipi di campioni Terreno selettivo universale per l'isolamento di numerosi batteri Gram-positivi in batteriologia aerobica, streptococchi e stafilococchi in particolare, utilizzabile per tutti i tipi di campioni batteriologici (v. anche CARATTERISTICHE METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). Procedura del test Strisciare il campione non appena viene consegnato in laboratorio. La piastra strisciata è utilizzata prevalentemente per isolare le colture pure dai campioni contenenti flora mista. In alternativa, se il materiale in coltura proviene direttamente da un tampone, rotolare il tampone su una piccola area del bordo e strisciare da questa zona inoculata. Per rilevare tutti i patogeni contenuti nel campione, strisciare anche su terreni non selettivi appropriati, come BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood, e su altri terreni selettivi, come BD MacConkey II Agar. 7-10 Incubare a 35 2 C per 42 48 h, in atmosfera aerobica arricchita con anidride carbonica, e controllare le piastre dopo 18 24 h e 42 48 h. Risultati La morfologia tipica delle colonie su BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood, Improved II è la seguente: Streptococchi (non gruppo D) Enterococchi (gruppo D) Stafilococchi Corinebatteri* Candida Listeria monocytogenes Batteri Gram-negativi * V. anche Limitazioni della Prozedura Piccole, da bianche a grigiastre. Beta o alfa emolisi Piccole, ma più grandi degli streptococchi di gruppo A, grigiastre. Alfa (raramente beta) emolisi Grandi, da bianche a grigie o da color crema a giallo, con o senza emolisi Da piccole a grandi, da bianche a grigie o gialle, con o senza emolisi Piccole e bianche Da piccole a medie, grigiastre, con scarsa beta emolisi Da nessuna crescita a tracce di crescita Sul terreno possono crescere anche altri batteri Gram-positivi, non presenti nel precedente elenco (v. anche PRESTAZIONI DELLA METODICA E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). PA-257303.04 Page 2 of 5
PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA è un terreno migliorato utilizzato per l'isolamento e la coltura di numerosi microrganismi Gram-positivi a crescita in aerobiosi, ad es. streptococchi, stafilococchi, corineformi, Listeria spp. e altri. Il terreno è simile all agar Columbia CNA con 5% di sangue di montone, tuttavia, la sua selettività contro i batteri Gram-negativi è migliore. Prestazioni della metodica 11 Nel corso di valutazioni interne delle prestazioni, la crescita di oltre 45 ceppi (isolati clinici e ceppi di raccolta) di batteri gram-positivi appartenenti alle specie indicate nella Tabella 1, è stata testata su (=CNA-II) e comparata a BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood (=CNA). BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood (=COL) è stato usato come terreno di riferimento per la crescita. Le piastre sono state incubate per 18-24 ore in atmosfera aerobica arricchita di CO 2. I ceppi Proteus chinolone-resistenti sono stati completamente inibiti su CNA-II, ma hanno sviluppato una notevole crescita su CNA e COL. Sono stati inoltre testati svariati bacilli gramnegativi (Klebsiella pneumoniae, produttori di beta-lattamasi a spettro esteso, Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa). Nessuno di questi ceppi è cresciuto su CNA-II, mentre alcuni hanno sviluppato una crescita medio - leggera su CNA e tutti hanno prodotto una crescita notevole su COL. Su CNA-II è stato inibito un numero di batteri gram-negativi più elevato rispetto a CNA, mentre l isolamento di batteri gram-positivi è stato identico su entrambi i terreni selettivi o migliori su CNA-II. Su CNA-II, sono stati inoltre testati numerosi ceppi di Staphylococcus aureus che hanno evidenziato una crescita debole su CNA. La crescita sviluppata da questi ceppi su CNA-II è risultata da accettabile a eccellente. Dimensioni delle colonie e zone emolitiche su CNA-II sono risultate comparabili a quelle su COL. Tabella 1: specie Gram-positive analizzate e recuperate su BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood, Improved II (incubazione: aerobica con 5-8% di anidride carbonica) Corynebacterium diphtheriae* Staphylococcus hyicus Streptococcus. milleri Enterococcus faecalis Staphylococcus saccharolyticus** Streptococcus. mitis Enterococcus faecium Staphylococcus saprophyticus Streptococcus pneumoniae Enterococcus durans Staphylococcus schleiferi Streptococcus pyogenes Enterococcus hirae Staphylococcus xylosus Streptococcus sanguis Listeria