RISOLUZIONE OIV-OENO 452-2012

RISOLUZIONE OIV-OENO 452-2012 MONOGRAFIA SUGLI ESTRATTI PROTEICI DEI LIEVITI (EPL) L ASSEMBLEA GENERALE, Visto l Articolo 2, Paragrafo 2 iv, dell Accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, CONSIDERATO il lavoro del gruppo di esperti Specifiche dei prodotti enologici, CONSIDERATE le risoluzioni OENO 416-2011 e OENO 417-2011 che autorizzano gli estratti proteici dei lieviti come nuovi trattamenti enologici per i mosti e i vini, DECIDE di completare il Codex enologico internazionale con la seguente monografia: 1

ESTRATTI PROTEICI DEI LIEVITI (EPL) 1. OGGETTO, ORIGINE E CAMPO DI APPLICAZIONE Le proteine degli estratti proteici dei lieviti derivano principalmente dal citoplasma del lievito Saccharomyces sp. Sono estratte con metodi fisici a seguito di un processo di estrazione che limita la loro idrolisi. Le proteine degli estratti proteici dei lieviti presentano masse molecolari e cariche elettriche variabili in funzione di come sono ottenute, sono in grado di flocculare nei mosti e nei vini per consentire la loro chiarificazione e la loro stabilizzazione colloidale (operazioni di chiarifica). Quando gli estratti proteici dei lieviti provengono da lieviti enologici geneticamente modificati, questi devono essere sottoposti a previa autorizzazione da parte delle autorità competenti. 2. ETICHETTATURA L etichetta deve indicare: - Il campo di applicazione (chiarifica dei mosti e dei vini); - Le condizioni di sicurezza e di conservazione ela data di scadenza; - Gli eventuali additivi; - N del lotto di fabbricazione; - Se gli estratti proteici dei lieviti provengono da lieviti ottenuti mediante modificazione genetica e il carattere modificato, ove sia questo il caso. 3. CARATTERIZZAZIONE 3.1 - Gli EPL si presentano sotto forma di polvere, generalmente micro-granulare, di colore dal giallo chiaro al beige o beige, con un leggero odore di lievito. 3.2 - Gli EPL sono solubili in acqua e non solubili in etanolo. In soluzione acquosa, precipitano quando viene raggiunto 1 volume di etanolo. 3.3 Dosaggio delle proteine 3.3.1 Proteine totali Il dosaggio delle proteine può essere effettuato con il metodo di Lowry descritto nell appendice 1. Il tenore di proteine totali degli EPL deve essere superiore al 50% del prodotto secco. 3.3.2 Dimensione delle proteine La valutazione delle dimensioni o dei pesi molecolari delle proteine viene effettuata con la tecnica di separazione per elettroforesi SDS-PAGE descritta nell appendice 3. Esempio di profili differenti di estratti proteici dei lieviti con colorazione al blu di Coomassie: 2

1: Marcatore di dimensioni 2: Ceppo 1 Fase Esponenziale 3: Ceppo 1 Fase Stazionaria 4: Ceppo 2 Fase Esponenziale 5: Ceppo 2 Fase Stazionaria 6: Ceppo 3 Fase Esponenziale (Ceppo carente di proteasi A) 7: Ceppo 3 Fase Stazionaria (Ceppo carente di proteasi A) 3.3.3 Livelli di proteine superiori a 15 kda Questo tasso è stimato utilizzando la tecnica di permeazione su gel descritta nell'appendice 4. Almeno il 50% delle proteine totali deve avere un peso molecolare superiore a 15 kda. 3.4 Azoto amminico Il tenore di azoto amminico espresso in glicina rappresenta dal 10 al 20% massimo del prodotto secco. - Il dosaggio dell azoto amminico potrà essere effettuato con il Metodo del Dinitrofluorobenzene (DNFB) descritto nell appendice 2. 4. PROVE 4.1 Perdita all essiccazione Mettere 5 g di EPL all interno di una capsula di silice avente diametro di 70 mm. Inserire in un forno a 100-105 C per 5 ore. La perdita di peso non deve essere superiore a 15 p.100. I limiti fissati di seguito sono rapportati al prodotto secco. 4.2 Ceneri Incenerire il residuo secco a 550-600 C. Il tenore delle ceneri non deve essere superiore all 8%. 4.3 Preparazione della soluzione per la prova Preparare una soluzione di EPL con 10 g/l in acqua. 4.4 Piombo Nella soluzione preparata per la prova (4.3) dosare il piombo secondo il metodo descritto nel 3

capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Il tenore di piombo deve essere inferiore a 2 mg/kg. 4.5 Mercurio Nella soluzione preparata per la prova (4.3) ma senza evaporare la soluzione, dosare il mercurio secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Il tenore di mercurio deve essere inferiore a 1 mg/kg. 4.6 Arsenico Nella soluzione preparata per la prova (4.3) dosare l arsenico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Il tenore di arsenico deve essere inferiore a 3 mg/kg. 4.7 Cadmio Nella soluzione preparata per la prova (4.3) dosare il cadmio secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Il tenore di cadmio deve essere inferiore a 1 mg/kg. 4.8. ANALISI MICROBIOLOGICA 4.8.1 Flora mesofila aerobia totale Procedere alla conta secondo il metodo indicato nel capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Sono necessari meno di 10 4 UFC/g batteri mesofili aerobi totali in 1 gr. 4.8.2 Coliformi Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Sono necessari meno di 10 UFC/g di materia secca 4.8.3 Staphylococcus Procedere alla conta secondo il metodo che sarà descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. L assenza di Staphylococcus aureus deve essere verificata in un campione da 1 g. 4.8.4 Salmonella Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. L assenza di salmonella deve essere verificata in un campione di 25 g. 4.8.5 Escherichia coli Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. L assenza di Escherichia coli deve essere verificata in un campione di 25 g. 4.8.6 Batteri lattici Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Sono necessari meno di 10 3 UFC/g di materia secca 4.8.7 Muffe Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Sono necessari meno di 50 UFC/g di materia secca 4

4.8.8 Lieviti Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codex Enologico Internazionale. Sono necessari meno di 10 2 UFC/g di materia secca 4.9 TEST DI EFFICACIA DEGLI EPL PER LA CHIARIFICA DEI MOSTI E DEI VINI 4.9.1 Principio: Si tratta di determinare la dose più compatibile per ottenere una chiarificazione rapida ed una stabilità colloidale del vino. 4.9.2 Prodotto: Mosti o vini da chiarificare. 4.9.3 Protocollo: 4.9.3.1 Soluzione di EPL al 2%. Sciogliere 2 g di EPL in 100 ml di acqua distillata. 4.9.4 Test di chiarifica Inserire 100 ml di mosto o di vino in tanti tubi da 100 ml quante sono le dosi previste. In pratica, il confronto su 4 dosi è sufficiente. 5 tubi da 100 ml compreso il campione di referenza. Aggiungere 0 (campione di referenza), 1,5 ml, 2ml, 2,5 ml della soluzione di EPL (4.9.3.1) per un vino rosso e 0,5ml, 1ml, 1,5 ml della soluzione di EPL per un mosto bianco o rosé o un vino bianco o rosé. Queste quantità corrispondono alle dosi finali di 0, 200 mg/l, 300 mg/l, 400 mg/l, 500 mg/l per un vino rosso e di 0, 100 mg/l, 200 mg/l, 300 mg/l per un mosto bianco o rosato o un vino bianco o rosato - Omogeneizzare ciascun tubo subito dopo l'introduzione della soluzione di EPL (mescolare manualmente per 2-3 volte i tubi protetti da parafilm). Osservare la velocità di aumento di torbidità, di comparsa dei fiocchi ogni 10 min per 30 min e successivamente dopo 8 ore confrontare ciascuna prova e controllare: - la torbidità, - il volume di fecce, - le intensità coloranti, - la qualità organolettica, - la stabilità colloidale per un passaggio a 80 C durante 20 m in un bagno d acqua o un forno a 100 C ed un raffreddamento rapido sotto una corrente d acqua fredda. 5. CONSERVAZIONE Gli Estratti proteici di lieviti hanno una durata di conservazione di 3 anni in imballaggio non aperto, stoccati in locali temperati, al riparto dall umidità 6. BIBLIOGRAFIA Feuillat M. (1986). Autolysats de levures à usage oenologique et leur procédé de fabrication. France. Feuillat M. (1987). "Préparation d'autolysats de levures et addition dans les vins effervescents élaborés selon la méthode champenoise." Rev. Fr. Oeno 109: 17-27. Charpentier C. and Feuillat M. (1992). Yeast autolysis. Wine microbiology and biotechnology.f. G.H. Chur, Harwood Academic Publisher. Charpentier C. and Freyssinet M. (1989). "The mechanism of yeast autolysis in wine." Yeast: S1 S48. Charpentier C. (2000). "Yeast autolysis and yeast macromolecules? Their contribution to wine flavor and stability." Am. J. Enol.Vitic. 51: 271-277. 5

