Droghe d abuso in Spettrometria di Massa

Transcript

1 Droghe d abuso in Spettrometria di Massa Nicole Marforio TAB3 Lavoro di Diploma Responsabile Dr. Marco Cantù Laboratorio d Immunologia Cantonale/ ORBV

2 Indice Abbreviazioni 2 Abstract Introduzione Le droghe d abuso Epidemiologia Concetti generali Anfetamine Cannabinoidi Cocaina Oppiacei Tecniche Metodo di screening Metodo di conferma Obiettivo del lavoro Materiali e metodi Reagenti, QC e Calibratori Preparazione campioni Strumenti d analisi HPLC Spettrometro di Massa Statistica Risultati Intraday Interday Discussione Intraday Interday Conclusioni Ringraziamenti Bibliografia Allegati Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 1

3 Abbreviazioni OMS THC SNC EOLAB LC-MS/MS HPLC MS SEC IEC RPC IP-RPC AC m/z API ESI APCI APPI AP-MALDI LD QC IVD water LC-MS BEG SI QQQ CV% SD M Organizzazione Mondiale della Sanità 9 Tetraidrocannabinolo Sistema nervoso centrale Dipartimento di medicina di laboratorio dell ente ospedaliero cantonale Cromatografia in fase liquida abbinata alla spettrometria di massa tandem High performance liquid cromatography Spettrometro di massa Size-exclusion chromatography Ion-exchange chromatography Reversed-phase chromatography Ion-pair reversed-phase chromatography Affinity chromatography Rapporto massa/carica Atmospheric Pressure Ionization Electrospray Ionization Atmospheric Pressure Chemical Ionization Atmospheric Pressure Photoionization Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization Lavoro di diploma Controlli di qualità Dispositivi medico-diagnostici in vitro Acqua ultra pura specifica per applicazioni in spettrometria di massa Benzoilecgonina Standard Interno Spettrometro di massa a triplo quadrupolo Coefficienze di variabilità percentuale Deviazioni Standard Media Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 2

4 Abstract La droga è una qualsiasi sostanza capace di modificare l umore, la percezione della realtà o il comportamento stesso della persona che assume la sostanza. È possibile assumere le droghe per diverse vie, orale, endovena e inalatoria ed è possibile riscontrarne la presenza in diversi tessuti o liquidi biologici. Per la determinazione dell assunzione di droghe d abuso vengono utilizzati dei test rapidi di screening con metodi immunocromatografici, che si basano sul principio antigene-anticorpo, questi test però non sono abbastanza specifici e sensibili, sono in grado di identificare solo la famiglia della droga, e hanno dei cut-off elevati rispetto a tecniche come la spettrometria di massa associata ad HPLC, che si vuole introdurre come metodo di conferma. Il nuovo metodo mostra diversi vantaggi come una specificità maggiore, cut-off più bassi rispetto ai test rapidi e la possibilità di dare risultati sia quantitativi che qualitativi. L obiettivo è quello di validare un Kit diagnostico per la quantificazione spettrometrica delle droghe d abuso, in questo lavoro di anfetamine, cocaina e metadone. I reagenti, controlli e calibratori vengono forniti dalla ditta Eureka Italia, utilizzando un UHPLC Agilent Technologies e uno Spettrometro di Massa a triplo quadrupolo Agilent Technologies, associato a sorgente ESI. Per motivi di tempo non è stato possibile ottenere tutti i valori necessari alla validazione. Con i risultati preliminari però possiamo già identificare dei problemi di accuratezza, che fanno pensare ad un problema di stabilità o di assemblaggio dei QC per questo motivo l obiettivo stabilito non è stato raggiunto, di conseguenza verranno presi in considerazioni degli altri Kit diagnostici oppure la Ditta Eureka risolverà i problemi riscontrati nei QC. The drug is any substance capable of altering the mood, perception of reality or the conduct of the person taking the substance. You can take drugs by different routes, oral, intravenous and inhaled and can foundet presence in different tissues or biological fluids. For the determination of drug of abuse are used for rapid screening test with immunochromatographic methods, which are based on the principle of antigen-antibody, however, these tests are not sensitive and specific enough, they are able to identify only the family of drugs and have the cut-off levels than techniques such as mass spectrometry combined with HPLC, which is to be introduced as a confirmatory method. The new method shows several advantages such as higher specificity, cut-off lower than the rapid tests and the ability to provide both quantitative and qualitative results. The aim is to validate a diagnostic kit for the spectrometric quantification of drugs of abuse, in this work of amphetamines, cocaine and methadone. The reagents, controls and calibrators are supplied by the company Eureka Italy, using a UHPLC Agilent Technologies, and a triple quadrupole mass spectrometer Agilent Technologies, associated with ESI source. Due to time constraints it was not possible to obtain all the necessary values to the validation. With the preliminary results, however, we can already identify the problems of accuracy, which suggest a problem of stability or assembly of QC, for this reason, the objective set was not reached, a result of other considerations will be taken into diagnostic kits or company Eureka solve the problems encountered in the QC. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 3

