Sostanze d Abuso su sangue in LC-MS Cod. LC89 Metodo di conferma in LC-MS INTRODUZIONE La determinazione delle sostanze d abuso nei liquidi biologici viene generalmente effettuata in prima istanza usando tecniche immunometriche che si avvalgono della reazione antigene-anticorpo e successiva marcatura con vari reagenti. Queste metodologie sono considerate di screening. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografica sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector di Massa (MS). Il presente metodo consente di determinare la Morfina, la Codeina, la 6-Monoacetilmorfina, il 3,4- MDA, il 3,4-MDE, il 3,4-MDMA, la Benzoilecgonina, la Cocaina, il Metadone, l EDDP, l Amfetamina, la Metamfetamina, la Norbuprenorfina, la Buprenorfina, la Cocaetilene, l MBDB, l Ecgonina Metil Estere, il Delta-9-THC, il Delta-9-THC-COOH e l -OH-THC con lettura in LC-MS. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 5473423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 633 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 7 74579 Fax + 39 7 7496579 Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 3 Sostanze d Abuso su sangue intero in LC/MS Giugno 25
CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare un ampio pacchetto di Sostanze d abuso su sangue dopo una deproteinizzazione e lettura in LC-MS. Recupero del Metodo : % Sensibilità del Metodo : Oppiacei, Cocaina e metaboliti, Metadone e metabolita, Amfetamine e metaboliti,5 ng/ml Norbuprenorfina,2 ng/ml Delta-9-THC, ng/ml -OH-THC, ng/ml Delta-9-THC-COOH,2 ng/ml Range dinamico del Metodo :,5 ng/ml Buprenorfina Norbuprenorfina,2 ng/ml Delta-9-THC, - ng/ml -OH-THC, - ng/ml Delta-9-THC-COOH,2 - ng/ml Valore di cut-off: Morfina ng/ml Codeina ng/ml 6-Monoacetilmorfina ng/ml Metamfetamina 5 ng/ml Amfetamina 5 ng/ml 3,4-MDA 5 ng/ml 3,4-MDMA 5 ng/ml 3,4-MDE 5 ng/ml Cocaetilene ng/ml MBDB 5 ng/ml Norbuprenorfina 5 ng/ml Buprenorfina 5 ng/ml Benzoilecgonina ng/ml Cocaina ng/ml Metadone ng/ml EDDP ng/ml Ecgonina Metil Estere ng/ml Delta-9-THC 2 ng/ml -OH-THC 2 ng/ml Delta-9-THC-COOH 5 ng/ml Rif. Art.87 Codice della strada Guida in stato di alienazione psicofisica per uso di sostanze stupefacenti 2
ANALITA Accuratezza intra-giorno Precisione intra-giorno CV% inter-giorno (Errore %) (CV%) (Errore %) Calibratore Calibratore Calibratore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore AMFETAMINA 7.54 7.27 2.36 3.95 2.9 3.6 6.86 9.64 8.72 METAMFETAMINA 8.99 5.86 5.45 8.85 4. 2.94 9.75 5.75 9.4 3,4-MDMA 5.4 4.62 8.84 6.64 8.23.95 8.29 9.65 3,4-MDA 4.39 5.47 7.33 3.69 7. 6.2 8.35 9.85 3,4-MDE 6.93 4.3 5.72 7.4 2.85 6.7 9.8 9.2 7.26 MBDB 4.66 7.57 4.7 5.92.53.69 9.67 4.7 4.99 BEG 6.28 8.3 4.35 8.59 5.43 5.65 9.36 6.65 9.54 COCAETILENE 7.85 6.2 4.62 5.28 5.47 5.67 7.38 8.7. COCAINA 9.37 8.2 6.27 2.2.96 3. 6.89 6.78 MORFINA 8.58 8.3 6.28 7.2 9.63 6.43 9.46 8.3 6-MAM 7.3 7.34 6.3 6. 8.4 7.5. 9.9 CODEINA 7.85 7.36 5 6.89 8.43 2.6 2.2 2.3 METADONE 7.67 6.47 6.2 2. 4.7.94 2.4 3. EDDP 4.8 4.46 3.97 7.89 6.7 5.7 8.7 8.92 7.7 BUPRENORFINA 5.57 6.7 4.5.8 5.73 6.95 8.8 NORBUPRENORFINA 6.5 8.6 7.82 2.75 7. 3.66 2.6 8.79 2. ECGONINA METIL ESTERE 5.63 4.33 3.8 2.66 2.23 3.57.8 8.92.2 THC 5.28 6. 5.7 3.97 3.39 5.95 4. 6.58 7.47 OH THC 3.9 7.82 3.6 2.46 2.5 4.2 9.94 8.42 6.6 THC COOH 3.68 7.39 5.39 5.3 5.92 8.5.5. 8.59 3
