L elettroforesi bidimensionale (2D-DIGE) per lo studio del proteoma: applicazioni cliniche. Prof. Fabiana Passaro

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Rossana Calo
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1 L elettroforesi bidimensionale (2D-DIGE) per lo studio del proteoma: applicazioni cliniche Prof. Fabiana Passaro

2 Che cos è il PROTEOMA? Il proteoma è l insieme delle proteine espresse da una cellula in un determinato momento. Il proteoma comprende non solo le proteine nella loro forma più semplice, appena tradotte, ma anche tutte le diverse isoforme in cui una stessa proteina può essere espressa (varianti di splicing e/o modifiche post-traduzionali).

3 Che differenza c è tra GENOMA e PROTEOMA? Il genoma è costante per una data cellula: identico per tutte le cellule dello stesso organismo; all interno della stessa specie presenta solo piccolissime variazioni. Il proteoma, al contrario, è dinamico nel tempo: nella stessa cellula si modifica in risposta a fattori esterni; differisce tra le cellule dello stesso organismo e, ovviamente, tra cellule di organismi diversi in maniera significativa.

4 La PROTEOMICA La PROTEOMICA è la disciplina che mira a catalogare il proteoma di un organismo, determinarne la sequenza e analizzare il corredo complessivo delle proteine nei diversi tipi cellulari, nelle diverse fasi di sviluppo e in differenti stadi fisiopatologici. Ulteriore livello di complessità rispetto alla trascrittomica, perché permette di apprezzare le differenze tra la stessa proteina, ma con diverse modifiche posttraduzionali.

5 L identificazione e il sequenziamento di tutte le proteine di una cellula sono molto più complessi della mappatura e del sequenziamento di un genoma. La sfida posta dalla proteomica va ben oltre quella posta dalla genomica funzionale: si pensa infatti che a fronte di circa geni ci siano circa proteine, frutto di variazioni di espressione genica, splicing alternativo e modificazioni post-traduzionali.

6 La comprensione delle basi molecolari di un fenotipo complesso richiede l integrazione di più approcci analitici differenti. Tratto da: Nature Reviews Genetics 16, (2015)

PROTEOMICA DIFFERENZIALE Identificare e quantizzare proteine differenzialmente espresse in determinate condizioni fisiologiche (es. sviluppo, differenziamento, invecchiamento.

7 PROTEOMICA DIFFERENZIALE Identificare e quantizzare proteine differenzialmente espresse in determinate condizioni fisiologiche (es. sviluppo, differenziamento, invecchiamento..) o durante stati patologici o trattamenti farmacologici Sia il diverso profilo delle proteine rilevate in un tessuto, che l assenza, la presenza o differenti livelli quantitativi possono essere potenziali BIOINDICATORI di uno stato fisiologico e/o patologico.

BIOINDICATORI o BIOMARCATORI Indicatore biologico, genetico o biochimico che può essere messo in relazione con l insorgenza o lo sviluppo di una patologia.

8 BIOINDICATORI o BIOMARCATORI Indicatore biologico, genetico o biochimico che può essere messo in relazione con l insorgenza o lo sviluppo di una patologia. Un buon biomarcatore deve possedere alto valore prognostico e predittivo, ossia essere in grado di predire una malattia e di indirizzarla verso quei trattamenti che potrebbero avere maggior successo. Le caratteristiche richieste a un buon marcatore biologico sono: (a) una correlazione specifica con la malattia; (b) un adeguata predittività sul tipo di trattamento e sulla risposta; (c) la possibilità di effettuare la determinazione con precisione, in tempi brevi; (d) essere relativamente insensibile a errori di campionamento.

Approccio allo studio della PROTEOMICA DIFFERENZIALE: 2D-Differential In Gel Electrophoresis (2D-DIGE) Combina le caratteristiche della isoelettrofocalizzazione, nella quale le proteine sono separate

9 Approccio allo studio della PROTEOMICA DIFFERENZIALE: 2D-Differential In Gel Electrophoresis (2D-DIGE) Combina le caratteristiche della isoelettrofocalizzazione, nella quale le proteine sono separate in base alla loro carica, con quella della SDS-PAGE classica, in cui le proteine sono separate in base alla loro massa. Tale combinazione consente di disporre di uno dei metodi analitici più sofisticati per la separazione di miscele proteiche complesse.

I Dimensione: Focalizzazione isoelettrica I polipeptidi sono separati in un gradiente continuo di ph dove migrano in base alla carica fino a raggiungere il proprio punto isoelettrico (pi) cioè quel

10 I Dimensione: Focalizzazione isoelettrica I polipeptidi sono separati in un gradiente continuo di ph dove migrano in base alla carica fino a raggiungere il proprio punto isoelettrico (pi) cioè quel valore di ph al quale la carica netta è nulla. Tutti i polipeptidi di una determinata specie si concentreranno o focalizzeranno in un zona estremamente ristretta, questa caratteristica rende la IEF una tecnica ad elevata risoluzione. Necessità di avere un supporto che non influenzi la migrazione (poliacrilammide al 3-4%). Le Immobiline sono molecole con una struttura chimica simile a quella dell acrilamide che gli permette di polimerizzare e quindi fissarsi alla matrice gelatinosa creando un gradiente di ph immobilizzato (IPG).

II Dimensione: SDS-PAGE I polipeptidi sono separati in un gel di poliacrilammide contenente SDS, perciò in condizioni denaturanti e con carica netta negativa, dove migrano in base al peso molecolare.

