Produzioni biotecnologiche agroalimentari: Il Vino

I microrganismi dell uva Lieviti - Hanseniaspora, Kloeckera (50-75%) - Candida, Dekkera/Brettanomyces, Kluyveromyces, Metschnikowia, Candida, Pichia, Hansenula, Issatchenkia, Rhodotorula, Zygosaccharomyces, Torulospora, Schizosaccharomyces - Saccharomyces spp. Batteri - Batteri lattici (Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus) -Batteri acetici (Acetobacter, Gluconobacter) Funghi Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Mucor, Oidium, Penicillium, Plasmopara, Rhizopus, Monilia, Paecilomyces, Trichoderma, Uncinula

I m.o. presenti sull uva L ecologia microbica delle uve è ancora in gran parte sconosciuta, ma si stima che sulla superficie dei grappoli la popolazione microbica raggiunga valori di 10 3-10 5 ufc/g. Il principale lievito vinario, Saccharomyces cerevisiae, è poco frequente (<50 ufc/g) sui grappoli non danneggiati o addirittura assente sugli acini intatti e sui suoli del vigneto Tra i molteplici fattori che influenzano la presenza e la crescita dei microrganismi ricordiamo: - l andamento meteorologico (principalmente pioggia e temperatura); - la varietà ed il grado di maturazione dell uva, lo stadio di sviluppo in cui i grappoli sono esaminati, i danni fisici provocati da uccelli, insetti e muffe; - la posizione dell acino nel grappolo, lo spessore e la composizione dello strato ceroso presente sugli acini; - le pratiche agricole (ad esempio fertilizzazione, irrigazione e gestione del vigneto); - l impiego di prodotti chimici quali fungicidi ed insetticidi

Tecniche di vinificazione

Tecnologia di produzione Nella vinificazione con macerazione il mosto viene avviato direttamente alla fermentazione (tecnica utilizzata soprattutto per i vini rossi) Le uve vengono sottoposte a pigiadiraspatura, per eliminare i raspi, ed il mosto così ottenuto viene travasato in tini di fermentazione dove avviene la fermentazione alcolica

Tecnologia di produzione Si utilizza il termine vinificazione con macerazione o vinificazione in rosso perché le sostanze coloranti (antociani) presenti nelle bucce e nelle parti solide (raspi e vinaccioli) vengono estratte nel corso della macerazione, sfruttando l azione subilizzante dell alcol

Tecnologia di produzione Durante il processo all interno dei tini si sviluppa CO 2 che elimina l ossigeno presente inibendo lo sviluppo di muffe e batteri aerobi, mentre i lieviti trasformano gli zuccheri in alcol etilico Nel momento in cui inizia la fermentazione e, di conseguenza la produzione di CO 2, le bucce e l altro materiale insolubile presente formano un cappello sulla superficie del mosto, che pertanto rimane a contatto con le bucce e i vinaccioli (vinacce)

Definizione di VINO il prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione alcolica totale o parziale di uve fresche, pigiate o no o di mosti di uve" Con un titolo alcolimetrico minimo fissato in funzione delle diverse zone viticole riconosciute nella Comunità Europea Regolamento (CE) n. 1493/1999 punto 10 allegato I

Ruolo dei microrganismi nella vinificazione La trasformazione spontanea del mosto d uva in vino è un complesso processo biochimico in cui sono coinvolti diversi m.o., presenti nel mosto e provenienti dall uva e/o dall ambiente di cantina, che sviluppano contemporaneamente o si susseguono durante la fermentazione

Processo fermentativo Mosto d uva basso ph (2,8-3.8), elevato contenuto zuccherino (20-30%) forte azione selettiva Mosto in fermentazione condizioni anaerobiche inibizione dello sviluppo di m.o. ossidativi diminuzione di sostanze nutritive e incremento in etanolo funghi pluricellulari e batteri acetici specie microbiche poco resistenti all etanolo Lieviti e batteri lattici vino maggiori responsabile della trasformazione del mosto in

