SANDRA TORRIANI. Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Verona

Impiego di lieviti autoctoni per la gestione e l ottimizzazione del processo fermentativo del Vin Santo di Gambellara: risultati dell attività di ricerca SANDRA TORRIANI Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Verona Gambellara, 25 Novembre 2013

LE COMPONENTI DELLA QUALITÀ Gambellara, 25.11.2013

IL RUOLO DEI LIEVITI IN VINIFICAZIONE FERMENTAZIONE ALCOLICA TRASFORMAZIONE DI DIVERSE SOSTANZE DEL MOSTO liberazione di composti aromatici da precursori dell uva decarbossilazione acidi cinnamici e formazione vinil ed etil fenoli produzione di SO 2 e di H 2 S CESSIONE DEI PROPRI COSTITUENTI 1 µm (Swiegers et al., 2005) polisaccaridi e mannoproteine lisi della cellula e liberazione del contenuto intracellulare la formazione di un ambiente riducente

LA FERMENTAZIONE SPONTANEA È CARATTERIZZATA DA: dalla presenza di: 1) un numero diverso di lieviti, 2) specie diverse che sviluppano in modo diverso, 3) specie diverse che sviluppano in combinazione o a tempi diversi durante la fermentazione non-saccharomyces Saccharomyces cerevisiae Risultati sono imprevedibili! (Paronetto, 2013)

I VINI DA UVE PASSITE: UNA NICCHIA PARTICOLARE CARATTERISTICHE UVA e VINIFICAZIONE Elevate concentrazioni di zuccheri Ridotta disponibilità di acqua Condizioni stagionali: temperatura PROBLEMATICHE Stress osmotico Elevate concentrazioni di etanolo RISCHI Mancati avvii di fermentazione Elevata acidità volatile Arresti fermentativi SOLUZIONE Lieviti resistenti e/o adattati all ambiente (autoctoni)

LE FERMENTAZIONI SPONTANEE SONO: un serbatoio di biodiversità microbica da cui attingere per isolare nuovi lieviti adattati al processo produttivo, lo studio della biodiversità è il primo passo per individuare lieviti specifici candidati ad essere impiegati in fermentazioni controllate Gambellara, 25.11.2013

OBIETTIVO DEL PROGETTO Studiare la biodiversità della filiera produttiva del Vin Santo di Gambellara per individuare alcuni ceppi di lieviti Saccharomyces e non-saccharomyces autoctoni potenzialmente più idonei per l ottimizzazione del processo fermentativo

UN PROGETTO LUNGIMIRANTE INIZIATO NEL 2009 Studio della biodiversità nella filiera del Vin Santo di Gambellara Analisi di mosto in fermentazione spontanea e di vini di diverse annate Costituzione di una collezione di lieviti autoctoni Identificazione e caratterizzazione tecnologica per individuazione potenziali starter Prove di vinificazione in laboratorio e in cantina Prove di degustazione Selezione lieviti specifici Saccharomyces e non- Saccharomyces

ISOLAMENTO DI LIEVITI DA MOSTI IN FERMENTAZIONE 1. Fermentazioni in cantina (6 aziende) 2. Prove di microvinificazione in laboratorio Produttore Zuccheri totali (g/l) Etanolo (v/v) Acetato (g/l) M F Az. Ag. Menti 331,83 116,17 12,60 1,86 Az. Ag. Cavazza Casa Vin. Zonin C. S. Colli Vicentini Az. Ag. Sordato 387,15 209,96 10,76 1,35 369,14 174,15 11,72 1,11 508,65 354,78 7,91 0,36 486,60 212,27 11,42 1,47 Az. Ag. Dal Maso 329,47 184,86 11,34 1,59

ISOLAMENTO DI LIEVITI DA MOSTI IN FERMENTAZIONE 1. Fermentazioni in cantina (6 aziende) 2. Prove di microvinificazione in laboratorio Analisi microbiologiche Isolamento di 89 lieviti Identificazione Saccharomyces cerevisiae HaeIII

TIPIZZAZIONE DEGLI ISOLATI I II III IV V VI VI I VI II IX X XI XII XIII Multiplex PCR per i microsatelliti Elevata variabilità genetica!! Origine Isolati Ceppi putativi Az. Ag. Menti 12 10 Az. Ag. Dal Maso 13 10 Az. Ag. Cavazza 13 7 Az. Ag. Colli Vicentini 24 14 Az. Ag. Zonin 13 9 Az. Ag. Sordato 14 5 Totale 89 55 XIV XV XVI