ANALITA (Coefficiente di correlazione R2) + deviazione standard LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) AMFETAMINA 976 ±.5 5 METAMFETAMINA 983 ±.2 5 3,4-MDMA 989 ±.6 5 3,4-MDA 985 ±. 5 3,4-MDE 99 ±.9 5 MBDB 98 ±.7 5 BEG 985 ±. 5 COCAETILENE 997 ±.. COCAINA 979 ±.24. MORFINA 978 ±.26. 6-MAM 979 ±.29. CODEINA 968 ±.38. METADONE 967 ±.9. EDDP 973 ±.5. BUPRENORFINA 982 ±.8 5 NORBUPRENORFINA 983 ±.2 5 ECGONINA METIL ESTERE 978 ±.26 THC 984 ±.9.3. OH THC 993 ±.3.3. THC COOH 997 ±.3 5 ANALITA Recupero (%) Calibratore Inferiore Medio Superiore AMFETAMINA 5.4 8.9 7.9 METAMFETAMINA 2.6 2.6 3,4-MDMA 8.6 9.5 2.5 3,4-MDA 93.4 9.2 95.4 3,4-MDE 7.4 5.5 7.3 MBDB 95.5 98.8 98.4 BEG 92.9 95.9 97.7 COCAETILENE 97.3 98.2 92. COCAINA 9.5 92.7 2.4 MORFINA 97.2 95.6 92.4 6-MAM 7. 5.2 3. CODEINA 8.8 9.7.6 METADONE 93.4 9 95.3 EDDP 99.2 97.9 97.6 BUPRENORFINA 97.6 99.3 94.2 NORBUPRENORFINA 95.4 93.8 92.5 ECGONINA METIL ESTERE 94.3.. THC 99.4 98.9 99.3 OH THC 93. 94. 97.9 THC COOH 93.3 9.4 95.4 4
ANALITA Concentrazioni Calibratore Inferiore Medio Superiore AMFETAMINA 7.5 2 75 METAMFETAMINA 7.5 2 75 3,4-MDMA 7.5 2 75 3,4-MDA 7.5 2 75 3,4-MDE 7.5 2 75 MBDB 7.5 2 75 BEG 7.5 2 75 COCAETILENE 2.5 4 COCAINA 2.5 4 MORFINA 2.5 4 6-MAM 2.5 4 CODEINA 2.5 4 METADONE 2.5 4 EDDP 2.5 4 BUPRENORFINA 2 5 5 NORBUPRENORFINA 2 5 5 ECGONINA METIL ESTERE 2.5 4 THC 2 7.5 OH THC 2 7.5 THC COOH 2 5 5 5
Contenuto della Confezione ( test): Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C, tranne il Reagente A che va stoccato a 2 C. Reagente A Soluzione Deproteinizzante + Std interni, x 3 ml Calibratore liofilo su sangue intero Livello, x ml Calibratore liofilo su sangue intero Livello 2, x ml Calibratore liofilo su sangue intero Livello 3, x ml Calibratore liofilo su sangue intero Livello 4, x ml Calibratore liofilo su sangue intero Livello 5, x ml Reagente M Fase Mobile M, x 5 ml Stoccare a 2 C Codice LC896 (confezionato a parte - vedi scheda tecnica) Codice LC896 (confezionato a parte - vedi scheda tecnica) Codice LC896 (confezionato a parte - vedi scheda tecnica) Codice LC896 (confezionato a parte - vedi scheda tecnica) Codice LC896 (confezionato a parte - vedi scheda tecnica) Reagente M2 Fase Mobile M2, x 5 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Modalità di prelievo ematico : Strumento LC-MS triplo quadrupolo Analisi in gradiente binario Modalità di lavoro ESI Computer gestionale Autocampionatore Provetta con anticoagulante EDTA Stabile per circa 4 settimane a 2 8 C o 4 mesi a 2 C. 6