Fermentazione alcolica spontanea Durante la fermentazione naturale o spontanea del mosto d uva avviene l occupazione sequenziale da parte dei lieviti naturalmente presenti nell uva Nelle fasi iniziali la comunità microbica è rappresentata in misura preponderante da lieviti di forma apiculata (Kloeckera apiculata e in misura minore dai generi Candida, Hansenula, Rhodotorula, Pichia e Metschnikowia) Questi lieviti sono dotati di grande vigore fermentativo ma sono incapaci di portare a termine la fermentazione (produttori di elevate quantità di acido acetico, bassissima alcol-resistenza < 5-7%)

Fermentazione alcolica spontanea Successivamente (dopo 3-4 gg) prendono il sopravvento lieviti di forma ellittica quali Saccharomyces cerevisiae e sue razze fisiologiche o specie affini, alcol tolleranti e produttori di piccole quantità di acido acetico, che completano la fermentazione fino all esaurimento degli zuccheri

(A) Lieviti non-saccharomyces; (B) Saccharomyces; (C) Oenococcus oeni; (D) Lieviti e/o batteri alteranti

Fermentazione alcolica guidata Le fermentazioni guidate o definite controllate sono quelle svolte mediante l impiego di colture di lieviti selezionati (colture starter) La selezione viene eseguita generalmente nell ambito della specie S. cerevisiae perché rappresenta il lievito che possiede i migliori requisiti enologici, tra cui l alto potere fermentativo, l alto potere alcoligeno, la produzione equilibrata di composti secondari

Caratteri enologici Caratteri tecnologici sono quelli correlati ai parametri che influenzano l andamento del processo fermentativo Caratteri di qualità sono invece quelli fondamentalmente riconducibili all attività metabolica del lievito e comprendono quelle caratteristiche che dipendono dall attività metabolica del lievito, che porta alla produzione di composti che influenzano la qualità organolettica e salutistica del vino

CASO STUDIO: Caratterizzazione molecolare ed enologica di lieviti autoctoni per la produzione della Malvasia delle Lipari Azienda Duca di Salaparuta (Salina) RFLP-mtDNA (Hinf I) Individuazione di ceppi con particolari caratteri enologici capaci di valorizzare le peculiarità proprie del passito Malvasia delle Lipari

Incremento calo peso Caratteri tecnologici Vigore fermentativo Esprime la prontezza con cui un ceppo di lievito dà inizio alla fermentazione e la rapidità con cui la porta a termine 12 10 8 6 4 2 0 VIGORE FERMENTATIVO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Giorni di fermentazione MDL 17 MDL 21 MDL 70 MDL 78 MDL B L espressione di tale carattere viene misurata, generalmente, in termini di grammi di CO 2 svolta in 48 ore da 100 ml di mosto (determinazione, tramite pesata, del calo di peso dovuto alla perdita di CO 2 svolta durante la fermentazione)

Caratteri tecnologici Potere alcoligeno assoluto Il potere fermentativo esprime la quantità massima di etanolo che un lievito può produrre per fermentazione di un mosto contenente zucchero in eccesso MDL 17 11.6% vol MDL 21 12.0% vol MDL 70 12.4% vol MDL 78 14.3% vol MDL B 11.1% vol La fermentazione è stata seguita fino a peso costante

I lieviti e il loro metabolismo

Lieviti fermentanti facoltativi Si possono sviluppare sia in condizioni aerobiche che in condizioni di anaerobiosi In presenza di ossigeno utilizzano il glucosio respirandolo (glicolisi e decarbossilazione del piruvato ad opera di una piruvato deidogenasi, ciclo di Krebs) in assenza di ossigeno operano la fermentazione alcolica (glicolisi e decarbossilazione del piruvato, grazie ad una piruvato decarbossilasi, ad acetaldeide ridotta, dall alcol deidrogenasi, ad etanolo)

Produzione di piruvato: centrale nel catabolismo Destini del piruvato Ciclo di Krebs - Respirazioni Fermentazioni Legame fra glicolisi e Ciclo di Krebs (ciclo dell'acido citrico o TCA): - Decarbossilazione ossidativa del piruvato per formare acetil-coa

