Tecniche Diagnostiche molecolari

Tecniche Diagnostiche molecolari

Tecniche di Biologia Molecolare La scoperta che il DNA è alla base di tutte le funzioni della cellula ha aperto la strada allo sviluppo di una disciplina denominata biologia molecolare Lo sviluppo delle metodologie e delle tecniche per isolare, analizzare, manipolare e utilizzare gli acidi nucleici ha determinato lo sviluppo di interessanti settori come le biotecnologie, le mappature dei genomi, la medicina molecolare e la terapia genica. Molte tecniche utilizzate in biologia molecolare imitano le funzioni naturali degli acidi nucleici

Struttura degli acidi nucleici Il DNA e l RNA sono macromolecole organizzate come polimeri, ottenuti dalla ripetizione di nucleotidi Il DNA contiene le informazioni genetiche della cellula L RNA agisce da intermediario nel convertire le informazioni in catene aminoacidiche che concorrono alla formazione di proteine

Struttura Primaria degli acidi nucleici Un nucleotide è formato da : uno zucchero a 5 atomi di carbonio (ribosio nell RNA o deossiribosio nel DNA); una base azotata uno o più gruppi fosfato (PO 4 3- )

Struttura della basi azotate Le basi azotate appartengono a due classi distinte: le basi puriniche adenina e guanina le basi pirimidiniche timina citosina e uracile Guanina Adenina e Citosina sono presenti sia nel DNA sia nell RNA Timina solo nel DNA Uracile solo nell RNA

La base è unita allo zucchero tramite un legame glicosidico tra il C in posizione 1 nel pentoso e un azoto nella base in posizione 1 nelle basi pirimidiniche o in posizione 9 nelle basi puriniche. Il complesso privo di gruppo fosfato viene indicato come nucleoside.

Struttura di un polinucleotide È una struttura polimerica i polinucleotidi sono costituiti da nucleotidi legati covalentemente attraverso residui fosfato tra il C 3 di uno zucchero ed il C 5 dello zucchero adiacente.

DNA Nelle cellule il DNA è presente a doppio filamento (doppia elica) Un cromosoma contiene 2 filamenti di DNA costituito da milioni di nucleotidi uniti da legami fosfodiestere. I filamenti sono legati da legami idrogeno Le interazioni si formano tra: guanina-citosina (G-C) Adenina-timina (A-T)

RNA Tutti gli acidi ribonucleici sono molecole a singolo filamento. Hanno un triplice ruolo: RNA messaggero (mrna): contiene sequenze di ribonucleotidi che codificano per la sequenza amminoacida della proteine. Negli eucarioti, ogni mrna codifica per una singola catena polipeptidica, mentre nei procarioti può codificare per vari polipeptidi RNA ribosomali (rrna): forma parte della struttura dei ribosomi, in cui avviene la sintesi proteica. Ogni ribosoma contiene solo tre o quattro molecole diverse di rrna, complessate con un totale di 55 o 75 proteine RNA transfer (trna): trasporta gli aminoacidi ai ribosomi ed interagisce con l mrna, permettendo che gli aminoacidi siano uniti secondo la sequenza specificata dall mrna. Esiste almeno un tipo di trna per ogni aminoacido

L informazione genetica I geni sono composti da DNA e l informazione è contenuta nella sequenza di basi del DNA. La sequenza di basi del DNA specifica gli aminoacidi necessari per sintetizzare una proteina. I filamenti di DNA della doppia elica corrono in direzioni opposte, ma ciascuno in direzione 5 3 e sono tenuti insieme da legami idrogeno tra le basi L informazione genetica: 1. Replicazione: il DNA si duplica. 2. Trascrizione e Traduzione : l informazione contenuta nel DNA viene trasferita all RNA (mrna) e tradotta in una sequenza aminoacidica specifica per ciascuna proteina

Tre basi codificano per un singolo aminoacido (codone). Il codone viene tradotto in proteine da un complesso di sintesi costituito dai ribosomi (proteine + rrna), dai trna e da numerosi enzimi.