Produzione idrogeno solforato Attività ß-glucosidasica Osmofilia (45% e 60%) Alcol tolleranza (12%) Vigore e potere fermentativo in mosto (19 ceppi) Prove di fermentazione in cantina (5 ceppi)

SELEZIONE DI 5 CEPPI DI S. cerevisiae Criteri per la selezione: 1. Origine dei ceppi: - provenienti da diverse Az. Agr. - isolati dalle fermentazioni con mosto tq e in cantina 2. Minore produzione di acido acetico (inferiore a 1,4 g/l) e di schiuma 3. Buon vigore fermentativo (liberazione di CO 2 superiore a 9 g/100 ml ) Ceppo Origine Produzione di etanolo v/v Purezza di fermentazione Glucosio /fruttosio Velocità di fermentazione DMMtq-7 Az. Ag. Dal Maso 15,7 0,088 0,18 0,87 MEMtq-4 SOMtq-6 ZOMtq-5 Az. Ag. Menti Az. Ag. Sordato Casa Vinicola Zonin 14,8 0,083 0,13 0,81 15,2 0,076 0,15 0,83 14,8 0,095 0,14 0,81 Purezza di fermentazione: acido acetico g/l etanolo % Velocità di fermentazione: g di CO 2 per giorno CVMp-3 Az. Ag. Cavazza 13,7 0,095 0,14 0,75

PROVE IN CANTINA (2010) Control CVMp-3 DMMtq-7 MEMtq-4 SOMtq-6 ZOMtq-5 15 l di mosto di uva Garganega, (350 g/l zuccheri), fruttaio Az Zonin Analisi durante la fermentazione: Dominanza del ceppo inoculato Cinetica di fermentazione Produzione di acido acetico DMMtq-7 Ceppo Zuccheri (g/l) Alcol (v/v) Acetato (g/l) MEMTq-6 60,0 16 1,2 SOMtq-6 61,7 16 1,2 CVMp-3 96,7 14 1,2 ZOMtq-5 57,8 17 1,2 DMMtq-7 44,7 17 1,0 Controllo 114,7 13 1,1 g/l! g/l! MEMtq-4 SOMtq-6 400! 18! 350! 16! 14! 300! 12! 250! 10! 200! 8! 150! 6! 100! 4! 50! 2! 0! 0! T 1! T 2! T 3! T 4! T 5! T 6! T 7! T 8! T 9!T 10!T 11!T 12!T 13!T 14!T 15! Time! 400! 350! 300! 250! 200! 150! 100! 50! 0! ZOMtq-5 v/v! g/l! 400! 18! 350! 16! 14! 300! 12! 250! 10! Sugar! 200! Ethanol! 8! 150! 6! 100! 4! 50! 2! 0! 0! T 1! T 2! T 3! T 4! T 5! T 6! T 7! T 8! T 9!T 10!T 11!T 12!T 13!T 14!T 15! Time! 18! 400! 18! 16! 350! 16! 14! 14! 300! 12! 12! 250! 10! 10! 8! 200! 8! 6! 150! 6! 4! 100! 4! 2! 50! 2! 0! T 1! T 2! T 3! T 4! T 5! T 6! T 7! T 8! T 9!T 10!T 11!T 12!T 13!T 14!T 15! 0! 0! T 1! T 2! T 3! T 4! T 5! T 6! T 7! T 8! T 9!T 10!T 11!T 12!T 13!T 14!T 15! v/v! g/l! DMMtq-7 v/v! v/v! g/l! g/l! CVMp-3 400! 18! 350! 16! 14! 300! 12! 250! 10! 200! 8! 150! 6! 100! 4! 50! 2! 0! 0! T 1! T 2! T 3! T 4! T 5! T 6! T 7! T 8! T 9! T 10!T 11!T 12!T 13!T 14!T 15! Time! 400! 350! 300! 250! 200! 150! 100! 50! 0! Control T 1! T 2! T 3! T 4! T 5! T 6! T 7! T 8! T 9! T 10!T 11!T 12!T 13!T 14!T 15! v/v! 18! 16! 14! 12! 10! 8! 6! 4! 2! 0! v/v! Time! Time! Time!

