PUÒ LA NUTRIZIONE AZOTATA DEL LIEVITO CAMBIARE IL PROFILO AROMATICO DEL VINO? Daniel Ramón Vidal Biópolis S.L. Piacenza, 22 Aprile 2009

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1 PUÒ LA NUTRIZIONE AZOTATA DEL LIEVITO CAMBIARE IL PROFILO AROMATICO DEL VINO? Daniel Ramón Vidal Biópolis S.L. Piacenza, 22 Aprile 2009

2 LA BIOTECNOLOGIA DEL VINO Vitis vinifera Homo sapiens Saccharomyces cerevisiae

3 LE INTERAZIONI Vitis vinifera Homo sapiens Saccharomyces cerevisiae PROPRIETA

4 PROPRIETA DEL VINO Proprietà fisico chimiche Proprietà organolettiche Proprietà funzionali MANCANZA DI CONOSCENZE SCIENTIFICHE

5 L AROMA DEL VINO Determinato da composti volatili: alcoli, esteri, aldeidi, chetoni e idrocarburi Composti con soglia di precezione molto bassa: da 0.1 mg/l a 0.1 fg/l Concentrazioni molto basse nel vino: da 10 mg a 0.1 μg/kg Concentrazioni variabili in funzione di: clima, suolo, irrigazione, momento della vendemmia, processo di fermentazione, operazioni di processo Percezione finale è il risultato dell interazione di centinaia di composti

6 CLASSIFICAZIONE DEGLI AROMI Terziari Primari Secondari

7 AROMA VARIETALE O PRIMARIO Nella fase finale della maturazione, nella buccia e polpa dell acino si accumulano: esteri, aldeidi, chetoni e alcoli Esteri più importanti: esteri dell acido acetico ed esteri di alcoli a corta catena Aldeidi sono quantitativamente importanti, si formano enzimaticamente; spiccano il trans-2-esenale il esenale Tra i chetoni importanti i 2- e 3-alcanoni Tra gli alcoli spiccano quelli con 4-11 atomi di carbonio, alcoli insaturi e ramificati a corta catena e composti aromatici come l alcol benzilico, 1- e 2- feniletanolo e i monoterpeni

8 IL CASO PARTICOLARE DEI TERPENI Molti composti volatili sono tossici per la cellula vegetale per questo sono presenti in forma glicosilata non volatile I terpeni sono i composti aromatici in forma glicosidata più abbondanti nell uva Complesso terpene-zucchero formato da un disaccaride di cui la molecola legata al terpene è sempre glucosio Il secondo zucchero è di solito arabinosio, ramnosio o apiosio; geraniolo, nerolo e linalolo sono i terpeni più comuni Frazione non volatile quindi solo potenzialmente aromatica HO CH 3 C HC CH 2 CH 2 C HC CH 2 CH 3 CH 3 HC HC CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 OH Linalolo Nerolo Geraniolo T G R CH 3 C HC CH 2 CH 2 C C H CH 3 CH 3 CH 2 OH C C Terpene legato (senza aroma) CH 3 CH 3

9 AROMA SECONDARIO O DI FERMENTAZIONE Prodotto dal metabolismo fermentativo del lievito Alcoli superiori, esteri, aledidi, chetoni, acidi organici, fenoli, composti organici solforati e terpeni Spiccano alcuni alcoli alifatici (1-propanolo, 2- metil-1-propanolo, 2-metil-a-butanolo e 3-metil-1- butanolo) e aromatici come il 2-feniletanolo Anche esteri come l acetato d etile, aldeidi come l acetaldeide o chetoni come l acetone, l acetoina e il 2,3-pentadione Molto importanti i composti solforati di origine organica perchè hanno soglia di percezione bassa; spiccano il 4-mercapto-4-metil pentanone, il 3- mercaptoesanolo e il 3-mercaptoesil acetato Terpeni formati a partire dai precursori glicosilati del mosto per azione glicosidica Tutti gli aromi secondari formati a partire da precursori presenti nel mosto

10 AROMA TERZIARIO O BOUQUET DI MATURAZIONE Sviluppato durante l invecchiamento: bouquet ossidativo in barrique, bouquet di riduzione in bottiglia Nel bouquet ossidativo si ha la sintesi di acetaldeide e acetali e contemporaneamente l estrazione dal legno di composti fenolici derivati dalla lignina e lattoni come il 3-metil-γoctolattone Nel bouquet di riduzione si hanno reazioni tra derivati dei norisoprenoidi, carboidrati e composti solforati ridotti In generale durante l invecchiamento spariscono esteri acetati, alcoli superiori e alcoli monoterpenici e aumentano furfurale, acetato d etile, alcuni esteri etilici e l ossido di nerolo, hotrienolo, idrossilinalolo e idrossicitronellolo

11 E POSSIBILE MIGLIORARE L AROMA? PRIMARIO SECONDARIO Miglioramento delle varietà d uva Ricevimento dell uva (antiossidanti, CO 2 ) Normalizzazione del mosto Nuovi ceppi di lievito Miglioramento del lievito Precursori del mosto (nutrizione) TERZIARIO Nuovi materiali barriera Direzionare le reazioni