5 1. Introduzione 1.1. Le droghe d abuso Epidemiologia Le droghe d abuso sono tutt oggi uno dei principali problemi della società, nel 2010 l Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) riporta che dai 135 ai 300 milioni di persone nel mondo hanno fatto uso di sostanze illecite nell anno precedente, nell età compresa tra i 15 ed i 64 anni ( % di popolazione mondiale in quel gruppo di età), con un tasso di mortalità di circa %. In Europa, con il 5.2% della popolazione, i cannabinoidi sono la droga più consumata, seguita dalla cocaina con l 1.3%, seguita dalle anfetamine ed infine dagli oppiacei. Anche per quanto riguarda la Svizzera, i cannabinoidi sono la droga più consumata. È stato dimostrato tramite un inchiesta che fra i quindicenni il 34% dei ragazzi ed il 28% delle ragazze hanno provato la canapa almeno una volta. Circa un quinto della popolazione di età compresa fra 15 e 64 anni invece ammette di aver fumato hashish almeno una volta, e fra questi un quarto circa ammette di continuare a farlo. Ad oggi, si stima che in Svizzera un numero di persone tra i 500'000 ed i 600'000 faccia uso di cannabinoidi, mentre per quanto riguarda le droghe pesanti (anfetamina, cocaina ed oppiacei), il numero di tossicodipendenti si aggira intorno alle 30'000 persone. Il rapporto dell'organismo delle Nazioni Unite, International Narcotics Control Board del marzo 2005, indica che la Svizzera è uno dei pochi paesi europei in cui il consumo di cocaina ed anfetamine è in aumento. [16] [7] Concetti generali La parola droga viene utilizzata per identificare qualsiasi sostanza capace di modificare l umore, la percezione della realtà oppure il comportamento della persona che l assume, causando un effetto di tossicodipendenza molto variabile. Il termine di abuso viene utilizzato per le droghe illegali, o per quelle che non vengono assunte per scopo terapeutico, per esempio le benzodiazepine. Le droghe d abuso possono essere classificabili in tre differenti categorie dipendenti dalla loro attività sul sistema nervoso centrale (SNC): psicolettiche (deprimono l attività mentale) psicoanalettiche (eccitatori dell attività mentale) psicodislettiche (capacità di alterazione del comportamento e delle percezioni) Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 1

6 Le droghe sono delle sostanze di origine naturale o sintetica aventi principi psicoattivi, queste sostanze possono essere assunte in vari modi, i più comuni sono: endovenosa inalazione orale A dipendenza della sostanza assunta gli effetti sull organismo posso essere di diverso genere. Queste sostanze sono tossiche per l organismo umano, infatti un uso eccessivo sia in quantità sia in durata possono portare a gravi disturbi, sia psichici sia fisici, fino a portare alla morte. Quando la droga viene assunta, il corpo metabolizza questa sostanza tramite il fegato che le trasforma in metaboliti adatti all eliminazione. Il fegato, modificando le sostanze assunte, può produrre metaboliti attivi aventi anch essi effetti sull organismo. Un esempio è l eroina, un oppiaceo, che dopo l assunzione viene rapidamente trasformata in morfina. Sia i metaboliti sia la sostanza assunta, dopo essere stati processati dal fegato per creare i prodotti d eliminazione, si accumulano in vari tessuti: grasso capelli parenchima (tessuto caratteristico di un organo sia per la funzionalità che per la struttura) Tutte le sostanze che vengono prodotte dall organismo per l eliminazione, restano nei tessuti a cui sono più affini, e vengono espulsi dall organismo in tempistiche diverse per ogni tipo di droga. Il tempo di rivelazione nei test di screening sono diversi, queste differenze sono date sia dal metodo del test, sia dalla frequenza di assunzione della sostanza. Infatti se una sostanza viene assunta regolarmente, questa può accumularsi maggiormente all interno dei tessuti aumentando di conseguenza il suo tempo di rivelazione. Ad esempio, per i cannabinoidi, il tempo di rilevazione nelle urine va da 7 giorni (circa) per un fumatore occasionale, a giorni per un forte fumatore. Per l analisi delle droghe è possibile utilizzare diversi fluidi biologici, ma il più utilizzato per verificare l assunzione di droghe è l urina, questo perché può essere raccolta con metodi poco invasivi. Le molecole possono anche essere ritrovate nel sangue, nella saliva, nel sudore e nei capelli. [13] Le principali classi di droghe d abuso sono: anfetamine, cannabinoidi, cocaina ed oppiacei Anfetamine Queste droghe sono di tipo sintetico, ottenute tramite delle reazioni chimiche prodotte in laboratori clandestini. Viene assunta per via orale e la sua eliminazione nelle urine è fortemente dipendente dal ph; dopo 20 minuti dall assunzione è possibile riscontrarne la presenza nelle urine, ed in ore avviene l intera escrezione. Le sostanze per questa classe di droghe sono diverse, le più conosciute sono: Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 2

7 Ecstasy o MDMA Metanfetamine Efedrina Ketamina Per la famiglia delle anfetamine esistono differenti tipi di droghe che si basano sulla durata ed effetti che producono: allucinogeni (modificazioni della percezione, pensieri e sensazioni) empatogeni (aumentano l empatia della persona) entactogeni (energizzanti, euforici) sedativi stimolanti stati d euforia psichedelici (allargamento della coscienza e superamento della realtà) anoressizzanti L azione più importante che producono le anfetamine, è quella di stimolare direttamente il rilascio di dopamina nei neuroni a livello delle presinapsi, inoltre bloccano il feedback negativo della dopamina bloccando la produzione di dopamina all interno del neurone. Le anfetamine agiscono anche sul rilascio di noradrenalina, adrenalina e serotonina. [1] I differenti tipi di anfetamine causano tutte dei danni all organismo; alcune possono portare alla morte con una sola dose e, spesso, la causa della morte è l associazione di altre sostanze d abuso, come per esempio i cannabinoidi e gli alcolici. [5] [13] [14] Cannabinoidi I cannabinoidi sono droghe di origine naturale derivati dalla pianta della canapa (Cannabis sativa). Il principio psicoattivo per questo gruppo di droghe è il THC ( 9 tetraidrocannabinolo). La canapa da droga non è facilmente differenziabile da quella tessile, infatti il tessuto, la carta o le corde sono realizzati utilizzando gli arbusti della pianta, mentre l hashish e la marijuana sono ottenuti grazie all infiorescenza della pianta; per questo motivo a livello europeo si considera canapa stupefacente la pianta con una concentrazione di THC superiore allo 0,5%. Nel commercio si trovano diversi preparati contenenti THC: la marijuana è ottenuta miscelando diverse parti della pianta contenenti da 0,5-1,5% di THC; viene fumata da sola oppure con aggiunta di tabacco. l hashish è costituita dalla resina pura estratta dal fiore della pianta contenente il 3-7% di THC. l olio di hashish è un concentrato di materiale vegetale con un THC dal 20-40% ed è aggiunto alle canne per aumentarne il contenuto di principio psicoattivo. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 3

