Saggi rapidi per micotossine: approccio lateral flow per la determinazione di ocratossina A

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1 Università degli Studi di Torino Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Biotecnologie Industriali Saggi rapidi per micotossine: approccio lateral flow per la determinazione di ocratossina A Relatore: Ch.mo Prof. Gianfranco Giraudi Correlatore: Dott.ssa Laura Anfossi Controrelatore: Ch.mo prof. Guido Viscardi Candidata: Elisa Bertone

2 Le Micotossine Le micotossine sono un gruppo di sostanze chimiche a basso peso molecolare prodotte da numerose specie di funghi microscopici Effetti dannosi sulla salute dell uomo e degli animali ( OTA ) Ocratossina A Funghi del genere Aspergillus e Penicillium EFFETTI: nefrotossici epatotossici teratogeni genotossici immunogenici MATRICI ALIMENTARI: cereali, vino, spezie, cacao, caffè, birra, carni suine ed avicole

3 ALIMENTAZIONE UMANA Cereali non trasformati 1 Prodotti derivati da cereali 1 Cioccolato 2, alimenti per bambini 3 Vino 4, cacao 2 Caffè 4 Frutta secca 1, caffè solubile 4 LEGISLAZIONE 5 µg/kg 3 µg/kg 0.5 µg/kg 2 µg/kg 5 µg/kg 10 µg/kg Ordine di grandezza dei ( ppb ) µg/kg MANGIMI 5 Materie prime 250 µg/kg Mangimi completi: Suini 50 µg/kg Pollame 100 µg/kg 1 Regolamento (CE) n. 472/ Circolare 28/11/2003 n. 6 Ministero della salute 3 Regolamento (CE) n. 683/ Regolamento (CE) n. 123/ D.M. 15/05/2006 Ministero della salute Necessità di metodi di analisi sensibili, rapidi e riproducibili Metodi cromatografici: Fase di conferma Accurata quantificazione TLC RP-HPLC-FLD LC-MS GC-MS Metodi immunochimici competitivi: Reazione Ag-Ab Screening qualitativo o semi-quantitativo ELISA Saggi rapidi di screening: Polarizzazione di fluorescenza Flow-through Array a biosensori Elettrodi screen printed LATERAL FLOW Test immunocromatografico

4 COMPONENTI OCRATOSSINA A IMMOBILIZZATA MEDIANTE UN ANCORA PROTEICA MATERIALE ASSORBENTE LINEA TEST LINEA CONTROLLO MATERIALE ASSORBENTE FIBRA DI VETRO SU CUI E DEPOSTO L AGGREGATO: ANTICORPO CHE LEGA ORO+ANTICORPO NANOPARTICELLE D ORO ANTICORPO CHE LEGA OCRATOSSINA A

5 INTERAZIONI TRA I COMPONENTI + INTERAZIONE ANTIGENE- ANTICORPO L ANTICORPO DELL AGGREGATO LEGA L OCRATOSSINA A SIA QUELLA IMMOBILIZZATA SULLA LINEA DI TEST, SIA QUELLA PRESENTE NEL CAMPIONE + INTERAZIONE ANTIGENE- ANTICORPO L ANTICORPO SULLA LINEA DI CONTROLLO LEGA L ANTICORPO DELL AGGREGATO SIA PER UN CAMPIONE POSITIVO CHE PER QUELLO NEGATIVO

6 CAMPIONE In cui può esserci o meno sostanza di interesse LINEA T LINEA C Nanoparticelle oro colloidale λ max picco assorbimento spettro UV= 525 nm COLORAZIONE ROSSA L addensarsi di queste particelle crea una colorazione rossa della linea visibile a livello macroscopico la cui intensità è misurabile

7 FORMATO NON COMPETITIVO (SANDWICH): Linea di test (T):Anticorpo che lega l OTA Linea di controllo (C):Anticorpi non specifici che legano il complesso CAMPIONE NEGATIVO L anticorpo sulla nanoparticella di oro e quello sulla linea di test competono per l ocratossina CAMPIONE POSITIVO FLUSSO FLUSSO LINEA T LINEA C LINEA T LINEA C CAMPIONE NEGATIVO: SINGOLA LINEA CAMPIONE POSITIVO: DOPPIA LINEA Aumento dell intensità della linea T all aumentare della concentrazione di OTA

8 FORMATO COMPETITIVO: Linea di test (T): ocratossina legata a carrier proteico Linea di controllo (C):Anticorpi non specifici che legano il complesso Competizione per l anticorpo specifico tra l analita in soluzione e analita immobilizzato sulla linea di test CAMPIONE NEGATIVO CAMPIONE POSITIVO FLUSSO FLUSSO LINEA T LINEA C LINEA T LINEA C CAMPIONE NEGATIVO: DOPPIA LINEA CAMPIONE POSITIVO: SINGOLA LINEA Diminuzione dell intensità della linea T all aumentare della concentrazione di OTA

