RICERCA NEL LATTE DIAGENTI RESPONSABILI DIMASTITI MEDIANTE METODO COLTURALE

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1 J:\ nj lstituto Zooprofilattico Sperimentale METODO DIPROVA crenmoc/ Data emissione Pagina I di 8 RICERCA NEL LATTE DIAGENTI RESPONSABILI DIMASTITI 1. SCOPO E CAO DIAPPLICAZIONE 1.1. Descrive il metodo di routine per la ricerca, nel latte ovino e caprino, di microrganismi responsabili di mastite, mediantesame colturale 1.2. ll metodo non riguarda la ricerca mirata di: o Brucella spp o Listeria monocytogenes o Pseudomonasaeruginosa. Batteri anaerobi e microaerofili per i quali si rimand ai metodi specifici 2. DOCUMENTI DI RIFERIMENTO 2.1 Biblioorafia Quinn P. J., Carter M. E., Markey B. and Carter G. R,: Clinical veterinary microbiology, Ho!t, J.C., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T., Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9'n ed. William & Wilkins, Baltimore Bolzoni G., Benicchio S., Posante M., Boldini M., Peli G., Varisco G. Esame batteriologico del latte. Alcune considerazioni su esecuzioned interpretazione dei risultati e frequenza degli isolamenti. Large Animal Review, 5, Clinical and Laboratory Standards Institute document M35-A2. Abbreviated identification of Bacteria and Yeast Mastitis in dairy production. Current knowledge and future solutions. Edited by F. Hogeveen Wageningen. Academic Publishers Norma ISO 7932:2004. Microbiology of food and animalfeeding stuffs. Horizontal methods for the enumeration of presuntive Bacillus cereus - Colony countechnique at 30 "C Pyorala, S., Taponen, S. Coagulase-negative staphylococci-emerging mastitis pathogens. Vet Microbiol, 2009, 134, Schalm O.W./Carrol E.J./Jain U.C. Le Mastiti della Bovina, Casa editrice Edagricole (Bologna) 3. DEFINIZIONI N.a. RQ 4V\f Approvato: DIRETTORE

2 Pagina 2 di 8 4. PRINCIPIO Il metodo è basato sull applicazione di tecniche colturali classiche che prevedono l inoculo dei campioni in terreni di coltura e la successiva identificazione biochimico-colturale degli isolati. 5. REAZIONI N.a. 6. INTERFERENZE La presenza di microrganismi contaminanti può inficiare il corretto isolamento degli agenti eziologici. 7. REAGENTI E MATERIALI Portaprovette Ansa per batteriologia da 10 µl Piastre di agar al 5% di sangue di montone Piastre di Mannitol Salt Agar (MSA) Piastre di agar MacConkey Piastre di Baird Parker RPF (Rabbit Plasma Fibrinogen) Piastre di agar Cetrimide Piastre di DNAse agar Piastre di agar Sabouraud Piastre di agar MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin agar) Brodo nutritivo Piastre di Agar sangue-bile Piastre di agar sangue-esculina Kit per la colorazione di Gram Soluzione di H 2 O 2 al 3 % Plasma di coniglio con EDTA per test coagulasi libera (es. Coagulase Plasma, BBL) Kit per la ricerca del clumping factor negli stafilococchi (es. Staphylase test, Oxoid) Kit per il test dell ossidasi (es. Bactident Oxidase, Merck)

3 Pagina 3 di 8 Test biochimici multipli per l identificazione microbica (es. API 20E, API 20NE, API Staph, Api Strep, API Aux, API Coryne, API Listeria, biomerieux) Antisieri per gruppo sierologico di Lancefield (es. Streptococcal Grouping Kit, Oxoid) 8. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Na 9. APPARECCHIATURE Becco di Bunsen Microscopio ottico Agitatore Vortex Termostato a 37 ± 2 C Frigorifero a +2 8 C Congelatore Cappa a flusso laminare di classe II 10. CAIONAMENTO E CAIONI PER LE PROVE I campioni devono pervenire in provette sterili prelevati secondo le norme di asepsi; in attesa della semina, possono essere mantenuti in frigorifero per non più di 48 ore; per periodi più lunghi devono essere congelati a temperatura inferiore a -18 C. Dopo la semina conservare il campione in congelatore. 11. PROCEDIMENTO Portare il campione a temperatura ambiente. Agitare il campione al vortex. Prelevare sterilmente un ansata (10 µl) di materiale e seminarla per isolamento su agar sangue e, se necessario, su altri terreni, quali il MSA o MacConkey, utilizzando tutta la superficie disponibile (utilizzare una piastra suddivisa per max 4 campioni). Incubare le piastre in aerobiosi a 37 C per 24-48h. Esaminare la crescita batterica. Considerare positivi i campioni che presentano anche una sola colonia di sospetto patogeno primario, seppure in presenza di altro tipo di

