Functional Genomics in Cancer Genetics 03-04-09
La Genomica Funzionale è una branca della biologia molecolare il cui l obiettivo è di raccogliere il maggior numero di dati che consentono di studiare il modo in cui i geni mutano, evolvono e influenzano l'organismo al fine di assegnare una funzione alle proteine da essi codificati.
Il cosmo omico Genomica Trascrittogenomica Proteomica Genomica Funzionale OBBIETTIVO: Capire in quale circostanza un gene è espresso in quanto presupposto per capire la sua funzione. Genomica Strutturale Farmaco-genomica
Ogni cellula contiene la stessa informazione genica, ma non tutti i geni sono attivi o espressi allo stesso livello in tutte le cellule. Gene RNApolymerase Negli organismi pluricellulari, ogni tipo cellulare ha un proprio profilo d espressione genica, che riflette la particolare condizione fisiologica in cui si trova. Quali sono i geni espressi differenzialmente tra due tipi cellulari? Quali geni sono attivati e disattivati in una patologia rispetto alla condizione normale? Differenziamento Tessuto-specificità
Metodologie per l analisi dei livelli d espressione di tutti i geni presenti nel genoma: DNA Microarrays Lo sviluppo di tecniche automatizzate e miniaturizzate, in combinazione con la grande quantità di informazioni derivanti dall analisi dei genomi ha determinato lo sviluppo della tecnologia del DNA Microarray. Permette: l analisi dell espressione genica in tessuti diversi L analisi della variazione dell espressione genica nel tempo
Perché identificare il pattern di espressione proteica? Proteine sono i veri effettori all interno della cellula Non c è correlazione tra quantità di mrna e quantità di proteina: mrna espression non varia Proteina è down regolata (>degradazione proteica) Proteina è up regolata (> protezione dalla degradazione)
Modificazioni post-traduzionali: alterano la funzione delle proteine a livello biochimico Acetilazione, metilazione Fosforilazione Glicosilazione (enzimatica) Glicazione (non enzimatica) Nitrazione/denitrazione Cleavage Protein splicing Tagging Modificazioni non rivelabile dall analisi di gene expression
Proteoma Proteome = Proteins encoded by the genome Il proteoma comprende tutte le proteine espresse nello stesso momento in una cellula allo stesso tempo, incluse tutte le isoforme e le modificazioni post-traduzionali. Il proteoma all interno di una stessa cellula cambia in funzione di un certo stato (malattia, trattamento, tempo, ecc.) Proteomica È lo studio del PROTEOMA, ossia lo studio della funzione e dell espressione di tutti i complementi proteici che derivano dai vari tessuti o tipi cellulari. La proteomica aiuta a comprendere i meccanismi alla base dell insorgenza delle malattie.
Proteomica Proteomica strutturale (studio di proteomi completi) Proteomica clinica Alterazioni proteiche associate a patologie (proteomica differenziale) Biomarcatori Proteomica funzionale interazioni proteina-proteina
L elettroforesi bidimensionale separa proteine secondo la loro carica e la loro massa Prima dimensione (in base alla carica) Miscela di proteine Seconda dimensione (in base al peso molecolare)
Two dimensional gel electhrophoresis 2D-SDS PAGE The first dimension (separation by isoelectric focusing) - gel with an immobilised ph gradient - electric current causes charged proteins to move until it reaches the isoelectric point (ph gradient makes the net charge 0) The second dimension (separation by mass) -ph gel strip is loaded onto a SDS gel -SDS denatures and linearises the protein (to make movement solely dependent on mass, not shape)
Colloidal Comassie Staining (Sensitivity 8-10ng) Strip ph 3-10 NL 17 cm Cytosolic fraction Strip ph 3-10 NL 17 cm Nuclear fraction SDS-PAGE 11% SDS-PAGE 11% 1mg protein extract
Control Sample
Process Flow Chart of Proteomics Two dimensional gel electrophoresis (Image analysis, (Data massage, Evaluation) Spot identification (Mass spectrometry) Biomarkers (Principal compound analysis)
Spettrometria di massa La spettrometria di massa è una tecnica applicata all identificazione di sostanze sconosciute. Si basa sulla produzione di una miscela di ioni ottenuta dalla ionizzazione della sostanza da analizzare che vengono fatti viaggiare all interno di un campo elettrico e discriminati in base al loro rapporto massa/carica (m/z).
Identification of differentially expressed proteins Control Sample MASS SPECTROMETRY Silver/ Coomassie stain Protein ID
Protein Identification by Mass Spec Spot removed from gel Fragmented using trypsin Spectrum of fragments generated MATCH Library Database of sequences (i.e. SwissProt) Protein Identification
Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 1D or 2D gel silver-stained MALDI-TOF Protein ID Run gel, stain Excise spot, destain, wash, digest, extract peptides Spot onto plate and mass analyze Search all spectra against protein databases Risultato ricerca
DIGE: 2-D difference gel electrophoresis
Typhoon Imager Merge Pooled Standard Cy2 Cy3 Cy5
Applicazioni della Proteomica nella Diagnostica Precoce
Application of Proteomics in Cancer Genetics Tumor markers Diagnostic markers: detection of malignant disease Prognostic markers: malignant potential, disease recurrence Predictive markers: response to different therapies Positioning markers: positional information (e.g. for surgery)
Application of Proteomics in Cancer Genetics Proteomic aims in cancer genetics General goal: better understanding of genesis and progression of cancer Clinical goals: early cancer detection using biomarkers identification of potential therapeutic target structures efficient monitoring of therapy control
Application of Proteomics in Cancer Genetics Biomarker è un indicatore di un particolare stato biologico samples: cells, body fluids, tissues biomarkers: diagnostic, prognostic, predictive problems: complexity, variability, reproducibility
Application of Proteomics in Cancer Genetics Biomarkers Example: biomarker for bladder cancer 2DE of tissues silver staining bladder cancer tissue healthy urothelium MALDI-TOF-MS and sequencing Calreticulin Westernblot : anti-calreticulin antibody bladder cancer tissue healthy urothelium Kageyama et al. Clin. Chem. 2004
Application of Proteomics in Cancer Genetics Biomarkers diagnostic biomarkers: cancer detection in body fluids cancer sample biomarkers sensitivity specificity bladder urine 5 87 % 66 % prostate serum 7 83 % 97 % breast serum 3 93 % 91 % ovarian serum 8 100 % 95 % Fels et al. Dig. Dis. 2003, 21, 292
Application of Proteomics in Cancer Genetics Biomarkers Tumor antigens and Tumor specific antibodies: lung cancer PGP 9.5 neurospecific protein breast cancer RS/DJ-1 RNA-protein interaction regulator Prognostic biomarkers: low vs. high malignant tumors ovarian cancer FK506BP regulatory function (TGFβ-R-pathway) Predictive biomarkers: response to different therapies ovarian cancer glyoxylase I;detoxification (chemotherapy)
Protein Microarrays for Cancer Research and Diagnostics High Throughput Tumor Marker Profiling
Protein Microarrays
Platform of Protein Microarrays chip Catching Ab Multiple target-specific Ab s spoted on chip Analyte contacted with array Specific detection via labeled secondary Ab (ELISA-type) Two Ab s per target Protein microarrays for breast cancer research and diagnostics Carlsson et al.eur J Cancer 2008
Genomica Funzionale e Diagnostica Precoce P P P P P U U U Applicare la Genomica Funzionale alla Diagnostica significa servirsi di metodologie che ci permettono di studiare il trascrittoma e il proteoma, che in combinazione ai dati clinici, ci forniscono una diagnosi precoce e più attendibile