PROCEDURA ANALITICA FASE : In eppendorf dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Calibratore liofilo su sangue intero µl Campione µl Controlli µl Reagente A Soluzione Deproteinizzante + Std interni 3 µl 3 µl 3 µl Al vortex per secondi FASE 2 : Centrifugare a 4. rpm per minuti INIEZIONE : Iniettare il surnatante nel sistema LC come riportato nella tabella, o in volume differente in funzione del proprio sistema strumentale: Tipologia di analisi Volume da iniettare (µl) Cannabinoidi 5 2 Ecgonina Metil Estere 2 3 Altre classi di composti Release N 3 Sostanze d Abuso su sangue intero in LC/MS Maggio 25 7
Sostanze d Abuso su sangue - Avvertenze REAGENTE A: SOLUZIONE DEPROTEINIZZANTE + STANDARD INTERNI 3,4-MDPA Atropina Acido Mefenamico Conservazione: il reagente va stoccato a 2 C ng/ml 5 ng/ml 5 ng/ml ng/ml CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova RRHD C 8 (5 x 2. mm,.8 um) alternativa alla colonna RRHD C8, una colonna Allure PFPP (5 x 2. mm, 5 um) per sistemi che raggiungono 4 bar. Disconnettere il detector e far passare una soluzione di H 2O : Fase Mobile M2 ( 2 : 8 v/v ) al flusso di 3 µl/min per 5 minuti. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare ulteriormente con una soluzione di H 2O : Fase Mobile M ( 5 : 95 v/v ) per minuti. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 25 C si consiglia di conservate a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Flussare una soluzione di H 2O : Fase Mobile M2 ( 5 : 95 v/v ) per minuti a 3 ul/min scaricandola. Stoccare la colonna in una soluzione di H 2O : Fase Mobile M2 ( 5 : 95 v/v ). LAVAGGIO AGO DI INIEZIONE Lavare l ago di iniezione, prima di ogni seduta analitica, con Metanolo. PARAMETRI DELLA SORGENTE AGILENT 646: Si lavora in ESI Gas Temp: 29 C; Gas Flow: 2 L/min; Sheath Gas: 4 C Sheath Gas Flow: L/min Nebulizer: 2 psi Capillary: +35 V / -35 V Gradiente Droghe d Abuso (eccetto Ecgonina Metil Estere e Cannabinoidi) Vol. Iniez. 2ul Tempo (min) % M (POMPA A) % M2 (POMPA B) Flusso (ml/min) min 98% 2% min 98% 2% min 6% 4% 3.5 min 5% 95% 5 min 5% 95% 5. min 98% 2% 6 min 98% 2% 8
Gradiente Ecgonina Metil Estere Vol. Iniez. ul Tempo (min) % M (POMPA A) % M2 (POMPA B) Flusso (ml/min) min 98% 2%. min 5% 5%. min 5% 95% 2 min 5% 95% 2. min 5% 95% 3. min 98% 2% 4 min 98% 2% Gradiente Cannabinoidi: Vol. Iniez. 5ul Tempo (min) % M (POMPA A) % M2 (POMPA B) Flusso (ml/min) min 6% 4% min 6% 4% min 2% 8% 2.5 min 5% 95% 2.95 min 5% 95% 3 min 6% 4% 4 min 6% 4% 9
Sostanze d Abuso: Standard interno da utilizzare per la calibrazione: MORFINA CODEINA 6-MONOACETILMORFINA METADONE EDDP NORBUPRENORFINA BUPRENORFINA 3,4-MDA 3,4-MDE 3,4-MDMA AMFETAMINA METAMFETAMINA MBDB BENZOILECGONINA COCAINA COCAETILENE ECGONINA METIL ESTERE DELTA-9-THC-COOH DELTA-9-THC -OH-THC MDPA MDPA MDPA MDPA MDPA MDPA Atropina Atropina Atropina Atropina Acido Mefenamico Acido Mefenamico Acido Mefenamico ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE LC896 Calibratore su sangue per Sostanze D abuso 5 x 2 x ml LC897 Controllo multiparametrico per Sostanze d abuso Livello 5 x ml LC898 Controllo multiparametrico per Sostanze d abuso Livello 2 5 x ml LC899 Controllo multiparametrico per Sostanze d abuso Livelli e 2 2 x 5 x ml S2957U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite x Pz Z95975792 Colonna analitica RRHD C8 (5 x 2, mm..8 um) Pz