8 Il THC viene assorbito sia dal tratto gastrointestinale, in modo lento ed irregolare, sia per via inalatoria, con un assorbimento più rapido. I principali effetti prodotti dai cannabinoidi sono: diminuzione della forza muscolare e della fermezza delle mani diminuzione dell'equilibrio e la stabilità della postura apatia tristezza compromissione del giudizio compromissione della concentrazione e della memoria In svariate aree del cervello sono presenti dei recettori specifici per una molecola endogena chiamata anandamide; essa, legandosi ai recettori del THC, genera gli stessi effetti del principio psicoattivo. Si ha quindi un meccanismo dove questa molecola si lega in modo naturale al recettore. L'anandamide è coinvolta nella regolazione dell'umore, della memoria, dell'appetito, del dolore, della cognizione e dell emozioni. Quando il principio attivo 9 -tetraidrocannabinolo si lega al recettore può interferire con tutte queste funzioni. Il THC inizia questo processo legandosi ai recettori CB1 per l anandamide. Questi recettori modificano quindi l'attività di diversi enzimi intracellulari, riducendone l attività. La ridotta attività enzimatica colpisce il potassio ed i canali del calcio così da ridurre la quantità di neurotrasmettitori rilasciati e quindi l'eccitabilità generale delle reti neurali del cervello. Tuttavia nel circuito di feedback viene rilasciata più dopamina. Questo aumento si spiega con il fatto che i neuroni dopaminici sono normalmente inibiti da neuroni GABAminici, Il THC elimina l inibizione dei neuroni GABAmininici attivando i neuroni dopaminici. Nei consumatori cronici di cannabis, la perdita dei recettori CB1 nel arterie del cervello riduce il flusso di sangue e quindi di glucosio ed ossigeno, al cervello. I risultati principali sono di conseguenza deficit di attenzione, perdita di memoria, e ridotta capacità d apprendimento. L eliminazione avviene sia attraverso le urine per 1/3 della dose assorbita, sia attraverso le feci per 2/3. Si riscontra la presenza nelle urine di THC dopo 3 giorni dall assunzione se è stata assunta solo una volta, e da 30 a 80 giorni rispettivamente in caso di consumo occasionale (una volta a settimana) o continuo. Questo tipo di tempistica è da attribuire alla cinetica del THC che è molto affine ai tessuti adiposi. [13] [14] [9] [2] Cocaina La cocaina è una droga di origine naturale contenuta nelle foglie di Erithroxylon coca. Queste vengono essiccate e lavorate fino ad ottenere una pasta dalla quale, dopo diversi passaggi, si estrae il principio psicoattivo. La cocaina è ben assorbita in qualsiasi via di somministrazione. I principali effetti prodotti dalla cocaina sono: stimolanti del sistema nervoso centrale (SNC) euforia fiducia benessere immediato Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 4

9 diminuita sensazione di stanchezza, fame e sete maggiore socievolezza e facilità di relazione instancabilità aumento della libido L effetto più importante della cocaina è quello di bloccare il feedback negativo della dopamina bloccando il recettore che inibisce la produzione di dopamina. Il blocco del feedback negativo crea un conseguente aumento dei livelli di dopamina nelle sinapsi nel cervello. Oltre a bloccare il feedback dopaminico, la cocaina blocca anche il feedback della noradrenalina e della serotonina. Il ruolo delle azioni della cocaina sulla noradrenalina e sulla serotonina non è ancora del tutto chiaro. [1] L eliminazione di questa droga avviene tramite le urine ed è molto influenzata dal ph, il tempo di eliminazione varia a dipendenza del metabolismo da 30 minuti a circa 8 ore massimo. È possibile invece ritrovare delle tracce di metaboliti della cocaina nelle urine fino, a 5 giorni dopo l assunzione. [13] [14] [12] [11] Oppiacei L oppio è costituito da lattice essiccato del papavero bianco (papaverum somniferum), ottenuto per incisione delle capsule seminifere ancora verdi. In questo lattice è presente circa il 10-20% di sostanza stupefacente, costituita prevalentemente da morfina (8-14%). L oppio grezzo si ottiene essiccando il lattice e riducendolo in polvere, dopodiché si può aggiustare il contenuto di morfina. L eroina invece è prodotta tramite acetilazione della morfina. Il metadone invece è una sostanza ottenuta per sintesi in laboratorio, chimicamente differente dalla morfina; ciononostante viene classificato come oppioide sia per l azione farmacologica simile alla morfina, sia perché viene utilizzato come sostituto dell eroina in terapie di disintossicazione. I principali effetti prodotti dagli oppiacei sono: antidolorifico piacere intenso e immediato (flash) pesantezza alle articolazioni prurito nausea vomito costipazione acuta dolori intestinali e di stomaco diminuzione della libido Questi farmaci, quando somministrati nel corpo, imitano neurotrasmettitori peptidici oppioidi (endorfine) endogeni. Le endorfine sono coinvolte in tre principali funzioni: la modulazione del dolore e la percezione di risposta agli stimoli dolorosi; Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 5