ANALISI FINE FERMENTAZIONE Control CVMp-3 DMMtq-7 MEMtq-4 SOMtq-6 ZOMtq-5 15 l di mosto di uva Garganega, (350 g/l zuccheri), fruttaio Alcoli superiori (mg/l, con tecnica GC-FID) Composti volatili Analisi sensoriale Acetaldeide bassa nel mosto fermentato con il ceppo CVMp-3 Acetato di etile elevato nella fermentazione spontanea (soglia 150 contro 750 mg/l ac. acetico) Ceppi di lievito Composto* MEMtq-4 SONtq-6 CVMp-3 ZOMtq-5 DMMtq-7 Controllo Acetaldeide 60,3 54,5 32,1 49,0 56,8 40,6 Acetato di etile 63,3 62,2 62,7 65,1 57,4 91,1 Acetale 3,8 3,6 2,3 3,4 4,2 2,0 1-Propanolo 23,7 19,2 20,0 20,4 26,3 14,8 2-Metil-1-propanolo 36,8 33,4 29,2 35,7 27,8 31,0 1-Butanolo 0,84 0,81 0,97 0,80 1,36 1,09 2-Metil-1-butanolo 30,4 26,5 26,5 29,1 38,0 25,3 3-Metil-1-butanolo 163,4 126,9 127,5 144,2 163,4 110,4 Lattato di etile 2,0 1,9 1,9 2,2 2,5 2,7 Esanolo 1,8 1,8 2,0 1,8 1,7 1,3

ANALISI FINE FERMENTAZIONE Control CVMp-3 DMMtq-7 MEMtq-4 SOMtq-6 ZOMtq-5 15 l di mosto di uva Garganega, (350 g/l zuccheri), fruttaio Alcoli superiori Composti volatili Analisi sensoriale L analisi SPE-GC-MS ha evidenziato alcune differenze tra le tesi: ß-feniletil etanolo Metionolo 120.000 100.000 1.200 80.000 1.000 800 ppb 60.000 Alcool beta-feniletilico ppb 600 Metionolo 40.000 400 20.000 200 0 MEMtq-4 SOMtq-6 CVMp-3 ZOMtq-5 DMMtq-7 Cont Ceppi 0 MEMtq-4 SOMtq-6 CVMp-3 ZOMtq-5 DMMtq-7 Cont Ceppi

ANALISI FINE FERMENTAZIONE Control CVMp-3 DMMtq-7 MEMtq-4 SOMtq-6 ZOMtq-5 15 l di mosto di uva Garganega, (350 g/l zuccheri), fruttaio Alcoli superiori Composti volatili Analisi sensoriale Principal Component Analysis DMMtq-7 L analisi PCA ha evidenziato marcate e significative differenze tra la fermentazione spontanea e le prove con i lieviti inoculati MEMtq-4 ZOMtq-5 SOMtq-6 CVMp-3 Control

ANALISI FINE FERMENTAZIONE Control CVMp-3 DMMtq-7 MEMtq-4 SOMtq-6 ZOMtq-5 15 l di mosto di uva Garganega, (350 g/l zuccheri), fruttaio Alcoli superiori Composti volatili Analisi sensoriale Elaborazione statistica dei dati di preferenza con il test di Friedman non ha evidenziato nessuna discriminabilità L analisi ha evidenziato differenze tra le tesi: -CVMp-3 più simile al controllo -MEMtq-4 meno complesso e persistente Balance Persistent Body Complex Acid Bitter Fresh fruits 8 6 4 2 0 Sweet Tropical Fruits Dried fruits Herbaceous Spicy Maderizzato Sample 1 (MEMTq-4) Sample (SOMtq-6) Sample 3 (CVMp-3) Sample 4 (ZOMtq-5) Sample 5 (DMMtq-7) Sample 6 (Control)

ISOLAMENTO DI LIEVITI DA VINI DI VARIE ANNATE Classe Azienda Annata 1 Casa Vin Zonin Colli Vicentini Cavazza Menti 2003 2004 2004 2006 2 Dal Maso La Vigna Sordato Cavazza 2003 2004 2004 2006 Selezione di 9 vini sulla base di degustazioni organolettiche di 24 vini di varie annate, provenienti da diversi produttori Analisi microbiologiche isolate 73 colonie di lieviti autoctoni

TIPIZZAZIONE E IDENTIFICAZIONE DEGLI ISOLATI RAPD-PCR con il primer M13 PCR-RFLP della regione 5,8-ITS del rdna Sequenziamento della regione D1/D2 del 26S rdna 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0 ME06 2 ZO03 5 ZO03 1 CA06 CA06 7 3 CA06 2 ME06 5 ZO03 8 ZO03 9 ME06 1 CA06 6 CA06 4 ME06 7 ME06 ME06 6 8 CA06 5 CA06 9 ZO03 3 ZO03 7 CA06 8 ZO03 ZO03 2 6 ME06 3 ME06 9ME06 4 ZO03 SO04 4 4 SO04 7 SO04 SO04 12 2 SO04 11 CA04 5B SO04 23 SO04 3 SO04 13 SO04 27 SO04 SO04 29 28 SO04 CA04 1 17 CA04 EC- 10 1118 LA04 4 LA04 CA04 2 9 LA04 12 LA04 1 CA04 1 LA04 CA04 7 16 SO04 17 LA04 5 LA04 6 LA04 3 CA04 7 LA04 10 CA04 2 CA04 4 CA04 LA04 11 9 LA04 3 CA04 14 CA04 12 CA04 6 CA04 CA04 13 8 LA04 8 CA04 LA04 5V 11 SO04 26 CA04 SO04 15 21 SO04 CA04 22 18 * * * Zygosaccharomyces sp. Z. rouxii P. anomala Z. bailii Candida sp./p. anomala

