Progetto Messa a punto e validazione di un protocollo per la rilevazione qualitativa di allergene soia in farina di grano tenero e duro con il kit ALLflow Soy Proteins Rapid Test Report tecnico di fine progetto Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy : +39 059 8635121 : +39 059 7353024 : immunolab@generon.it : www.generon.it [1] Report tecnico di fine progetto
1 INTRUZIONE E OBIETTIVO DELLO STUDIO Il valore di contaminazione da parte di un allergene, misurato da un test immunochimico (ELISA e LFD) su una matrice alimentare, dipende dall interazione tra le proteine di interesse ed un anticorpo. L analisi risulta influenzata da una serie di fattori fra cui quelli legati al campione analizzato, all operatore ed al kit utilizzato e la conseguenza è che spesso esistono forti discrepanze nei risultati. Oltre alla tipologia di matrice in analisi, l accessibilità della proteina bersaglio gioca un ruolo fondamentale. Prendendo ad esempio l allergene soia esso sarà più facilmente rilevabile se le sue proteine sono già libere in soluzione (es. latte di soia) piuttosto che in prodotti di molitura, nei quali la proteina si trova all interno delle cellule (semi di soia macinati). È quindi fondamentale «provare» le performance del kit sulle proprie matrici tenendo in considerazione i processi industriali a cui sono state sottoposte. L obiettivo del presente lavoro è di individuare e validare un unico protocollo analitico per il kit ALLFlow Soy Proteins Rapid Test (codice ETBSOY-1002) in grado di rilevare qualitativamente l allergene soia in farine di grano tenero e grano duro. Lo studio si prefigge inoltre di raggiungere la miglior sensibilità possibile per entrambe le matrici mantenendo comunque una procedura operativa rapida e di facile esecuzione. 2 QUANTIFICAZIONE DEI CAMPIONI CON TECNICA ELISA Il primo step di lavoro è stato quello di quantificare la proteina soia con metodo ELISA nei campioni poi utilizzati nella validazione con LFD. I campioni analizzati sono campioni di farina di grano tenero e farina di grano duro, sia naturalmente contaminati da semi di soia che non contaminati. Per tale valutazione quantitativa è stato utilizzato il kit ALLwell Soy Protein ELISA kit (codice ETE-75SOY). In figura 1 e in figura 2 è possibile rispettivamente osservare i risultati ottenuti sui 4 campioni di farina di grano tenero (< 2, 11.6, 16.4, 9.4 ppm) e sui 3 campioni di farina di grano duro (< 2, 4.8, 5.8 ppm) analizzati. [2] Report tecnico di fine progetto
Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 0 0,262 0,263 0,261 0,001 0,5 Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 20 0,129 0,389 0,393 0,003 2,2 60 0,315 0,577 0,577 0,000 0,0 180 0,970 1,229 1,234 0,004 0,4 540 2,320 2,600 2,564 0,025 1,1 #N/D #N/D STD (ng/ml) 600 500 400 300 200 CALIBRATION CURVE y = 35,237x 2 + 149,16x + 4,0606 R² = 0,9997 + control 0,911 0,923 0,899 0,141 2,8 100 Validity Test 0 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 Test Validity PASS Extraction Value Value (1 = none) Standard Curve LOQ HLQ Coeff. x 2 Coeff. x q 100 1 2 54 35,237 149,161 4,061 Name ppb Quantifica tion SD CV% Repl.1 Repl.2 1 Farina GT 16-568 0,018 < LOQ <2 0,000707 4,04061 0,279 0,280 2 Farina GT 16-876 A 0,649 115,71 11,6 0,016971 2,614879 0,923 0,899 3 Farina GT 16-876 B 0,889 164,41 16,4 0,026163 2,94462 1,169 1,132 4 Farina GT 16-876 C 0,536 94,04 9,4 0,002121 0,396138 0,799 0,796 Comment Figura 1. Report ELISA delle analisi eseguite sui campioni di farina di grano tenero. Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 0 0,239 0,243 0,235 0,006 2,4 Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 20 0,068 0,297 0,316 0,013 4,4 60 0,171 0,409 0,411 0,001 0,3 180 0,695 0,883 0,984 0,071 7,7 540 1,336 1,636 1,513 0,087 5,5 #N/D #N/D + control 0,437 0,446 0,427 0,013 3,1 STD (ng/ml) 600 500 400 300 200 100 CALIBRATION CURVE y = 243,83x 2 + 57,572x + 27,165 R² = 0,9975 Test Validity Validity Test PASS 0 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 Standard Curve Extraction Coeff. x 2 Coeff. x q Value 100 243,833 57,572 27,165 Name Value (1 = none) ppb Quantifica tion SD CV% Repl.1 Repl.2 LOQ 1 Farina GD 16-3012 1 0,001 < LOQ <2 0,002828 1,178511 0,238 0,242 2 54 2 Farina GD 16-03161 1 0,198 48,05 4,8 0,013435 3,077899 0,446 0,427 2 54 3 Farina GD 16-2951 1 0,259 58,34 5,8 0,028991 5,827413 0,518 0,477 2 54 HLQ Comment Figura 2. Report ELISA delle analisi eseguite sui campioni di farina di grano duro. [3] Report tecnico di fine progetto
3 PROCEDURA OPERATIVA PER LATERAL FLOW Dopo una serie di test e valutazioni preliminari sui campioni in analisi è stato identificato un protocollo operativo utile all analisi sia di campioni di farina di grano tenero che di farina di grano duro con il kit ALLflow Soy Proteins Rapid Test. Di seguito riportiamo la procedura del test: 1. Macinazione e pesata di 0.2 g del campione in un microtubo da 2 ml. 2. Aggiunta di 1,8 ml di soluzione di Extraction Buffer. 3. Agitazione con vortex (ACC3003) fino alla completa sospensione della polvere. 4. Incubazione del microtubo in termoblocco (ACC6037) a 80 C per 10 minuti, agitando dopo il primo minuto, dopo il secondo e in seguito ogni 2 minuti fino al termine dei 10 prestabiliti. Ogni agitazione deve portare alla risospensione del pellet che eventualmente si può essere formato sul fondo del microtubo. 5. Agitazione vigorosa e centrifugazione per 1 minuto a 7200 rpm (ACC3064). 1. Aggiunta di 100 µl della parte centrale del surnatante nell area di applicazione del campione sulla cassetta Lateral Flow. 2. Attesa di 11 minuti prima di eseguire la lettura visiva. 4 RISULTATI DEI TEST CON TECNICA LATERAL FLOW Per ognuno dei campioni di farina di grano tenero e grano duro (contaminati da semi di soia e non) precedentemente quantificati in ELISA sono state eseguite 6 analisi indipendenti seguendo esattamente la procedura operativa identificata (sezione 3). I risultati sono riportati in tabella 1. Campioni Risultato ELISA LF - Repl. 1 LF - Repl. 2 LF - Repl. 3 LF - Repl. 4 LF - Repl. 5 LF - Repl. 6 Farina GT 16-568 < 2 - - - - - - Farina GT 16-876A 11,6 + + + + + + Farina GT 16-876B 16,4 + + + + + + Farina GT 16-876C 9,4 + + + + + + Farina GD 16-3012 < 2 - - - - - - Farina GD 16-03161 4,8 + + + + + + Farina GD 16-2951 5,8 + + + + + + Tabella 1. Risultati con LF dei campioni di farine di grano tenero e duro. Il simbolo + è stato inserito in caso di rilevazione visiva della banda di test, di controllo e di Hook. Il simbolo - è stato inserito in caso di rilevazione visiva esclusivamente delle bande di controllo e di Hook. [4] Report tecnico di fine progetto
Figura 3. Fotografia che mostra le cassette Lateral Flow per i campioni di grano tenero (in singola replica). <2 9,4 11,6 16,4 Figura 3. Fotografia che mostra le cassette Lateral Flow per i campioni di grano duro (in singola replica). <2 4,8 5,8 [5] Report tecnico di fine progetto