10 la regolamentazione delle funzioni omeostatiche, come cibo, acqua; la regolazione della temperatura. I principali tipi di recettori oppioidi sono stati identificati nel cervello, sono chiamati mu, delta e kappa e sono legati a recettori secondari all'interno della cellula. In generale, le endorfine, hanno un effetto generalmente inibitorio su tutte le popolazioni di neuroni, producendo un profondo senso di euforia e benessere accoppiati alla sedazione, il relax e l'aumento della soglia del dolore. Gli studi sugli animali hanno dimostrato che gli oppiacei aumentano l'attività dei neuroni dopaminici in determinate aree del cervello. I neuroni dopaminici vengono inibiti normalmente da neuroni GABA. Poiché gli oppiacei inibiscono l attività neurale, quando i recettori mu sono attivati, i neuroni GABA vengono anch essi inibiti e questo induce un aumento di produzione di dopamina, prodotta dai neuroni dopaminici, i quali non subiscono l effetto inibitorio dei neuroni GABA. Questo aumento di dopamina produce sensazioni stimolanti e gratificanti. La morfina è assorbita facilmente dal tratto GI, dalla mucosa nasale, dai polmoni e per via sottocutanea o intramuscolare. Si accumula facilmente e rapidamente nel parenchima degli organi pieni. L eliminazione è veloce ed avviene attraverso le urine e la bile con un tempo di dimezzamento di circa 1-7 ore con la possibilità di identificarne la presenza dopo 48 ore. Il metadone è differente dagli altri composti oppioidi perché è più stabile, viene assunto per via orale e si concentra nei tessuti adiposi dove si accumula a concentrazioni elevate per diverso tempo. L eliminazione di questa droga infatti è molto lenta con tempo di dimezzamento da ore. Gli effetti prodotti sono simili a quelli dell eroina. [14], [13] [6] [1] 1.2. Tecniche Metodo di screening I metodi analitici più utilizzati per identificare la presenza di droghe d abuso sono immunochimici o immunocromatografici. Tali metodi sono alla base dei test rapidi che si eseguono, in campo diagnostico e/o legale. Il principio dei metodi sopraccitati è di tipo antigene-anticorpo Sistema Immunochimico È un sistema a competizione ed utilizza degli anticorpi e degli antigeni marcati. L antigene marcato è una molecola uguale all analita ricercato oppure è una molecola che reagisce nello stesso modo con l anticorpo presente nel test. Nelle membrane assorbenti sono contenuti gli antigeni marcati (per esempio cocaina) con enzimi o molecole fluorescenti e gli anticorpi, che sono immobilizzati alla membrana assorbente. Il campione viene assorbito dalla membrana e per capillarità attraversa tutta la superficie, spostando l antigene marcato. Se l analita ricercato è presente nel campione, esso si legherà sugli anticorpi immobilizzati alla membrana. Mentre se l analita non è presente si legheranno gli antigeni marcati, che grazie al legame antigeneanticorpo produrranno la reazione chimica, visibile con una striscia colorata. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 6

11 Sistema immunocromatografico Questo metodo utilizza il principio antigene-anticorpo a competizione esattamente come per i test immunochimici. La differenza consiste nella marcatura dell antigene, che avviene tramite l aggiunta di una molecola colorata. In EOLAB si utilizza lo screening droghe della ditta MD Doctors Direct, Instant - View metodo a goccia che utilizza i campioni di urina fresca. Questo test identifica 12 classi di droghe con i rispettivi Cut-Off, cioè la quantità minima definita per legge che indica un assunzione volontaria a scopo illecito: Classe Droga Cut-Off (ng/ml) Metadone (MTD) 300 Benzodiazepine (BZD) 300 Cocaina (COC) 300 Anfetamine (AMP) 1000 Metamfetamine (MET) 1000 Morfina/Oppiacei (MOR) 300 Barbiturici (BAR) 300 Tetraidrocannabinolo (THC) 50 Antidepressivi triciclici (TCA) 1000 MDMA/XTC/Ecstasy (MSMA/XTC) 500 Fenciclidina (PCP) 25 Propossifene (PPX) 300 Tabella 1: Cut-Off Istant-Vew metodo a goccia Per entrambi i metodi descritti i risultati che si riscontrano sono di tipo qualitativo cioè positivo o negativo. I vantaggi di questi test sono: la rapidità di visualizzazione del risultato i costi la capacità degli anticorpi di riconoscere tutte le molecole che appartengono alla stessa famiglia della droga assunta La capacità degli anticorpi di legarsi ai metaboliti della medesima famiglia è perfetto per l utilizzo di questi anticorpi in test di screening. Con un test di screening si vuole solamente evidenziare una positività o una negatività nel risultato, non è importante conoscere esattamente la sostanza assunta dal paziente. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 7