Piruvato deidrogenasi La respirazione In presenza di ossigeno e assenza di repressione, l acido piruvico, proveniente dalla glicolisi, entra nella matrice mitocondriale dove subisce una decarbossilazione ossidativa in presenza di coenzima A (CoA) e di NAD+, generando diossido di carbonio, NADH ed acetil-coa che viene poi demolito ossidativamente con il ciclo di Krebs (ciclo dell acido citrico, ciclo degli acidi tricarbossilici) Glucosio + 6O 2 + 38ADP + 38Pi 6CO 2 + 6H 2 O + 38ATP

La fermentazione alcolica Enzima chiave è la piruvato decarbossilasi che catalizza la decarbossilazione del piruvato ad acetaldeide la quale a sua volta agisce da accettore di e - nella riossidazione del NADH glucosio 2 etanolo+2co 2 Resa energetica = 2 ATP

Quando la concentrazione di glucosio è elevata, S. cerevisiae metabolizza gli zuccheri solo per via fermentativa; anche in presenza d ossigeno la respirazione è impossibile Questo fenomeno, scoperto da Crabtree H.G. nel 1929 viene chiamato effetto Crabtree (o effetto glucosio o repressione catabolica da glucosio o effetto anti Pasteur)

L effetto Crabtree si manifesta in S. cerevisiae quando la concentrazione di zuccheri nel mezzo supera i 9 g/l (5 mm) (degenerazione dei mitocondri diminuzione di steroli ed acidi grassi, repressione degli enzimi coinvolti nel ciclo di Krebs e i costituenti della catena respiratoria, in particolare l enzima piruvato deidrogenasi, mentre piruvato decarbossilasi e alcol deidrogenasi sono notevolmente attivati dalle alte concentrazioni di zuccheri) I lieviti come Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe che accumulano etanolo anche in presenza di ossigeno sono chiamati Crabtree-positivi, mentre i lieviti che degradano gli zuccheri a CO 2 come Kluyveromyces marxianus, K. fragilis, Candida utilis, Pichia-Hansenula sono detti Crabtree-negativi

Fermentazione malolattica La fermentazione malolattica (fermentazione secondaria) solitamente decorre al termine della fermentazione alcolica quando l accumulo di etanolo e la scomparsa degli zuccheri fermentescibili determinano una riduzione della popolazione dei lieviti La decarbossilazione dell acido L-malico in acido L-lattico e CO 2 inizia a essere effettuata quando la popolazione batterica raggiunge la soglia di 10 5-10 6 UFC/ml Alla riduzione dell acidità, la fermentazione malolattica unisce una serie di effetti positivi sulle caratteristiche organolettiche del vino legati essenzialmente all aumento della sua stabilità biologica e complessità aromatica

Fermentazione malolattica Solo dal 1990 è stato dimostrato che dalla conversione dell acido l-malico in acido L- lattico e CO 2 la cellula ha un guadagno energetici in termini di ATP L acido L-malico entra nella cellula mediante un sistema uniporto sotto forma di malato che è la forma ionica prevalente dell acido malico al ph del vino (3,2-3,4) Nel citoplasma viene velocemente decarbossilato per opera dell enzima malolattico a lattato, il quale, reagendo con un protone, forma acido lattico che lascia la cellula per diffusione passiva