5 VERIFICA DELLA PROCEDURA DI SPIKING CON TECNICA ELISA Per effettuare la contaminazione artificiale (spiking) è stato necessario macinare finemente dei semi di soia ed eseguire una setacciatura in modo da ottenere una polvere di soia di granulometria inferiore ai 500 µm. All interno di un microtubo sono stati pesati 1,500 g di farina di grano tenero (campione 16-568 negativo a soia) e 0,500 g di soia macinata: tenuto conto di una percentuale proteica media nella soia del 36%, questo campione risulta essere contaminato indicativamente a 90000 ppm. Tale campione è stato estratto con le modalità indicate sul kit ELISA ALLwell Soy Protein (codice ETE-75SOY) e diluito con un estratto del campione di farina di grano tenero 16-568 negativo a soia fino a raggiungere una scala di contaminazioni di interesse. Un analoga procedura è stata attuata utilizzando come campione disperdente il campione di farina di grano duro 16-3012 (negativo a soia). Ottenuti una serie di estratti a contaminazioni basse di soia sia su matrice farina di grano tenero che duro, è stato poi eseguita l analisi con il medesimo kit ELISA. In figure 5 e 6 è possibile visualizzare i report dei test ELISA sulle 2 serie di contaminati artificiali: come è possibile osservare, i risultati mostrano un ottima corrispondenza tra il valore atteso e il valore ottenuto, confermando quindi la bontà della procedura di lavoro. Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 0 0,286 0,287 0,285 0,001 0,5 Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 20 0,119 0,410 0,399 0,008 6,6 60 0,388 0,663 0,684 0,015 3,8 180 1,190 1,473 1,478 0,004 0,3 540 2,733 3,059 2,979 0,057 2,1 #N/D #N/D + control 1,325 1,320 1,330 0,007 0,5 STD (ng/ml) 600 500 400 300 200 100 CALIBRATION CURVE y = 32,051x 2 + 106,33x + 9,7764 R² = 0,9998 Test Validity Validity Test PASS 0 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 Standard Curve Extraction Coeff. x 2 Coeff. x q Value 100 32,051 106,331 9,776 Name Value (1 = none) ppb Quantifica tion SD CV% Repl.1 Repl.2 1 Fortificazione 32 ppm 1 1,743 292,48 29,2 0,022627 1,298188 2,045 2,013 2 54 2 Fortificazione 16 ppm 1 1,039 154,85 15,5 0,007071 0,680565 1,320 1,330 2 54 3 Fortificazione 8 ppm 1 0,542 76,82 7,7 0,016971 3,1311 0,840 0,816 2 54 4 Fortificazione 4 ppm 1 0,297 44,18 4,4 0,022627 7,618659 0,567 0,599 2 54 5 Fortificazione 2 ppm 1 0,173 29,13 2,9 0,015556 8,992109 0,448 0,470 2 54 LOQ HLQ Comment Figura 5. Report ELISA delle analisi eseguite sui campioni di farina di grano tenero fortificati artificialmente con semi di soia. [6] Report tecnico di fine progetto
Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 0 0,246 0,246 0,245 0,001 0,3 Std (ng/ml) Average 1 2 SD CV% 20 0,051 0,295 0,298 0,002 0,7 60 0,215 0,437 0,484 0,033 7,2 180 0,691 0,924 0,948 0,017 1,8 540 1,224 1,475 1,463 0,008 0,6 #N/D #N/D + control 1,244 1,277 1,211 0,047 3,8 STD (ng/ml) 600 500 400 300 200 100 CALIBRATION CURVE y = 350,02x 2-13,307x + 30,266 R² = 0,9973 Test Validity Validity Test PASS 0 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 Standard Curve Extraction Coeff. x 2 Coeff. x q Value 100 350,022-13,307 30,266 Name Value (1 = none) ppb Quantifica tion SD CV% Repl.1 Repl.2 LOQ 1 Fortificazione 62,5 ppm 1 1,648 > HLQ >54 0,009192 0,485471 1,887 1,900 2 54 2 Fortificazione31,2 ppm 1 0,999 365,95 36,6 0,046669 3,751531 1,277 1,211 2 54 3 Fortificazione 15 ppm 1 0,640 165,12 16,5 0,051619 5,829339 0,922 0,849 2 54 4 Fortificazione 7,8 ppm 1 0,333 64,65 6,5 0,017678 3,055777 0,591 0,566 2 54 5 Fortificazione 3,9 ppm 1 0,204 42,05 4,2 0,02687 5,984423 0,468 0,430 2 54 6 Fortificazione 2 ppm 1 0,058 30,67 3,1 0,006364 2,096857 0,308 0,299 2 54 HLQ Comment Figura 6. Report ELISA delle analisi eseguite sui campioni di farina di grano duro fortificati artificialmente con semi di soia. [7] Report tecnico di fine progetto