monocytogenes Staphylococcus warneri Streptococcus group C Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus group F Staphylococcus capitis Streptococcus bovis Streptococcus group G Staphylococcus cohnii Streptococcus constellatus** Staphylococcus epidermidis Streptococcus intermedius * 48 hours incubation needed for detection on CNA-II and on and CNA. ** These are species that grow better when grown anaerobically; anaerobic incubation for 42 to 48 hours needed for detection on and on BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood Sono stati inoltre analizzati sul CNA-II, e confrontati col CNA (incubazione 42-72 ore in atmosfera anaerobica), vari cocchi anaerobi Gram-positivi (Peptostreptococcus e generi correlati). Sebbene la maggior parte dei ceppi del test sia cresciuta su entrambi i terreni, numerosi ceppi hanno prodotto una crescita più debole sul CNA-II che sul CNA. Limitazioni della Prozedura Su questo terreno possono crescere batteri Gram-negativi in grado di resistere agli ingredienti selettivi. Le Candida e gli altri funghi non sono inibiti su questo terreno. Le specie aerobiche che generano spore, come Bacillus spp., pur essendo Gram-positive possono essere inibite su BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood e sul BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood, Improved II. Alcuni corinebatteri e micrococchi crescono soltanto debolmente o non crescono affatto su BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood, Improved II. PA-257303.04 Page 3 of 5
Questo terreno non deve essere usato per l'isolamento di batteri anaerobi obbligati. A questo scopo si consiglia invece di utilizzare BD Schaedler CNA Agar with 5% Sheep Blood o BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood. Il numero e i tipi di specie batteriche che si comportano come agenti infettivi è quanto mai ampio. Pertanto, prima di usare il terreno di routine per microrganismi isolati di rado o descritti di recente, l'utilizzatore deve verificarne l'idoneità coltivando colture pure dell'organismo in questione. Benché sia possibile eseguire alcuni test diagnostici direttamente sul terreno, per un'identificazione completa è necessario effettuare test biochimici e, all'occorrenza, immunologici usando colture pure. 7,9 La base agar Columbia ha un contenuto relativamente alto di carboidrati e quindi gli streptococchi beta-emolitici possono produrre una reazione emolitica verdastra che può essere confusa con l'alfa emolisi. BIBLIOGRAFIA 1. Ellner, P.D., C.J. Stoessel, E. Drakeford, and F. Vasi. 1966. A new culture medium for medical bacteriology. Am. J. Clin. Pathol. 45:502-504. 2. MacFaddin, J. F. 1985. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria, vol. 1, p. 269-275.Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 3. Chapin, K.C., and T.-L. Lauderdale. 2003. Reagents, stains, and media: bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Wood, W., G. Harvey, E.S. Olson, and T.M. Reid. 1993. Aztreonam selective agar for Gram positive bacteria. J. Clin. Pathol. 46: 769-771. 5. Wiedemann, B., and B. A. Atkinson. 1986. Susceptibility to antibiotics: species incidence and trends. In: Lorian, V. (ed.), Antibiotics in Laboratory medicine, p. 962-1208. Williams and Wilkins, Baltimore, USA. 6. von Graevenitz, A. 1986. Use of antimicrobial agents as tools in epidemiology, identification, and selection of microorganisms. In: Lorian, V. (ed.), Antibiotics in Laboratory medicine, p. 723-738. Williams and Wilkins, Baltimore, USA. 7. Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.).2003. Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Ruoff, K.L., R.A. Whiley, and D. Beighton. 2003. Streptococcus. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 9. Isenberg, H. D. (ed.). 1992. Interpretation of aerobic bacterial growth on primary culture media, Clinical microbiology procedures handbook, vol.1, p. 1.6.1-1.6.7. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 10. Thomson, R.B., and J.M. Miller. 2003. Specimen collection, transport, and processing: bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 11. Data on file. 2004. Becton Dickinson GmbH, Heidelberg/Germany. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ REF 257303 Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 REF 257306 Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 120 ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. PA-257303.04 Page 4 of 5
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