Batteri lattici Le specie presenti in quantità maggiori nei mosti e nei vini sono: Oenococcus oeni agente principale della FML (eterofermentanti) Lactobacillus plantarum presente soprattutto nei mosti (omofermentanti e eterofermentanti) Pediococcus damnosus presente nei mosti, e nei vini a ph alti dopo la FML (omofermentanti) I batteri lattici si ritrovano in basse concentrazioni, circa 100 cell/g, su foglie e grappoli d uva (alcune specie di lattobacilli e alcuni pediococchi mentre non viene quasi mai riscontrato O. oeni) Dopo la pigiatura degli acini, il loro numero aumenta fino a 10 3-10 4 ufc/ml

m.o. alteranti e aspetti sanitari del vino

Metodi di controllo dei microrganismi indesiderati durante la vinificazione Trattamenti fisici Filtrazione - filtri o aggiunta di additivi Trattamento termico - pastorizzazione Campi elettrici pulsati (PEF) (Barbosa-Cànovas et al., 2001; Molinari et al., 2004; Wu et al., 2005; Mosqueda-Melgar et al., 2008; Puértolas et al., 2009) Corrente elettrica a bassa intensità (LEC) (Ranalli et al., 2000,2002; Lustrato et al., 2003,2006,2009; Lustrato e Ranalli, 2009; Lustrato et al., 2010) Dimetildicarbonato (DMDC) (200 mg/l; Regolamento n 643 del 27/04/06) Preservativi chimici SO 2 (160 mg/l vini rossi; 210 mg/l vini bianchi) 0,7-1,2 mg/l SO 2 molecolare L azione antisettica è dovuta alla FRAZIONE MOLECOLARE che dipende da: SO 2 libera, ph, T, grado alcolico Biopreservativi Lattoferina bovina (Enrique et al., 2008) Tossine killer (PIKT, KWKT, PMKT2) (Comitini et al., 2004; Santos et al., 2009; Comitini et al., 2011)

Le malattie dei vini Mosto d uva Vino Elevato contenuto zuccherino e basso ph Basso ph, alta concentrazione di etanolo, presenza di anidride solforosa, scarsità di nutrienti Nonostante queste caratteristiche rendano il vino un prodotto igienicamente sicuro, in cui non è possibile lo sviluppo di m.o. patogeni, tuttavia non impediscono lo sviluppo di m.o. deterioranti responsabili delle cosiddette malattie del vino

Alterazioni causate da batteri acetici Gluconobacter (isolato principalmente sulle uve perché predilige substrati con zuccheri ed è sensibile all etanolo) G. Famiglia Acetobacteriaceae oxydans Acetobacter (non è sensibile all etanolo e può sopravvivere anche nel vino dove si può sviluppare solo in caso di presenza di aria) A. pasteurianus, A. aceti Acescenza produzione di acido acetico e acetaldeide formati dal metabolismo ossidativo dell etanolo (produzione di veli sulla superficie dei vini) Concentrazioni di acido acetico superiori a 1,2-1,3 g/l rendono sgradevole il vino (acidità volatile) Legislazione: rossi concentrazione limite 1,20 g/l bianchi e rosati 1,08 g/l

Alterazioni causate da batteri lattici Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc e Oenococcus possono provocare alterazione dei vini, sia nel corso della fermentazione alcolica che durante l invecchiamento in cantina ed in bottiglia Formazione di acidi (acido D-lattico e acetico) Alterazione causa rifermentazione Eccesso di produzione di EPS (Filante) Alterazione per produzione di mannitolo (Agrodolce) Alterazione detta gusto di topo o mousiness Degradazione degli acidi organici Degradazione dell acido citrico Degradazione dell acido sorbico nota di geranio Degradazione dell acido tartarico (Girato) Degradazione del glicerolo con formazione di acroleina (Amaro o Amarore)

Caratteristiche dei principali lieviti alteranti ed il loro effetto sul vino Saccharomyces spp. Schizosaccharomyces spp. rifermentazione

Alterazioni causate da lieviti Candida, Hansenula e Pichia possono crescere nel vino sotto forma di film superficiali formazione di film FIORETTA (si manifesta con una patina nel vino e nelle salamoie) Produzione di elevate concentrazioni di acetaldeide a partire dall etanolo utilizzato come fonte carboniosa respirabile. Inoltre l alterazione è completata dalla produzione di esteri e soprattutto dall aumento dell acidità volatile Appropriati livelli di solforosa così come l evitare il diretto contatto del vino con l aria e la conservazione a basse temperature (8-12 C) permettono il controllo di questi lieviti