12 Gli svantaggi sono: La bassa specificità degli anticorpi, la capacità di riconoscere molte molecole simili, porta a una bassa specificità; è quindi possibile che i risultati riscontrati con i test di screening siano dei falsi positivi o falsi negativi. Gli anticorpi utilizzati in questi test rapidi, possono fare delle reazioni crociate con sostanze analoghe all analita ricercato, queste sostanze analoghe sono presenti nel campione del paziente. Le sostanze che possono creare delle reazioni crociate sono frequentemente dei farmaci, oppure delle sostanze di origine naturale assunte con la dieta. Gli anticorpi utilizzati nel test che offre EOLAB mostrano in una tabella le sostanze, che con un cut-off maggiore a 100 μg/ml possono dare interferenze, e produrre dei risultati falsi positivi o falsi negativi. [10] [15] Per questo motivo si vuole introdurre un metodo di conferma che non utilizzi un principio di tipo antigene-anticorpo Metodo di conferma Per confermare la presenza d abuso di droga è necessario utilizzare un metodo più specifico e più sensibile, rispetto al sistema di screening in uso. Utilizzando un altro metodo si può avere la possibilità di quantificare esattamente la sostanza presente nel campione. Il metodo in questione è la cromatografia in fase liquida abbinata alla spettrometria di massa tandem(lc-ms/ms). Questa tecnica è suddivisa in due blocchi: High Performance Liquid Cromatography (HPLC) spettrometria di massa (MS) I vantaggi che presenta questa tecnica sono: maggiore sensibilità perché ha un cut-off molto più basso rispetto ai metodi immunochimici e immunocromatografici. maggiore specificità confrontandolo con i test rapidi perché è in grado di selezionare la sostanza in analisi e di validarla misurando i frammenti specifici della stessa, senza problemi di reazioni crociate. capacità di fornire contemporaneamente risultati di tipo qualitativo e quantitativo per tutte le sostanze analizzate High Performance Liquid Cromatography (HPLC) L HPLC è un sistema di separazione del campione che grazie a colonne cromatografiche contenenti una fase stazionaria, rallentano le molecole contenute nel campione in base alle loro caratteristiche chimiche o fisiche. È molto importante quindi sapere esattamente la struttura della molecola d interesse, poiché esistono differenti tipologie di colonne che utilizzano fasi stazionarie: Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 8

13 Size-exclusion chromatography, SEC, separazione basata sulla grandezza Ion-exchange chromatography, IEC, interazione elettrostatica Reversed-phase chromatography, RPC, interazione idrofobica Ion-pair reversed-phase chromatography, IP-RPC, interazione elettrostatica e idrofobica Affinity chromatography, AC, interazione biospecifica Il primo tipo di colonna cromatografica utilizza esclusivamente le caratteristiche fisiche (la grandezza) della molecola, mentre le altre quattro colonne elencate, utilizzano sistemi d interazione con la molecola per esempio di tipo elettrostatico dove la fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, cioè un supporto organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili. I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, ioni di carica opposta. Il meccanismo di separazione è basato perciò sulla diversa affinità dei soluti nei confronti dei gruppi attivi della resina. L interazione idrofobica utilizza una colonna con una fase stazionaria idrofoba, e permette di rallentare le molecole in base al loro grado di idrofobicità. L interazione biospecifica è in grado di separare le molecole sulla base di un'interazione reversibile tra una proteina (o gruppo di proteine) e un ligando specifico fissato alla colonna. Permette la purificazione di una biomolecola sulla base della sua funzione biologica o struttura chimica individuale. Nell analisi delle droghe d abuso si utilizzano delle colonne cromatografiche di tipo Reversed- Phase Chromatography (RPC). Le colonne contengono una fase stazionaria idrofobica, composta da silicio con catene alifatiche. Il campione viene immesso in una fase mobile polarizzata idrofila (esempio acqua), con aggiunta di acidi polari per aumentare l efficienza di ionizzazione, la ritenzione avviene tra gli analiti idrofobici e la fase stazionaria idrofobica. Dopo la ritenzione degli analiti si aggiunge un solvente organico per effettuare l eluizione delle molecole trattenute dalla fase stazionaria. [4] Figura 1: RPC-HPLC Nicole Marforio TAB3 LD 2012/2013 9

14 Spettrometria di Massa (MS) Nello spettrometro di massa il campione, che può essere solido, liquido o gassoso, viene immesso in una camera dove viene ionizzato tramite una sorgente. Gli ioni prodotti dalla sorgente si troveranno in fase gassosa e verranno separati in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Dopo questa separazione gli ioni selezionati saranno raccolti da un rivelatore che darà un segnale elettrico proporzionale al numero di ioni presenti. Il segnale verrà quindi convertito in uno spettro di massa. Il funzionamento dello spettrometro di massa può essere suddiviso in tre passaggi: 1. produzione di ioni (ionizzazione) 2. frammentazione e separazione (scelta degli ioni in base alla m/z) 3. rivelazione Ionizzazione La produzione di ioni avviene attraverso delle apposite sorgenti. La sorgente utilizzata per le droghe d abuso è una API (Atmospheric Pressure Ionization). Il campione viene dissolto in un solvente appropriato ed introdotto nella sorgente ionica. Esistono differenti tipi di sorgenti API: Electrospray Ionization (ESI) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Atmospheric Pressure Photoionization (APPI) Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization (AP-MALDI) La sorgente utilizzata per l analisi delle droghe d abuso è la ESI. Il campione in fase liquida arriva all interno della sorgente e passa attraverso un capillare, dove è applicato un potenziale elettrico che ionizza il campione, all uscita del capillare, il liquido viene investito da un flusso di gas (solitamente azoto) necessario per la nebulizzazione e l evaporazione del campione. A questo punto, le molecole ionizzate ed in fase gassosa entrano nello spettrometro. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