FRAMMENTAZIONI ANALITA PARENT ION Morfina 286. Codeina 3. MDA 8. MDMA 94. MDE 28. BEG 29. Cocaina 34.2 6-MAM 328. Metadone 3 EDDP 278. Amfetamina 36. Metamfetamina 5. Norbuprenorfina 44.3 Cocaetilene 38. MBDB 28. Buprenorfina 468.3 Ecgonina Metil Estere 2 Delta-9-THC-COOH 345.2 (+) / 343.2 (-) Delta-9-THC 35. -OH-THC 33.2 32.2 3,4-MDPA 222. Atropina 29 Acido Mefenamico 242.2
Sostanze d Abuso su sangue (Cromatogrammi di riferimento) x 4 Cpd 2: CODEINA-: +ESI MRM Frag=22.V CF=. DF=. CID@53. (3. -> 65.) CAL3-.d.75.7.65.39.6.55.5.45.4.35.3.25.2.5..5 5 5 5 5 5 5 5 5..5 5 5.5..5.2.25.3.35.4.45.5.55.6.65.7.75.8.85.9.95 2 2.5 x 6 Cpd 37: MDMA-: +ESI MRM Frag=7.V CF=. DF=. CID@7. (94. -> 63.) CAL3-.d.8.6.4.2.535 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2..8.6.4.2.3.32.34.36.38.4.42.44.46.48.5.52.54.56.58.6.62.64.66.68.7.72.74.76.78.8.82.84 Fig. : Calibratore liofilo Fig. 2 : Calibratore liofilo R.T..39 Codeina R.T..53 3,4-MDMA 2
Sostanze d Abuso su sangue (Cromatogrammi di riferimento) x 6 Cpd 9: COCAINA-: +ESI MRM Frag=2.V CF=. DF=. CID@5. (34.2 -> 82.) CAL3-.d.8.6.4.2.723 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2..8.6.4.2.2.25.3.35.4.45.5.55.6.65.7.75.8.85.9.95 2 2.5 2. 2.5 2.2 2.25 x 6 Cpd 4: METANFETAMINA-: +ESI MRMFrag=9.V CF=. DF=. CID@5. (5. -> 9.) CAL5-.d 2.25 2.2 2.5 2..527 2.5 2.95.9.85.8.75.7.65.6.55.5.45.4.35.3.25.2.5..5 5 5 5 5 5 5 5 5..5..2.4.6.8.2.22.24.26.28.3.32.34.36.38.4.42.44.46.48.5.52.54.56.58.6.62.64.66.68.7.72.74.76.78.8.82.84.86 Fig. 3 : Calibratore liofilo Fig. 4 : Calibratore liofilo R.T..72 Cocaina R.T..52 Metamfetamina 3
Sostanze d Abuso su sangue (Cromatogrammi di riferimento) x 6 Cpd 7: METADONE-: +ESI MRMFrag=.V CF=. DF=. CID@9. (3 -> 265.) CAL3-.d x 5 Cpd 43: ANFETAMINA-: +ESI MRM Frag=7.V CF=. DF=. CID@3. (36. -> 9.) CAL3-.d 2.8 2.75 2.7 2.65 2.6.52 2.55 2.5 2.45 2.4 2.35 2.3 2.25 2.2 2.5 2. 2.5 2.95.9.85.8.75.7.65.6.55.5.45.4.35.3.25.2.5..5 5 5 5 5 5 5 5 5..5.5..5.2.25.3.35.4.45.5.55.6.65.7.75.8.85.9.95 2 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2. 2.9.8.7.6.5.4.3.2.. 2.623 2.25 2.3 2.35 2.4 2.45 2.5 2.55 2.6 2.65 2.7 2.75 2.8 2.85 2.9 2.95 3 3.5 Fig. 5 : Calibratore liofilo Fig. 6 : Calibratore liofilo R.T..5 Amfetamina R.T. 2.62 Metadone 4
Sostanze d Abuso su sangue (Cromatogrammi di riferimento) x 6 Cpd 29: EDDP-: +ESI MRM Frag=2.V CF=. DF=. CID@29. (278. -> 234.) CAL3-.d x 5 Cpd 25: BEG-: +ESI MRM Frag=3.V CF=. DF=. CID@5. (29. -> 68.) CAL3-.d.375.35 4.5 4.4.325 4.3.3 4.2.275.25.225 2.8 4. 4.664.2 3.9.75 3.8.5 3.7.25..75 3.6 3.5.5 3.4.25 3.3 75 5 3.2 3. 25 3 2.9 75 5 25 2.8 2.7 2.6 75 2.5 5 25 2.4 2.3 75 2.2 5 2. 25 2 75 5.9.8 25.7.6 75 5 25.5.4.3 75.2 5 25. 75 5 25 5 5..75.5.25..86.88.9.92.94.96.98 2 2.2 2.4 2.6 2.8 2. 2.2 2.4 2.6 2.8 2.2 2.22 2.24 2.26 2.28 2.3 2.32 2.34 2.36 2.38 2.4 2.42 2.44 5.5..5.2.25.3.35.4.45.5.55.6.65.7.75.8.85.9.95 2 2.5 2. 2.5 2.2 2.25 2.3 Fig. 7 : Calibratore liofilo Fig. 8 : Calibratore liofilo R.T. 2.8 EDDP R.T..66 Beg 5