9 Scopo del lavoro SVILUPPO DI UN SAGGIO LATERAL FLOW Competitivo Rapidità Semplicità : Personale non qualificato (Assenza di reagenti pericolosi e di ( complessa strumentazione Applicazione in situ Piccoli volumi di campioni e reagenti Segnale analitico compatibile Intervallo di concentrazione compatibile con i limiti legislativi Per la rivelazione dell ocratossina A in alimenti e mangimi animali Strumento di tipo QUANTITATIVO Lettura strumentale delle strisce Elaborazione di una curva di taratura Applicabilità in matrici reali

10 Ottimizzazione delle condizioni CONIUGATO ORO COLLOIDALE-ANTICORPO 1.SCELTA DELLA TIPOLOGIA DI ANTICORPO In base alla capacità di evitare l aggregazione delle nanoparticelle e di legare l ocratossina 2.SCELTA DELL AGENTE DI BLOCCAGGIO Necessario per evitare l interazione tra le nanoparticelle e la conseguente precipitazione del coniugato. Selezionata la proteina BSA che presenta però un legame non voluto con l ocratossina 3.RIDUZIONE DEL LEGAME ASPECIFICO BSA-OCRATOSSINA Diminuzione del ph e diminuzione della concentrazione proteica 4.CONCENTRAZIONE PROTEICA OTTIMALE PER RICOPRIRE LA PARTICELLA DI ORO Per evitare l aggregazione dell oro 5.PURIFICAZIONE DELL ANTICORPO ANTI-OCRATOSSINA Per eliminare anticorpi non specifici che interferiscono con la misurazione 6.SCELTA DELLE CONDIZIONI DI DEPOSIZIONE SULLA FIBRA DI VETRO Immersione diretta o mediante dispensatore automatico Le nanoparticelle ricoperte di anticorpo vengono deposte su una fibra di vetro che viene poi fatta essiccare e viene sovrapposta alla membrana prima dell analisi

11 LA MEMBRANA Ottimizzazione delle condizioni 1. AGGIUNTA DI AGENTI DI BLOCCAGGIO DELLA MEMBRANA Miglioramento del flusso agendo sulle dimensioni dei pori della membrana e riducendo le interazioni della membrana con la proteina di bloccaggio del coniugato (BSA) 2. SCELTA DELLA TIPOLOGIA DI MEMBRANA Dimensioni diverse dei pori che determinano una diversa velocità del flusso 3. AGGIUNTA DI ADDENSANTI DEL FLUSSO Polimeri ad alto peso molecolare che rallentano il flusso sulla membrana permettendo una migliore interazione tra il coniugato che fluisce sulla membrana ed i reagenti deposti sulla membrana. 4. DETERMINAZIONE CONCENTRAZIONE OTTIMALE DEI REAGENTI DEPOSTI SULLA MEMBRANA 5.DEPOSIZIONE DI UNA OPPURE DUE LINEE DI TEST SULLA MEMBRANA Sulla membrana vengono deposte le linee (test e controllo), viene realizzato il bloccaggio e, dopo averla essiccata, si procede al packaging: su di essa vengono sovrapposti i materiali assorbenti e la fibra di vetro con su l anticorpo-nanoparticelle d oro e viene tagliata in strisce di larghezza ~ 5 mm

12 Condizioni selezionate per il mio sistema: AGENTE DI BLOCCAGGIO: proteina BSA RIDUZIONE DEL LEGAME ASPECIFICO BSA-OTA: ottenuto diminuendo la concentrazione proteica nel protocollo di bloccaggio CONCENTRAZIONE PROTEICA OTTIMALE PER IL BLOCCAGGIO: BSA 0.1% (p/v) MODALITA DI DEPOSIZIONE SULLA FIBRA DI VETRO: mediante dispensatore automatico BioDot TM BLOCCAGGIO DELLA MEMBRANA: mediante proteina ovalbumina 1% (p/v) per 5 TIPOLOGIA DI MEMBRANA: membrana M90 (flusso più rapido - dimensione maggiore dei pori) ADDENSANTI DEL FLUSSO: polietilenglicole al 2% (p/v) CONCENTRAZIONE REAGENTE LINEA DI TEST: mg/ml DEPOSIZIONE DI UNA SINGOLA LINEA DI TEST (sistema più sensibile alla variazione della quantità di ocratossina presente)

13 Curve di taratura: Quantificazione del risultato Acquisizione dell immagine: Scanner CANON CanoScan LiDE 90 Elaborazione dell immagine: Software Quantiscan TM C Linea di controllo T Linea di Test T/C standard o estratto Normalizzazione B/B0= 100 T/C standard 0 T/C = Area T Area C