15 Figura 2: Sorgente ESI Separazione, selezione e frammentazione Il processo di separazione e scelta degli ioni in base al loro rapporto m/z, avviene mediante degli analizzatori all interno dello spettrometro di massa. Esistono differenti analizzatori in spettrometria di massa: quadrupolo settore magnetico settore elettrico tempo di volo trappola ionica risonanza ciclotronica Il principio di tutti questi sistemi è quello di accelerare, separare e selezionare gli ioni d interesse. L analizzatore più utilizzato per le analisi quantitative, analizzatore utilizzato anche presso EOLAB, è quello a triplo quadrupolo. Questo analizzatore consiste in tre camere ad alto vuoto ognuna delle quali contenenti quattro cilindri chiamati elettrodi (quadrupoli). I quattro elettrodi vengono suddivisi a coppie alle quali viene applicata una polarità opposta (positiva o negativa). La prima camera viene utilizzata come filtro, infatti all interno avviene una prima separazione basata sul rapporto m/z. Alle coppie di elettrodi viene applicato un voltaggio ed una Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

16 radiofrequenza che consiste nella velocità in cui le due coppie di elettrodi invertono la loro polarità, da negativo a positivo e viceversa. La radiofrequenza (velocità di scambio delle polarità tra le coppie di elettrodi) produce un moto oscillatorio degli ioni presenti nel quadrupolo, in modo da poterli spostare fino alla camera successiva ed esercitare una prima filtrazione. Gli ioni presenti nel quadrupolo si spostano, seguendo delle traiettorie ad onda, in base al rapporto m/z, alla polarità degli elettrodi ed alla radiofrequenza. Per ogni rapporto m/z esiste una sola radiofrequenza in grado di stabilizzarne la traiettoria, permettendone il passaggio alla camera successiva. Alla stessa radiofrequenza, tutte le molecole con differenti rapporti m/z seguono traiettorie che li faranno collidere con gli elettrodi o espellerli dal quadrupolo. Figura3: Quadrupolo eight=350&width=510 Nella seconda camera, chiamata cella di collisione, è contenuto un gas inerte. Aumentando il potenziale applicato agli elettrodi, gli ioni che entrano nella cella di collisione possono essere accelerati. L elevata energia cinetica, data dalla maggior velocità di movimento, unita agli urti con le molecole di gas inerte, causa la frammentazione degli ioni presenti nella cella di collisione. A seconda del potenziale applicato agli elettrodi, potrò conferire più o meno velocità (e quindi energia cinetica) agli ioni, selezionando di fatto il livello di frammentazione desiderato. Nell ultima camera avviene una seconda filtrazione, basata sul principio della prima camera. Tutto il sistema di filtrazione e frammentazione degli ioni è sotto alto sottovuoto. [3] Rivelazione Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

17 Il rivelatore si posiziona alla fine delle tre camere e la rivelazione degli ioni avviene grazie ad un tubo fotomoltiplicatore. In pratica, gli ioni collidono con una placca di metallo a cui viene applicato un potenziale. La collisione degli ioni produce un emissione di elettroni dalla placca proporzionale alla quantità di ioni che collidono. Gli elettroni emessi vengono amplificati a cascata fino alla generazione di un impulso elettrico proporzionale alla quantità di ioni che entrano nel detector.[3] Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

18 2. Obiettivo del lavoro L analisi di screening di droghe d abuso è un analisi di routine in ambito ospedaliero e risulta spesso necessario poter confermare i test positivi. Ad oggi tutti i test di conferma sono effettuati in svizzera interna in quanto mancava in EOLAB sia la strumentazione sia il know-how (competenze) per poter effettuare i test. Grazie all acquisizione della spettrometria di massa per le analisi farmacologiche già introdotte, EOLAB è ora in grado d introdurre i test di conferma per le droghe d abuso. Obiettivo di questo lavoro di diploma (LD) è la validazione di un kit diagnostico per la quantificazione spettrometrica di droghe d abuso, comprendente 3 protocolli di preparazione del campione, basati sulla classe di appartenenza dell analita. Il presente LD si concentrerà sulla validazione del pannello di Amfetamine, cocaina e metadone. Questo lavoro di diploma ha come scopo finale quello di avere un metodo più accurato e preciso rispetto ai test rapidi attualmente in uso, utilizzabile come sistema di conferma. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

19 3. Materiali e metodi 3.1. Reagenti, QC e Calibratori Per questo LD si sono utilizzati i calibratori ed i controlli di qualità (QC) della ditta Eureka srl- LAB DIVISION Italia, Kit Sostanze d Abuso urinarie in LC-MS Cod. LC74010 Metodo di conferma in LC-MS che rispetta la Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). Il kit permette di analizzare 27 molecole di 4 classi di droghe diverse. I QC ed i calibratori vengono forniti in forma liofilizzate e sono conservati a -80 C. Al momento dell utilizzo vengono ricostituiti con un quantitativo di 5 ml di acqua ultra pura specifica per applicazioni in spettrometria di massa (water LC-MS). Dopo l aggiunta di acqua vengono miscelati con appositi agitatori per 5-10 minuti. Il processo successivo è quello di preparare delle aliquote di 500 μl che vengono poi conservate a -20 C. I reagenti presenti nel kit sono 6: Reagente A, soluzione per idrolisi 9 -THC-COOH 1x2 ml Reagente B, enzima di idrolisi Droghe 2x1 ml Reagente C, soluzione tampone per idrolisi 1x20 ml Reagente D, soluzione diluente 1x150 ml Reagente E, standard interno 3 flaconi Reagente M1, fase mobile M1 1x500 ml Reagente M2, fase mobile M2 1x500 ml Reagenti da ricostituire al momento dell uso: Reagente B aggiunta di 9.0 ml di reagente C Reagente E aggiunta di 50 ml di reagente D Tutti i reagenti vengono conservati a 2-8 C e sono stabili per 3 anni. Eccezione per il reagente E non ricostituito la cui conservazione è a -20 C, mentre quando viene ricostituito la conservazione è 2-8 C ed è stabile un anno. [8] 3.2. Preparazione campioni Per effettuare l analisi su i QC ed i calibratori aliquotati si sono seguite le istruzioni rilasciate dalla ditta Eureka. I protocolli previsti sono tre e vengono utilizzati in base alla molecola che si vuole analizzare. I protocolli sono stati identificati in sequenza 1, 2 e 3. Il protocollo 1 viene utilizzato per tutte le analisi del presente LD: 3.4-MDE Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