DISTRIBUZIONE DEGLI ISOLATI NEI VINI Specie Totale isolati Campione Candida sp. / Z. bailii Z. spp. Z. rouxii P. anomala P. anomala Cavazza 2004 13-1 2 2 18 Sordato 2004 2-12 - 2 16 La Vigna 2004 13 - - - - 13 Zonin 2003-9 - - - 9 Menti 2006-9 - - - 9 Cavazza 2006-8 - - - 8 Totale isolati 28 26 13 2 4 73 Non è stato isolato Saccharomyces cerevisiae Specie più riscontrata è stata Z. baillii seguita da Zygosaccharomyces sp. e Z. rouxii Z. bailii Zygosaccharomyces sp.

Zygosaccharomyces sp. Zygosaccharomyces gambellarensis sp. nov.

Dipartimento di Scienze Morfologico-Biomedico, Sezione di Anatomia e Istologia, Università di Verona

CARATTERIZZAZIONE TECNOLOGICA DEGLI ISOLATI 25 ceppi di Z. gambellarensis 13 ceppi di Z. rouxii 28 ceppi di Z. bailii Osmofilia Produzione di acido acetico Alcol tolleranza Vigore fermentativo Tutti osmofili Variabile: Z. bailii alto produttore Variabile: per Z. rouxii inferiore a 8 Z. gambellarensis Z. rouxii Z. bailii

PROVE DI MICROVINIFICAZIONE Mosto di uva Garganega (150 ml) ad alta concentrazione zuccherina (400 g/l); inoculo 10 6 UFC/ml; T=18 C; 76 gg Elenco delle prove (in triplicato): Z. gambellarensis ME06-9 Z. rouxii SO04-27 S. cerevisiae DMMtq-7 3 SINGOLE Z. gambellarensis ME06-9 + Z. rouxii SO04-27 Z. gambellarensis ME06-9 + S. cerevisiae DMMtq-7 Z. rouxii SO04-27 + S. cerevisiae DMMtq-7 3 DOPPIE SCALARI (inoculo dopo 10-13 gg) 1 TRIPLA SCALARE (inoculo dopo 10-13 gg) Z. gambellarensis ME06-9 + Z. rouxii SO04-27 + S. cerevisiae DMMtq-7

CINETICA DI FERMENTAZIONE Visione complessiva delle fermentazioni condotte in laboratorio gco 2 /100 ml giorni

ANALISI A FINE FERMENTAZIONE Analisi chimiche classiche (Foss) Alcoli superiori Composti volatili Metaboliti Forte interazione Etanolo Acetato Glicerina Analisi chimica ZG ZR SC ZG+ZR ZG+SC ZR+SC ZG+ZR+SC Alcol (ml/100 ml) 4,29±0,00 6,86±0,06 11,34±0,09 a 10,58±1,07 a,d 12,44±0,19 b,c 11,79±0,36 a,c 12,16±0,08 c,d Acidità volatile (g/l) 1,04±0,05 1,26±0,01 0,98±0,01 a 1,35±0,07 e 0,77±0,02 c 0,86±0,02 d,b 0,82±0,03 b,c Glicerina (g/l) 6,0±0,1 8,2±0,3 14,6±0,7 a 14,5±0,1 a,e,f, 13,2±0,8 a 12,9±0,3 c,d,f 12,9±0,3 b,d,e

ANALISI A FINE FERMENTAZIONE Analisi chimiche classiche Alcoli superiori (Distillazione-GC-FID) Composti volatili Metaboliti Forte interazione Una concentrazione totale di alcoli maggiore o uguale a 400 mg/l conferisce al vino un aroma pungente o di solvente, mentre concentrazioni attorno ai 300 mg/l donano un aroma fruttato e quindi più piacevole. Alcoli superiori totali 0 50 100 150 200 250 300 350 400 ZG+ZR+SC ZR+SC ZG+ZR ZG+SC SC ZR ZG

ANALISI A FINE FERMENTAZIONE Analisi chimiche classiche β-feniletile acetato Alcoli superiori Composti volatili (HS-SPME-GC-MSD) Metaboliti Etile ottanoato Etile esanoato