4 Pagina 4 di 8 colonie (es. S. aureo); in presenza di stafilococchi coagulasi negativi, considerare negativi i campioni con un numero di colonie < 5 (500 CFU/ml). Campioni con 2 o più tipi di colonie, non attribuibili a patogeni primari, non vanno considerati come positivi. Procedere,se necessario, all isolamento in coltura pura. Incubare le piastre nelle stesse condizioni della coltura di origine. Allestire, per l osservazione microscopica, un preparato di Gram da una colonia rappresentativa. Osservare il vetrino al microscopio ottico ad immersione con obiettivo 100 e procedere all identificazione nel modo descritto nel seguito. Microrganismi morfologicamente uguali possono essere ritenuti appartenenti allo stesso isolato. Stafilococchi Se si osservano cocchi Gram positivi, effettuare il test della catalasi (Istruzione I ). Cocchi Gram positivi, di forma sferica, in aggregati irregolari, con colonie opache, di color bianco, crema, giallo o giallo-arancio, positivi al test della catalasi, capaci di crescere in Mannitol Salt agar, sono considerati appartenenti al genere Staphylococcus. Inoculare su terreno Baird Parker RPF per evidenziare la produzione di coagulasi libera (per testare contemporaneamente più isolati la piastra può essere suddivisa in settori, max 6). Incubare a 37 C per ore. La produzione di coagulasi è indicata dalla coagulazione/opacità del terreno attorno al microrganismo. Ceppi coagulasi positivi devono essere sottoposti al test del clumping factor (coagulasi legata). o Isolati positivi al test della coagulasi libera e legata sono ritenuti Staphylococcus aureus e sono in genere capaci di dare reazione gialla su terreno MSA. o Isolati positivi al test della coagulasi libera e negativi al test della coagulasi legata sono identificati come Stafilococchi coagulasi positivi. o Isolati negativi al test della coagulasi libera sono identificati come Stafilococchi coagulasi negativi.

5 Pagina 5 di 8 Identificazione più accurata della specie può essere ottenuta, se necessario, con l ausilio di test biochimici aggiuntivi (es. gallerie API). Streptococchi Se in presenza di cocchi Gram positivi, di forma sferica, ovoidale o anche lanceolata, disposti a coppie o catenelle, con reazione negativa al test della catalasi, procedere all identificazione di specie mediante semina su Agar sangue per Camp-test, Agar Sangue-bile e Agar Sangue-esculina. CA ESCULINA BILE Gruppo di Lancefield Streptococcus agalactiae + - ± B Streptococcus uberis ± + - // Streptococcus disgalactiae C Enterococcus spp D Identificazione più accurata della specie può essere ottenuta, se necessario, con l ausilio di test biochimici aggiuntivi (es. con la galleria API Strep e con la ricerca del gruppo di Lancefield). Enterococchi Se in presenza di batteri Gram positivi, di forma sferica, ovoidale o anche lanceolata, disposti a coppie o catenelle, con reazione debole al test della catalasi, procedere all identificazione con la galleria API Strep ed alla ricerca del gruppo di Lancefield. Batteri coryneformi Se si osservano batteri Gram positivi a disposizione corineforme, ovvero bacilli allungati, sottili, diritti o leggermente ricurvi, con estremità affusolate o clavate, disposti singoli, in coppia, in formazioni a V o affiancati a palizzata, eseguire il test della catalasi ed identificare con striscia biochimica multipla per Corynebatteri. Batteri come sopra, a crescita lenta, con emolisi completa su agar sangue, catalasi negativi, possono essere identificati come Arcanobacterium pyogenes.