20 3.4-MDMA 3.4-MDA anfetamina metanfetamina efedrina pseudoefedrina norpseudoefedrina ketamina cocaina benzoilecgonina (BEG) cocaetilene metadone EDDP Il protocollo 1 consiste in: scongelamento dei campioni, QC e Calibratori miscelazione e centrifugazione dei campioni pipettare una porzione del campione all interno delle vial (provette apposite per HPLC) aggiungere dello Standard Interno (SI) miscela il campione per 10 secondi Il campione così preparato è pronto per essere immesso nell HPLC-MS. [8] 3.3. Strumenti d analisi HPLC UHPLC 1290 Agilent Technologies Colonna utilizzata: Zorbax Eclipse Plus C18, Rapid Resolution HD, 2.1x50mm, 1.8μm T (min.) M1 M2 A% B% Tabella 2: Protocollo di estrazione HPLC Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

21 Nella tabella 2 vengono descritte le percentuali delle fasi mobili all interno della colonna per effettuare l analisi delle molecole d interesse. In 5 min. la colonna ha analizzato completamente il campione ed ha effettuato il ricondizionamento quindi è pronta per un nuovo campione Spettrometro di Massa Spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) modello 6460 Agilent Technologies, associato a sorgente ESI Sorgente ESI GAS Temp. 290 C GAS Flow 6 L/min. Capillare 3500 Volt (+) Tabella 3: Informazione Sorgente ESI Nella tabella 3 sono presenti i parametri utilizzati per effettuare la ionizzazione del campione con la sorgente ESI Statistica Per la parte statistica sono state calcolate le seguenti formule: Coefficiente di variazione percentuale (CV%) intraday e interday Deviazione Standard (SD) Media (M) Accuratezza CV% formula: SD formula M formula: Accuratezza formula: Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

22 Il CV% intraday significa un insieme di campionature nella stessa serie di analisi con la stessa curva di calibrazione, mentre il CV% interday è l insieme di campionatura di serie indipendenti di analisi in giorni diversi e con curve di calibrazione differenti. I valori che si sono ottenuti servono per la determinazione di riproducibilità, efficacia e precisione del metodo. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

23 4. Risultati 4.1. Intraday I risultati Intraday sono stati ottenuti analizzando nello stesso giorno 10 aliquote di ogni singolo campione. Il dettaglio di tutti i risultati è visionabile negli allegati. Anfetamine Norpseudoefedrina CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Efedrina Pseudoefedrina CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% MDA 3,4-MDMA CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Metanfetamina 3,4-MDE Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

24 CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Ketamina Cocaina CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore bersaglio Media DS CV% Accuratezza% EDDP Metadone CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% BEG Cocaetilene CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

25 4.2. Interday I risultati presenti nelle tabelle dell Interday sono stati ottenuti con 7 misurazioni in 7 giorni differenti. Il dettaglio dei valori ottenuti nelle singole sessioni di analisi è visionabile negli allegati. Efedrina Pseudoefedrina CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Norpseudoefedrina 3,4 MDMA CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Metanfetamina Anfetamina CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% ,4 MDA 3,4 MDE Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

26 CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Ketamina Cocaina CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% BEG Cocaetilene CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Metadone EDDP CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore Bersaglio Media DS CV% Accuratezza% Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

27 5. Discussione 5.1. Intraday I risultati riscontrati nei calcoli dell Intraday mostrano che, per entrambi i livelli di controllo analizzati, i CV% di tutte le 14 molecole analizzate in questo studio sono inferiori al 12.5%. Questo dato evidenza l elevata precisione dell analisi valutata sui 10 replicati. Nonostante l elevata precisione, il calcolo dell accuratezza evidenzia che il 40% dei QC risulta essere più del 20% superiore o inferiore al valore bersaglio definito dal kit indicando una scarsa accuratezza per 12 parametri su Interday Le campionature per la determinazione dei parametri sulla riproducibilità interday non sono complete; infatti i risultati ottenuti sono basati su una campionatura di 7 sedute sperimentali, sulle 10 necessarie per la completa valutazione statistica. I primi esperimenti interday, da novembre fino a dicembre, hanno mostrato delle problematiche di accuratezza con il kit fornito, per questo motivo abbiamo contattato la ditta Eureka per evidenziare i problemi riscontrati, richiedendo un nuovo kit con lotto differente. Contemporaneamente, nel mese di novembre, è stata introdotta in routine l analisi per gli immunosoppressori (tacrolimus, ciclosporina, sirolimus ed everolimus). Nel mese di febbraio in aggiunta agli immunosoppressori sono stati introdotti i dosaggi di micofenolato e 22 medicamenti antiepilettici. L elevata rilevanza clinica di queste nuove analisi, ed il tempo richiesto per la loro effettuazione sullo spettrometro di massa, hanno ridotto drasticamente il tempo disponibile per la validazione delle droghe d abuso. Per questo motivo le campionature per il lavoro di diploma sono state riprese solamente ad aprile, con conseguente inpossibilità a completare le campionature necessarie nel tempo stabilito per eseguire lo studio. I dati preliminari fino ad ora ottenuti possono comunque evidenziare un CV% inferiore al 13.4%, che denota elevata precisione del kit. I dati preliminari di accuratezza mostrano invece che, il 40% (10 su 28) dei risultati ottenuti da entrambi i livelli per tutti e 14 analiti, hanno un accuratezza superiore o inferiore al 20%. Si può notare inoltre che le molecole aventi problematiche d accuratezza, sono le stesse sia per i risultati d intraday che per i valori d interday con la stessa tendenza di errore verso l alto o verso il basso. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