11 II Dimensione: SDS-PAGE I polipeptidi sono separati in un gel di poliacrilammide contenente SDS, perciò in condizioni denaturanti e con carica netta negativa, dove migrano in base al peso molecolare. Tutti i polipeptidi che si erano focalizzati in una stessa zona nella prima dimensione, sono ora ulteriormente separati per la loro massa. Necessità di avere un supporto che influenzi la migrazione, perciò percentuale di poliacrilammide che va selezionata sulla base delle esigenze di separazione. Possibilità di utilizzare gradienti di poliacrilammide, per separare diversi range di pesi molecolari nello stesso campione sottoposto ad elettroforesi.

12 Approccio allo studio della PROTEOMICA DIFFERENZIALE: 2D-Differential In Gel Electrophoresis (2D-DIGE) 1. Elettroforesi Bidimensionale (2D-DIGE) 2. Rilevazione degli spot proteici 3. Analisi dell immagine rilevata

13 Rilevazione degli spot proteici ed Analisi dell immagine rilevata Segnale sovrapposto Segnale non sovrapposto e presente solo in uno dei due campioni

Spot de-regolati: Rosso: aumento; Blue: diminuzione Distribuzione degli spot; livello soglia; numero degli spot che mostrano aumento, diminuzione o

14 Spot de-regolati: Rosso: aumento; Blue: diminuzione Distribuzione degli spot; livello soglia; numero degli spot che mostrano aumento, diminuzione o valori prossimi alla soglia Caratteristiche 3D degli spot selezionati Lista di tutti gli spot con indicazione sui livelli di de-regolazione (fold change)

15 Approccio allo studio della PROTEOMICA DIFFERENZIALE 4. Prelievo degli spot proteici 5. Digestione enzimatica dei peptidi dello spot 6. Spettrometria di massa 7. Bioinformatica

16 Prelievo degli spot proteici e Digestione enzimatica dei peptidi dello spot Il frammento di gel viene digerito con tripsina e sonicato per ottenere piccoli frammenti peptidici. I peptidi vengono analizzati allo spettrometro di massa per ottenerne il «finger print»

17 APPLICAZIONI CLINICHE Identificazione e Validazione di nuovi potenziali Biomarcatori diagnostici e prognostici di cancro alla prostata Il cancro alla prostata rappresenta la forma di neoplasia maschile più frequentemente diagnosticata nei paesi economicamente sviluppati; La prostatectomia rappresenta la principale cura, sebbene molti pazienti, a distanza di anni, possono presentare una recidiva biochimica, con alti livelli di Antigene Prostatico Specifico (PSA) nel sangue (dovuto a metastasi) Elevati livelli di PSA si riscontrano anche in casi di infiammazione, iperplasia prostatica benigna ed infezione, perciò non può essere considerato un buon marcatore diagnostico e prognostico.

18 Scopo della ricerca: 1. Identificare e validare nuovi potenziali biomarcatori di cancro alla prostata; 2. Distinguere dal punto di vista molecolare pazienti con e senza recidiva. Metodologia sperimentale: 1.Paragonare il profilo d espressione proteico (PROTEOMA) di tessuti prostatici sani e tumorali ed identificare proteine de-regolate nel tumore mediante 2D-DIGE e Spettrometria di Massa 2.Paragonare il profilo d espressione proteico (PROTEOMA) di tumori prostatici e recidive ed identificare proteine de-regolate nelle recidive mediante 2D-DIGE e Spettrometria di Massa

19 Tessuto Prostatico Sano Tessuto neoplastico (prostata) da paziente Tessuto neoplastico da paziente con recidiva 2D-DIGE 2D-DIGE Spot proteici de-regolati Spot proteici de-regolati Identificazione mediante Spettrometria di Massa Nuovi potenziali biomarcatori per la diagnosi del cancro alla prostata Nuovi potenziali biomarcatori prognostici per la recidiva del cancro alla prostata

20 Tessuto sano vs cancro alla prostata Cancro alla prostata vs recidiva

23 2D-DIGE come strategia per l identificazione di biomarcatori serici in pazienti Messicani con diabete di tipo2 (T2D) con differente body mass index (BMI) L Obesità ed il diabete hanno raggiunto proporzioni epidemiche in molti paesi, mostrando una correlazione con I disordini cardiovascolari e influenzando negativamente qualità ed aspettativa di vita. L Obesità si accompagna spesso ad un certo grado di insulino-resistenza, che comporta incremento dei FFA nel plasma, una riduzione del trasposto del glucosio nel tessuto muscolare ed un aumento della produzione di glucosio epatico. Tra tutte le etnie, I neri non-ispanici ed I messicani mostrano l incidenza maggiore di obesità e T2D. Nonostante grossi passi avanti si debbano alla ricerca sul diabete, molte problematiche cliniche non sono ancora superate. Quindi l identificazione di biomarcatori per una diagnosi precoce della patologia sarebbe cruciale per migliorare gli outcome clinici.

24 Scopo della ricerca: Ricercare nuovi potenziali biomarcatori di T2D paragonando il proteoma del siero di pazienti messicani appartenenti a quattro tipologie: normopeso, sovrappeso, obesi I ed obesi II/III Metodologia sperimentale: Analizzare e paragonare le proteine sieriche di ciascuna delle quattro categorie rispetto a controlli sani, attraverso 2D-DIGE

25 Deplezione delle 14 proteine seriche più abbondanti mediante cromatografia di affinità MARS Hu- 14 (albumina, IgG, antitripsina, IgA, transferrina, haptoglobina, fibrinogeno, alpha-2 macroglobulina, alpha-1-acid glicoproteina, IgM, apolipoproteina AI e AIII, fattore del complemento C3 e transtiretina). LAP HAP 2D-DIGE Identificazione mediante Spettrometria di Massa Nuovi potenziali biomarcatori di T2D

29 RISULTATI DELLA 2D-DIGE VALIDAZIONE DEI RISULTATI CON ALTRA TECNICA CONFERMA DEL DATO

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