12 E POSSIBILE MIGLIORARE L AROMA? S. cerevisiae: microorganismo eucariota più semplice e meglio conosciuto dal punto di vista biochimico Genoma interamente sequenziato Acidi organici Alcoli superiori Aldeidi Chetoni Composti solforati Esteri Fenoli Mutanti in tutti i geni Molti ceppi industriali con diverso potenziale aromatico

13 TIPOLOGIA DI LIEVITO IN FUNZIONE DEL POTENZIALE AROMATICO LIEVITI VARIETALI Evidenziano aromi primari LIEVITI AROMATICI Producono aromi di fermentazione

14 USO DI LIEVITI VARIETALI Evidenziano e valorizzano gli aromi primari dell uva Biochimicamente dipende dalla presenza di geni che codificano enzimi capaci di liberare i precursori aromatici presenti nell uva Due esempi: liberazione di terpeni e composti solforati

15 USO DI LIEVITI VARIETALI PER INCREMENTARE I TERPENI T T G R Terpene legato (senza aroma) O CH 2 O Ramnosidasi HO CH 3 O O T G HO OH OH OH OH Ramnopiranosil-glucoside β-glucosidasi T Terpene volatile (aromatici)

16 STRATEGIA PER LA LIBERAZIONE DEI TERPENI USO DI ENZIMI ESOGENI USO DI LIEVITI SELEZIONATI USO DI LIEVITI TRANSGENICI Inibizione dell attività Distruzione degli enzimi Numero limitato di ceppi Inibizione parziale Rifiuto sociale

17 LIEVITI VARIETALI PER INCREMENTARE I COMPOSTI SOLFORATI Formati a partire da precursori legati alla cisteina (non volatili) liberati da liasi non presenti in commercio In S. cerevisiae almeno 4 geni implicati nella liberazione del 4MMP da Cys-4MMP Ceppi commerciali di lievito con elevata attività liasica 4-mercapto-4-metilpentanone (4MMP) 3-mercaptoesanolo (3MHA) Ceppi transgenici che esprimono una triptofanasi di E. coli con elevata attività tiolasica

18 USO DI LIEVITI AROMATICI Sintetizzano ex novo composti volatili: esteri, acetati, alcoli superiori e aldeidi Necessario attivare la via biochimica che conduce alla loro sintesi Per la sintesi di molti di questi composti è necessario disporre di una buona fonte aminoacidica

19 INTERMEDIARI METABOLICI RILEVANTI: GLI ALCOLI SUPERIORI Propanolo Isobutanolo Alcol isoamilico 2-feniletanolo Alcoli superiori ed esteri sono intermediari metabolici rilevanti nella sintesi dei composti aromatici Alcoli superiori prodotti in quantità elevata, odore penetrante e, a concentrazioni > 400 mg/l, effetto negativo sulla percezione olfattiva Anche se di per sè negativi per la qualità del vino, tecnologicamente importanti perchè precursori degli esteri dell acido acetico I più importanti prodotti a partire da amnoacidi

20 INTERMEDIARI METABOLICI RILEVANTI ESTERI Sintetizzati in piccole quantità, fragranza gradevole Esteri acetati degli alcoli superiori - associati all aroma fruttato, floreale e fresco dei vini giovani - sono i più importanti Composti tipici del metabolismo secondario del lievito; la loro sintesi non è specifica; la sfumatura aromatica del vino è il risultati dell iterazione tra tutti Acetato d etile, acetato d isoamile, acetato d isobutile e acetato di 2-feniletile sono i più rilevanti

21 ALCUNI ALCOLI SUPERIORI PRODOTTI DAL LIEVITO Propanolo ALCOL AMINOACIDO PRECURSORE Treonina 2-amino-butirrico CONCENTRAZIONE (mg/l) AROMA 9-68 Solvente Isobutanolo Valina 9-28 Alcol Alcol isoamilico Leucina Marzapane 2-feniletanolo Fenilalanina Florale

22 ALCUNI ESTERI PRODOTTI DAL LIEVITO ESTERE CONCENTRAZIONE (mg/l) AROMA Acetato d etile Solvente Acetato di 2-feniletile Rosa, fruttato Acetato d isoamile Banana, pera Acetato d isobutile ,8 Banana Acetato d esile Mela matura Butanoato d etile Florale, fruttato Capronato d etile Tracce-3.4 Mela, banana

23 SINTESI E DEGRADAZIONE Formazione Degradazione Diffusione di membrana

24 SINTESI DEGLI ALCOLI SUPERIORI Sintetizzati a partire da aminoacidi ramificati: fenilalanina, valina, isoleucina e leucina Due possibili vie: sintesi ex novo a partire da una fonte di carbonio (via catabolica) o la via anabolica del metabolismo generale degli aminoacidi Prosegue con la via di Ehrlich o di desaminazione ossidativa La chiave è la formazione del chetoacido che puo essere transaminato per generare un aminoacido e decarbossilato per generare un alcol superiore