28 6. Conclusioni Il lavoro per verificare la validità del kit continuerà fino ad ottenere tutte le campionature necessarie per avere i risultati completi. I valori intraday e interday mostrano una buona precisione perché abbiamo ottenuto dei valori inferiori al 13.4%, mentre per quanto riguarda l accuratezza i risultati preliminari evidenziano numerosi parametri inadeguati per un kit diagnostico. I risultati preliminari da noi ottenuti, uniti alle valutazioni di altri utilizzatori del medesimo kit (i quali, sugli stessi lotti non notano accuratezze anormali) ed alle indicazioni della ditta produttrice, ci fanno ipotizzare una possibile problematica nella stabilità di alcune molecole; In particolare anfetamina, norpseudoefedrina, cocaina, 3-4MDMA, metanfetamina, EDDP e BEG. Il problema sembra essere dovuto alla degradazione degli analiti nella fase di giacenza durante lo sdoganamento; questa operazione può infatti richiedere diverse ore o giorni, con un sistema di conservazione probabilmente inadeguato. Per questo motivo al termine delle campionature e dopo la valutazione finale di tutti i risultati, si vorrà chiarire il motivo di quest accuratezza al di fuori dei parametri attesi. In conclusione l obiettivo posto all inizio del lavoro, cioè la validazione del kit diagnostico per le droghe d abuso, in particolare anfetamine, cocaine e metadone non è stato al momento raggiunto. Gli esperimenti condotti durante il presente LD, hanno comunque permesso l individuazione del possibile problema, e posto le basi per la ricerca di una possibile soluzione. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

29 7. Ringraziamenti Ringrazio Dr. Franco Keller Capo Dipartimento di EOLAB per aver dato la possibilità di effettuare questo lavoro di diploma, Dr. Marco Cantù per la sua disponibilità e Cinzia Benagli per aver svolto il lavoro pratico. Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

30 8. Bibliografia 1. Assessment, O. o. (1993). The Neuropharmacology of Drugs of Abuse. In Biological Components of Substance Abuse and Addiction. Washington, USA: Government printing Office. 2. Bottom, T. B. (s.d.). How drugs affect neurotransmitters. Tratto il giorno Aprile 20, 2013 da H: 3. Bramer, S. E. (1998). An Introduction to Mas Spectrometry. Widener University, Department of Chemistry. 4. Delmotte, N. (2007). Development of multidimensional liquid chromatographic methods hyphenated to mass spectrometry, preparation and analysis of complex biological samples. Tesi di Dottorato, Ecstasy.info. (2011, Ottobre 19). Tratto il giorno Settembre 2012 da di ecstasy.htm 6. Effetti. (2010). Tratto il giorno 03 03, 2013 da Comunità di recupero: 7. Esteri, D. d. (s.d.). Swissworld. Tratto il giorno Aprile 8, 2013 da 8. Eureka, D. (2012). Droghe d'abuso urinarie in LC-MS Cod. LC74010 Metodo di conferma in LC-MS. Chiaravalle. 9. Fumatori, A. S. (s.d.). Effetti della Marijuana e dell'hashish, Cannabis, effetti collaterali, dipendenza o non dipendenza. Tratto il giorno 02 16, 2013 da Inc., A. S. (2012, 12 03). Instant-View Multi-Drug of Abuse Urine Test Italiana, R. S. (s.d.). cocaina coca, neve, freebase, crack. Tratto il giorno 02 16, 2013 da Danno: Onlus, A. (s.d.). Stop cocaina. Tratto il giorno 02 16, 2013 da Salerno, C. (2008, Gennaio 12). Scriptaweb. Tratto il giorno Ottobre 11, 2012 da scriptaweb.it/extra/salerno/appuntibiochimica/a13/testo.htm 14. SCDAT. (2011, 08 21). SCDAT Guidlines for drugs of abuse testin. Tratto il giorno da SOP, E. (2012). Screening. Bellinzona: EOLAB. 16. UNODC. (2012). Tratto il giorno Aprile 8, 2013 da WHO: Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

31 9. Allegati A. Risultati e tabelle Intraday B. Risultati e tabelle Interday Nicole Marforio TAB3 LD 2012/

32 Date Cocaina BEG Cocaetilene Metadone CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore bersaglio Media DS CV% Accuratezza Date Ketamina EDDP CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Allegato B2 Valore bersaglio Media DS CV% Accuratezza

33 Efedrina Pseudoefedrina Norpseudoefedrina 3,4 MDMA Date CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Valore bersaglio Media DS CV% Accuratezza Metanfetamina Anfetamina 3,4 MDA 3,4 MDE Date CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml Allegato B Valore bersaglio Media DS CV% Accuratezza