6 DETERMINAZIONE DELLA SENSIBILITÁ DEL SAGGIO SPIKING La procedura di contaminazione artificiale eseguita per i test Lateral Flow è stata la medesima attuata per i test ELISA, con la differenza di aver pesato 0,050 g di soia macinata e 0,150 g della farina di grano tenero e duro negativi a soia. L estratto, ricavato utilizzando la procedura descritta nella sezione 3, è stato poi diluito con l estratto della rispettiva farina negativa fino a raggiungere i valori di contaminazione di soia desiderati. Nelle tabelle 2 e 3 è possibile osservare i risultati dei test eseguiti con la metodica in studio. Campioni LF - Repl.1 LF - Repl.2 LF - Repl.3 GT fortificato a 5 ppm + + + GT fortificato a 2,5 ppm + + + GT fortificato a 1,3 ppm + + + GT fortificato a 1 ppm + + + Farina GT 16-568 - - - Tabella 2. Risultati LF dei campioni di farina di grano tenero artificialmente contaminati da semi di soia. Il simbolo + è stato inserito in caso di rilevazione visiva della banda di test, di controllo e di Hook. Il simbolo - è stato inserito in caso di rilevazione visiva esclusivamente delle bande di controllo e di Hook. Campioni LF - Repl.1 LF - Repl.2 LF - Repl.3 GD fortificato a 5 ppm + + + GD fortificato a 2,5 ppm + + + GD fortificato a 1,3 ppm + + + GD fortificato a 1 ppm + Farina GD 16-3012 - - - Tabella 3. Risultati LF dei campioni di farina di grano duro artificialmente contaminati da semi di soia. Il simbolo + è stato inserito in caso di rilevazione visiva della banda di test, di controllo e di Hook. Il simbolo - è stato inserito in caso di rilevazione visiva esclusivamente delle bande di controllo e di Hook. [8] Report tecnico di fine progetto
Figura 7. Fotografia che mostra le cassette Lateral Flow per i campioni di grano tenero contaminato artificialmente (in singola replica). 5 2,5 1,3 1 <L Figura 8. Fotografia che mostra le cassette Lateral Flow per i campioni di grano duro contaminato artificialmente (in singola replica). 5 [9] Report tecnico di fine progetto 2,5 1,3 1 <L
7 CONCLUSIONI DELLO STUDIO Il protocollo operativo specifico messo a punto per la rilevazione qualitativa di allergene soia con il test Lateral Flow ALLflow Soy Proteins si è dimostrato in grado di qualificare correttamente tutti i campioni di farine di grano tenero e duro del presente studio. La contaminazione di alcune di queste farine deriva da presunte tracce di semi di soia finemente macinate ed è stata preventivamente valutata quantitativamente mediante il kit ELISA ALLwell Soy Proteins. Per la valutazione della sensibilità del metodo è stato ritenuto necessario eseguire delle contaminazioni artificiali con semi di soia direttamente sulle farine non contaminate da soia già testate per poter così avere la fotografia esatta della situazione specifica. La procedura di fortificazione artificiale è stata controllata preventivamente mediante quantificazione in ELISA e poi applicata per preparare una serie di estratti di farine contaminate da soia in polvere ai livelli di interesse. I test eseguiti su tali estratti hanno mostrato che è possibile discriminare una farina di grano tenero con contaminazione da soia fino a 1 ppm (± 0,5) dalla medesima farina non contaminata. Le analisi eseguite su farina di grano duro hanno evidenziato un limite di sensibilità di 1,3 ppm (± 0,7). [10] Report tecnico di fine progetto