6 Pagina 6 di 8 Listeria spp. Batteri Gram positivi, con morfologia attribuibile al genere Listeria (corti bacilli di forma regolare con estremità arrotondate, disposti singolarmente o in corte catenelle, o meno spesso in lunghi filamenti, catalasi positivi) devono essere identificati con le gallerie biochimiche specifiche (es. API Listeria). Bacillus spp. Bacilli allungati ( µm), Gram positivi, disposti in coppie o catenelle, provvisti di endospore, catalasi positivi, mobili, anaerobi facoltativi, sono assegnati al genere Bacillus. Identificazione della specie Bacillus cereus: o Subcolturare una colonia in agar sangue e MYP o Incubare le piastre a 30 C in aerobiosi per 24 ore o La presenza di colonie rosa in MYP (assenza di fermentazione del mannitolo), circondate da un alone di precipitato, emolitiche in agar sangue, conferma il Bacillus cereus Batteri Gram negativi Se si individuano bacilli o coccobacilli Gram negativi, procedere al test dell ossidasi (Istruzione I ) e, se necessario, della catalasi (Istruzione I ): Per testare sviluppo e fermentazione del lattosio in agar MacConkey, inoculare una piastra con una colonia in esame ed incubare a 37 C per h. Colonie circondate da un alone rossastro sono lattosio-fermentanti. Colonie emolitiche Gram negative/capaci di crescere in MacConkey/fermentanti il lattosio, possono essere attribuite alla specie Escherichia coli Colonie sciamanti in agar sangue, Gram negative/capaci di crescere in MacConkey/non fermentanti il lattosio, possono essere attribuite al genere Proteus spp. Pasteurella/Mannheimia Colonie grigiastre, non emolitiche, con odore dolciastro, di piccoli coccobacilli ( ), incapaci di crescere in MacConkey, indolo positivi, sono attribuite a Pasteurella multocida.

7 Pagina 7 di 8 Colonie grigiastre, emolitiche, inodori, di bacilli pleomorfi, indolo negativi, capaci di crescere in MacConkey n. 1 (senza cristalvioletto) con colonie piccole, puntiformi, rossastre, sono attribuite a Mannheimia haemolytica. Pseudomonas aeruginosa Bacilli Gram negativi, ossidasi positivi con colonie emolitiche o non, di aspetto metallico o perlaceo, rugose, pigmentate, mucoidi, con odore caratteristico ( concord grapes ), capaci di crescere in agar Cetrimide a 42 ± 1 C, appartengono alla specie Pseudomonas aeruginosa. In tutti gli altri casi, e se necessaria conferma, procedere secondo lo schema seguente: Isolati con ossidasi negativa: identificazione con galleria API 20 E Isolati con ossidasi positiva: identificazione con galleria API 20 NE Miceti/Lieviti Microrganismi con caratteristiche morfologiche attribuibili ai miceti lievitiformi devono essere identificati con una striscia biochimica (es. API 20C Aux) dopo averne confermato lo sviluppo in agar Sabouraud. Mycoplasma spp. Il metodo è in grado di rilevare anche Mycoplasmi eventualmente presenti nel campione, pur non essendo mirato alla loro ricerca. Identificare secondo il metodo specifico. 12. CASI PARTICOLARI I campioni provenienti da animali con mastite clinica o sub-clinica, risultati negativi all esame batteriologico, possono essere sottoposti ad uno dei seguenti trattamenti alternativi: Semina del campione in brodo nutritivo ed incubazione per 18/24 ore o a 37 C prima della coltura sui terreni solidi. Semina di maggiore volume di campione (es. 100 μl). Ciclo di congelamento-scongelamento del campione prima della semina Incubazione del campione a 37 C per h prima della semina Ricerca di microrganismi non previsti dal presente metodo (vedi 1.1)

8 Pagina 8 di PERFORMANCE DEL METODO N. a. 14. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEL RISULTATO: Il risultato della prova è espresso in maniera qualitativa come campione negativo o positivo per i batteri identificati. 15. REGISTRAZIONE DEI DATI Riportare i dati della prova nei documenti di registrazione adottati in laboratorio. 16. CALCOLO DELL INCERTEZZA DI MISURA N.a. 17. RAPPORTO DI PROVA Viene prodotto come previsto dalla sezione 13 del Manuale della Qualità. 18. ALLEGATI N.a. 19. DOCUMENTI CORRELATI N.a. ELENCO REVISIONI REV. DATA PAGINA PARAGRAFO MODIFICHE