RIASSUMENDO E stata applicata la Principal Component Analysis sulle analisi chimiche classiche e il profilo aromatico per semplificare i dati. ZG+ZR 1.6 ZG+ZR ZG+ZR 1.2 0.8 ZG+ZR ZR+SC ZR+SC ZG+ZR+SC ZR+SC ZR+SC Component 2 ZR ZR ZR ZR -3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.5 0.5 1.0 1.5 0.4 ZG+ZR+SC ZG+ZR+SC ZG+ZR+SC ZG ZG ZG -0.4-0.8 ZG+SC ZG+SC ZG+SC ZG+SC -1.2-1.6 SC SC SC SC -2.0 Component 1

ANALISI DEL METABOLOMA Analisi LC-MS (cromatografia liquida spettrometria di massa): zuccheri, acidi organici non aromatici, amminoacidi, acidi idrossicinnamici, acidi idrossibenzoici, flavonoidi (es. quercitine), tannini a basso peso molecolare, flavan-3- oli e antociani. 10000 5000 ZG ZG+ZR ZG+ZR+SC ZG+SC t[3] 0-5000 ZR SC -10000 ZR+SC -20000-15000 -10000-5000 0 5000 10000 15000 20000 t[1] SIMCA-P+ 12-2013-10-28 10:19:04 (UTC+1) Gambellara, 25.11.2013

PROVE IN CANTINA (2010-2013) Controllo La Biancara SC DMMtq-7 SC CVMp-3 Az. Agric. Sordato SR SO04-29 Az. MentiVini SG ME06-9

PROVE IN CANTINA (2010-2013) RIASSUNTO RISULTATI Fermentazione spontanee di controllo Numero di lieviti iniziale da 10 2 a 10 6 UFC/ml Cinetiche estremamente differenti. Controllo 2012 2013

PROVE IN CANTINA (2010-2013) RIASSUNTO RISULTATI Prove di fermentazione con S. cerevisiae I risultati delle prove di microvinificazione rispecchiano quelli ottenuti delle prove in cantina in diversi mosti e condizioni. Le caratteristiche tecnologiche dei lieviti autoctoni di S. cerevisiae sono state delineate con chiarezza: CVMp-3 ceppo poco alcoltollerante, mentre il ceppo DMMTq-7 è più alcol-tollerante. Grande standardizzazione della fermentazione L acido acetico prodotto è stato attorno a 1,0-1,8 g/l in relazione alla conc. dello zucchero iniziale.

PROVE IN CANTINA (2010-2013) RIASSUNTO RISULTATI Prove di fermentazione con Z. gambellarensis e S. cerevisiae Le caratteristiche tecnologiche del nuovo lievito si stanno delineando con chiarezza Z. gambellarensis sembra stimolare lo sviluppo degli altri lieviti inoculati L analisi sensoriale evidenzia vini più complessi Z. gambellarensis ME06-9 + S. cerevisiae CVMp-3

CONCLUSIONI Il Vin Santo di Gambellara è caratterizzato da un alta biodiversità microbica che ha consentito di isolare ceppi del genere Zygosaccharomyces particolarmente resistenti alle particolari condizioni; lo studio di questi isolati ha portato ad identificare la nuova specie Zygosaccharomyces gambellarensis; il suo contributo in termini di composizione chimica e dal punto di vista sensoriale del vino si sta delineando; si può presumere che, essendosi adattata a questa nicchia ecologica, abbia effetti che incidono sull unicità del prodotto. Gambellara, 30.11.2010

CONCLUSIONI Dall elevata biodiversità iniziale sono stati selezionati ceppi di S. cerevisiae che hanno superato le prove di caratterizzazione in laboratorio e di impiego in cantina; sono disponibili ceppi autoctoni che potranno essere utilizzati, da soli o in miscela con ceppi di Zygosaccharomyces, come valido strumento biotecnologico per valorizzare la microflora autoctona, standardizzare e gestire al meglio il processo fermentativo così importante per la qualità del Vin Santo di Gambellara. Gambellara, 25.11.2013

RINGRAZIAMENTI Consorzio per la Tutela dei Vini D.O.C. di Gambellara Le cantine I miei collaboratori Dr.ssa PhD Elisa Salvetti Dr.ssa PhD Marilinda Lorenzini Dr.ssa PhD Giovanna Felis Dr. PhD Fabio Fracchetti Tesisti ed ex tesisti Dr. Matteo Bissoli Dr.ssa Federica Cantachin Dr. Nicola Menti

Grazie per l attenzione