14 Elaborazione delle curve di taratura VALORI T/C DELLE 3 CURVE Curva 24 C 1 Curva 24 C 2 Curva 30 C VALORI B/B0 DELLE 3 CURVE Curva 24 C 1 IC 50 : 2 ± 0.4 ppb Curva 24 C 2 IC 50 : 0.8 ± 0.1 ppb Curva 30 C IC 50 : 1 ± 0.2 ppb Intervallo di concentrazione ppb: normativa OTA matrici destinate al consumo umano Curva temperatura superiore: Intensità del segnale maggiore Influenza sulla pendenza non definita

15 Effetto della matrice: I campioni reali possono contenere interferenti che influiscono sulla realizzazione del saggio Prove di estrazione con 2 o 5 ml CAMPIONI: grano duro, farro perlato e mais Estrazione con 2 ml NON EFFICACE: L ocratossina non è solubilizzata completamente e/o la densità dell estratto ne impedisce la quantificazione Estrazione con 5 ml EFFICACE su grano e farro (resa estrazione ~ 92%) Sul mais : forte EFFETTO MATRICE Non si riesce ad effettuare una quantificazione della tossina presente Estrazione con 25 ml: si riesce ad effettuare una quantificazione sul mais (utilizzando la curva di taratura a T= 30 C)

16 Saggio di tipo competitivo CONCLUSIONI Saggio lateral flow per la determinazione dell ocratossina A Rapido, semplice, applicabile in situ, economico Segnale analitico compatibile con la lettura strumentale Costruzione di curve di taratura a diversa temperatura attraverso le quali è possibile quantificare l ocratossina Strumento di tipo quantitativo per lo screening dell OTA in matrici cerealicole destinate all alimentazione umana, oltre che in mangimi animali Intervallo di concentrazione delle curve è compatibile con i limiti legislativi Valutazione preliminare dell effetto matrice nei cereali IN FUTURO.. ULTERIORE OTTIMIZZAZIONE DEL SISTEMA Conferma riproducibilità dei dati ( umidità Studio su fattori che influenzano la curva (temperatura, Applicazione ad altre matrici

17 PREPARAZIONE NANOPARTICELLE ORO COLLOIDALE L acidotetracloroaurico viene riscaldato ad una T~ 200 C (fino all ebollizione) Viene aggiunto il riducente (citrato trisodico) in modo rapido e sotto forte agitazione Dopo qualche minuto avviene il viraggio: dal giallo iniziale al blu scuro, fino ad ottenere una colorazione rossa ebollizionein 10 Ulteriori Controllo del ph (deve essere compreso tra 7.5 e 8) Filtrazione Verifica spettrofotometrica: si ottiene lo spettro UV e si identifica la λ a cui si ha il max del picco di assorbimento Max picco 525 nm: particelle sferiche monosospese aventi colorazione rossa

18 Immagini delle particelle di oro colloidale ottenute tramite Microscopio Elettronico in Trasmissione, TEM. Distribuzione del diametro delle particelle di oro colloidale esaminate La media pesata dei diametri, calcolata su 200 particelle analizzate, risulta essere 25 nm ± 4 nm, quindi decisamente inferiore a quanto atteso in base ai dati da letteratura (30-40 nm).

19 LEGAMEDELL ANTICORPOSULLENANOPARTICELLE Il legame avviene mediante incubazione a 37 C della sospensione oro colloidale con perlavaggidaseguita, l anticorpo eliminarel eccessodiproteina: INTERAZIONE NON COVALENTE: interazione elettrostatica e adsorbimento. atomounrilascia, sull oroadsorbesizolfolo di H e si forma un legame zolfo-oro Alla sospensione di oro colloidale viene aggiunto il tampone (per mantenere sotto controllo il ph) e la soluzione di anticorpo Il sistema viene lasciato in incubazione 30 a 37 C, bloccantel agentecontenentesoluzioneunaaggiuntaviene ilqualericopreleparticelled oroeneimpediscel aggregazione Si fa avvenire un altra incubazione, 10 a 37 C g 9400 a 30 percentrifugazioneunaadquindiprocedesi Si preleva ed elimina il surnatante, che risulta trasparente Si effettuano due lavaggi: risospensione del pellet con dicirca 20% al 10 personicazione, 20mMboratotampone a 30 percentrifugazione, ultrasuoniadsonicatoreconpotenza 9400 g, eliminazione del surnatante e risospensione finale in tampone borato spettromediantel anticorpoconlegamedell avvenutoverifica di assorbimento UV: si dovrebbe osservare uno spostamento di circa 10 nm verso lunghezze d onda maggiori