25 GENI ED ENZIMI IMPLICATI Pdc1p Pdc5p Pdc6p YDR380w (Aro10p) YDL080c (Thi3p) Decarbossilazione Gnp1p Agp1p Bap2p Bap3p Tat1p Tat2p Ptr2p Aminoacidi Aminoacidi Gap1p Adh1p Adh2p Adh3p Adh4p Adh5p Sfa1p Riduzione ALCOL SUPERIORE

26 SINTESI DEGLI ESTERI AROMATICI Condensazione chimica tra alcol superiore e acido possibile ma lenta e poco probabile durante la fermentazione La biosintesi richiede energia: necessaria la presenza di alcol superiore e una molecola attiva in forma di acil-coa che di solito è acetil-coa Enzimi implicati: estere-sintasi, etanolacetiltransferasi e alcol-acetiltransferasi (AATasi) Gli esteri possono essere idrolizzati da estere-idrolasi o esterasi; al termine della fermentazione questa attività aumenta

27 GENI ED ENZIMI IMPLICATI Atf1p Atf2p Eth1p Iah1p

28 LIEVITI AROMATICI CON PROFILO MIGLIORE Lieviti commerciali con elevata produzione di esteri fruttati La sovraespressione del gene ATF1 incrementa 180 volte la produzione di acetato d isoamile e di volte quella di altri esteri come l acetato d etile e l acetato di 2-feniletile La perdita del gene IAH1 duplica la concentrazione di esteri di interesse enologico Le condizioni di fermentazione (presenza di aminoacidi) possono influenzare in modo drammatico la produzione di composti volatili in relazione con l aroma del vino

29 AMINOACIDI, VINO E AROMA La presenza nel mosto di alcuni aminoacidi determina il profilo aromatico del vino Ogni varietà ha un proprio profilo aminoacidico: il Macabeo contiene molta metionina da cui origina il metionolo presente nel vino finale Gli aminoacidi sono precursori della sintesi di alcoli superiori, aledeidi, acidi carbossilici e, indirettamente, esteri

30 AROMI DERIVATI DAGLI AMINOACIDI AMINOACIDO ALDEIDE ALCOL AC. CARBOSSILICO ALTRI Leucina 3-Mebutanale 3-Mebutanolo Ac 3 Mebutanoico Isoleucina 2-Mebutanale 2-Mebutanolo Ac 2 Mebutanoico Valina 2-Meropanale 2- Mepropanolo Ac 2 Mepropanoico Fenialanina Ф-acetaldeide Ф-etanolo Ac. Ф-acetico Tirosina Triptofano Metionina Asparagina ρ-oh-фetanolo Indol-3- acetaldeide 3-Metiopropanale ρ-oh-фacetaldeide Ac p-oh-f-acetico ρ-cresolo Triptofolo Ac indol-3 acetico Skalote 3-Metiopropanolo Ac -3 Metiopropanoico Malato Metanotiolo Diacetile Acetoína

31 STRATEGIE DI NUTRIZIONE AROMA Esteri Alcoli superiori Aminoacidi Acidi grassi insaturi Polisaccaridi Aminacidi Steroli MIGLIORAMENTO FERMENTATIVO

32 TRASPORTO DEGLI AMINOACIDI Assimilazione degli aminoacidi limitata da: competizione con ioni ammonio, presenza di acidi grassi insaturi nella membrana, presenza di etanolo Ioni ammonio competono con molti aminoacidi per entrare nella cellula La presenza nella membrana cellulare di acido oleico e linoleico facilita l assimilazione degli aminoacidi La presenza di etanolo modifica la composizione del doppio strato lipidico e diminuisce la concentrazione degli acidi grassi insaturi L etanolo aumenta la permeabilità della membrana ai protoni, aumenta l attività ATPasica e si consuma energia per mantenere il ph intracellulare, di conseguenza si arresta il trsporto degli aminoacidi

33 AGGIUNTA DI NUTRIENTI ORGANICI Sempre all inzio della fermentazione per evitare concentrazioni elevate di alcol In questo modo si somministrano precursori rapidi per la sintesi proteica Atf1p Atf2p Eth1p La cellula accumula l eccesso di aminoacidi nel vacuolo per utilizzarli successivamente

34 AGGIUNTA DI ATTIVANTI IN TIPI DIVERSI DI VINO Ogni vino è una matrice diversa: non c è una soluzione unica né un unico effetto nell impiego degli attivanti Nei vini bianchi, rossi e rosati aromatici l effetto principale dell uso di attivanti è il miglioramento delle caratteristiche organolettiche Nei vini varietali o d affinamento la nutrizione con steroli e acidi grassi garantisce la regolarità fermentativa

35 BIOLOGIA MOLECOLARE DELL AROMA Si stanno identificando i geni implicati nella sintesi degli aromi in diverse specie vegetali La genomica comparativa in pochi anni ci permetterà di disporre di molti di questi geni La sequenza del genoma dell uva è praticamente completata Già esistono lieviti transgenici che esprimono geni di piante e incrementano gli aromi

36 CONTACTO EN BIÓPOLIS S.L. Biópolis, S.L. Polígono La Coma s/n Paterna (Valencia) España Daniel Ramón (+34)