Replicazione del DNA Negli organismi procarioti ha inizio a livello di una regione del DNA detta origine di replicazione la separazione della doppia elica è catalizzata dalla DNA elicasi le SSBP (si legano ai singoli filamenti per impedirne la riassociazione) su ogni singolo filamento viene sintetizzata una breve catena complementare di RNA (iniziatore o primer) che utilizza il DNA come stampo ad opera di una RNA polimerasi (primasi) la DNA polimerasi III si serve del DNA originario come stampo per la sintesi di una catena di DNA utilizzando il primer a RNA come punto di partenza la DNA polimerasi III può aggiungere nuovi nucleotidi solo all estremità 3 per cui la sintesi della catena avviene solo in direzione 5 3 partendo dal primer a RNA

Meccanismo di replicazione E. coli

Meccanismo di replicazione La replicazione del DNA eucariotico prevede origini di replicazione multiple con la sintesi in direzione 5 3 delle nuove catene di DNA il risultato della replicazione in entrambi i casi è la sintesi dal DNA originale di due molecole contenenti ciascuna un filamento vecchio ed uno nuovo: replicazione semiconservativa.

La Replicazione del DNA Replicazione semiconservativa del DNA. I due filamenti di DNA parentale si separano e ciascuno serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento figlio mediante accoppiamento delle basi Filamento vecchio di DNA Filamento nuovo di DNA

Trascrizione

Cellula batterica Il plasmide è circa 1.000 volte più piccolo del cromosoma.

Plasmide Il plasmide è una piccola molecola circolare di DNA

Manipolazione degli acidi nucleici: strumenti e tecniche di base I principi della sintesi e della replicazione, così come gli enzimi coinvolti in questi processi sono alla base di molte tecniche di biologia molecolare

Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi principali dell estrazione di DNA da cellule o tessuti DNA Omegenizzazione di cellule/tessuti 4 C Lisi cellulare:detergenti/lisozima Agenti chelanti: EDTA/citrato Lisi parete Agenti proteinasici:proteinasi K Purificazione Estrazione con fenolo e fenolo/cloroformio Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 % Risospensione del DNA: Tampone TE (Tris -EDTA ph 8) Conservazione del DNA: 4 / -20 / -80 C

Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi principali dell estrazione estrazione di RNA da cellule o tessuti RNA Lisi parete Trattamento dei reagenti con inibitori delle RNAsi (DEPC DietilPiroCarbonato) Omegenizzazione di cellule/tessuti 4 C Lisi cellulare:detergenti/lisozima Agenti proteinasici:proteinasi K Solventi per RNA: Guanidina tiocianato Estrazione con fenolo e fenolo/cloroformio Purificazione Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 % Risospensione e conservazione dell RNA a -80 C

Sistemi di Isolamento e separazione degli acidi nucleici disponibili in Commercio I Kit per l estrazione degli acidi nucleici hanno il vantaggio di fornire reagenti standardizzati e di qualità garantita dando così un elevato grado di affidabilità. L Estrazione automatizzata mediante strumenti consentono di estrarre il DNA senza alcun intervento manuale (circa 45 )

Analisi degli acidi nucleici L analisi può essere effettuata attraverso l elettroforesi che è il metodo più comune impiegato per separare le molecole di DNA/RNA in base alla loro dimensione e può essere qualitativa e quantitativa. Elettroforesi su gel di agarosio Elettroforesi su gel di poliacrilammide Elettroforesi su gel a campo pulsato o PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis)

Elettroforesi su gel di agarosio Apparato elettroforetico

Elettroforesi su gel di agarosio catodo anodo - + RNA e DNA sono carichi negativamente

Elettroforesi su gel di agarosio Effetto setaccio del gel di agarosio

L agarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L- galattosio.

Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: 0.1-20 kb Concentrazione di agarosio 0.8% : 0.5 20 kb 2% : 0.1 3 kb Risoluzione

Come si prepara un gel d agarosio Si scioglie l agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100 C Alla soluzione d agarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr)

Etidio Bromuro (EtBr):( colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancio E utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: l intensitl intensità della fluorescenza è,, infatti, proporzionale alla quantità del campione.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO generatore di corrente 100V 0,2A tampone elettroforetico Polo - Polo + scatola elettroforetica gel di agarosio 1.2%

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e/o Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi)

Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es( es.: plasmidi batterici) pbr322 plasmide circolare rilassato nick migra più lentamente rispetto ad un DNA lineare o superavvolto della stessa massa plasmide superavvolto Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno in maniera differente pbr322 pbr322 dopo digestione plasmide linearizzato

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro corsa elettroforetica è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. L RNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere prima denaturato,, al fine di mantenere le molecole in forma lineare Agenti denaturanti comunemente usati: calore, formaldeide, formammide, urea

Separazione in gel d agarosio di molecole di RNA in condizioni denaturanti 28S (3400 nt) 18S (1800 nt) Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, l RNA deve essere denaturato,, ossia le molecole devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari. La denaturazione si ottiene scottando (90-95 C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide.

ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Separazione di di frammenti minori di di 1 kb kb Permette di di separare frammenti che che differiscono di di una una sola sola base base (determinazione della della sequenza del del DNA) La La PAGE in in presenza di di SDS SDS (buffer) è il il metodo di di più più largo impiego per per l analisi l qualitativa di di miscele di di proteine

Formazione di un gel di poliacrilammide

ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Spessore del gel 0,4-1,5 mm Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da denaturante. acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea Risoluzione: 20-1000 nucleotidi

Misurazione espressione a livello della proteina SDS-PAGE

Tipi ed esempi di enzimi impiegati per la manipolazione degli acidi nucleici Tipo di enzima Esempio Uso DNA polimerasi DNA poil I DNA polimerasi DNA dipendente con attività 5 3 e 3 5 esonucleasica * La transcrittasi inversa è una DNA polimerasi RNA dipendente che in presenza della miscela dei 4 dntp sinetetizza una prima catena di DNA complementare allo stampo di RNA. La mrna è instabile per cui è di difficile manipolazione, pertanto si rende necessario sintetizzare molecole di DNA complementare (cdna( cdna) ) che è stabile e di facile utilizzo (clonaggio,, librerie..).

Nucleasi Le nucleasi sono enzimi che tagliano i legami sui filamenti degli acidi nucleici: 1. Le esonucleasi aggrediscono una delle estremità libere del DNA e iniziano a tagliare proseguendo verso l estremità opposta. 2. Le endonucleasi invece tagliano i legami interni in una molecola di DNA lineare o circolare. DNA endonucleasi esonucleasi

Le Endonucleasi Gli enzimi di restrizione sono divisi in tre categorie: endonucleasi di tipo I,II e III le endonucleasi di tipo I tagliano il Dna in punti casuali Le endonucleasi di tipo II, gli enzimi di restrizione propriamente detti non necessitano di energia per la loro funzione ed il taglio avviene in corrispondenza di sequenze molto specifiche. le endonucleasi di tipo III riconoscono specifici siti bersaglio ed effettuano il taglio in corrispondenza o vicino a questi. Le endonucleasi di tipo I e III necessitano di energia per il taglio e possono anche catalizzare altre reazioni di modificazione del DNA

Endonucleasi di restrizione Le endonucleasi di restrizione di II tipo, si legano ad una sequenza specifica di DNA (sito di riconoscimento) e tagliano entrambi i filamenti di DNA. La sequenza riconosciuta NON E UNICA, ma varia da enzima ad enzima. Esistono però endonucleasi diverse che tagliano la stessa sequenza di DNA (isoschizomeri).

Digestione Tre plasmidi con diversa sequenza nucleotidica.

Digestione I siti di restrizione evidenziati in rosso

Digestione vengono riconosciuti dagli enzimi di restrizione

Digestione che tagliano il DNA

Digestione in frammenti di lunghezza diversa.

Enzima Sequenza Riconosciuta Prodotti HpaII 5 -CCGG-3 3 -GGCC-5 5 -C CGG-3 3 -GGC C-5 HaeIII 5 -GGCC-3 5 -GC CC-3 3 -CCGG-5 3 CC GG-5 BamHI 5 GGATCC-3 5 G GATCC-3 3 -CCTAGG5 3 -CCTAG G-5 HpaI 5 -GTTAAC-3 3 -CAATTG-5 5 -GTT 3 -CAA AAC-3 TTG-5 SEQUENZE RICONOSCIUTE DA ALCUNI ENZIMI DI RESTRIZIONE

Le sequenze di DNA riconosciute da questi enzimi sono lunghe circa 4-6 pb e successivamente sono tagliate in punti specifici. Le sequenze bersaglio sono palindrome e sono presenti in entrambe le direzioni su ogni filamento Il taglio può produrre frammenti con estremità piatte o sfalsate (coesive) Attualmente si conoscono circa 500 enzimi di restrizione che riconoscono oltre 100 sequenze diverse.

Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA prodotti da diversi enzimi di restrizione usati singolarmente e in combinazione con la possibilità di costruire una mappa dell acido nucleico analizzato. 2. Analisi di restrizione di frammenti di DNA + marcatura con sonde geniche specifiche: Southern blot Nothern blot Dot blot