Charpentier C., Caillet M.M, Feuillat M. (2006) Essais de collage de moûts blancs et de vins rouges avec un extrait protéique levurien :comparaison avec les colles traditionnelles. Rev. Œnologues 120,,juillet 2006. 6

Allegato 1 1. Metodo Lowry 2. Introduzione Il metodo proposto è il metodo LOWRY (LOWRY e al. 1951). Esso può essere, tuttavia, sostituito da altri metodi, quali, per esempio, quello di BRADFORD (1976): Bradford, M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantization of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72:248-254. 3. Campo di applicazione Il metodo LOWRY deriva dal metodo del biureto: in ambiente alcalino, gli ioni di rame formano con le proteine un complesso rameico viola-rosa caratteristico dei legami peptidici. Tale procedura è 100 volte più sensibile rispetto all'analisi del biureto. 4. Definizione Il metodo LOWRY consiste nel complessare, tramite il rame, in ambiente alcalino, circa un quarto degli acidi amminici che costituiscono le proteine. Il reagente di Folin Ciocalteu (reattivo fosfomolibdico) reagisce con gli acidi amminici aromatici delle proteine. L assorbanza del complesso formato è determinata tramite spettrometria a 750 nm. L'inconveniente principale di tale metodo riguarda l interferenza del reagente di Folin con altri composti (EDTA, ditioeritriolo, glutatione ossidato, ecc.). Il dosaggio delle proteine idrosolubili è effettuato tramite confronto con una curva campione definita a partire da soluzioni proteiche dalla concentrazione nota (tipo BSA). 5. Reattivi e prodotti - Soluzione A: soluzione di Na 2 CO 3 a 2% in NaOH 0,1 M contenente tartrato di sodio (o di potassio) 0,02% (500 ml). - Soluzione B: soluzione di CuSO 4.5 H 2 O al 5% (100 ml). - Reagente C: da realizzare estemporaneamente. 50 ml di soluzione A + 1 ml di soluzione B. - Reagente di FOLIN-CIOCALTEU: soluzione commerciale. - Soluzione di sieroalbumina bovina standard (BSA). 6. Strumentazioni - Provette per test - Pipette di classe A - Micropipette - Parafilm - Spettrometro per spettrometria nel visibile 7. Procedimento 7.1 Gamma campione proteica: preparazione e dosaggio. La gamma campione è preparata a partire da una soluzione standard di BSA 0,5 mg*ml -1. - In alcuni matracci tarati da 100 ml, preparare una serie di soluzioni di BSA contenente 0, 100, 200, 300 e 400 µg*ml -1 di BSA a partire dalla soluzione madre. 7

- Suddividere in alcune provette 0,6 ml di ogni diluizione. Una provetta di controllo dovrà contenere esclusivamente 0,6 ml di acqua distillata. Omogeneizzare bene ogni soluzione tramite rovesciamento. - Aggiungere in ogni provetta: - 3 ml di reagente C. - Chiudere la provetta con il parafilm e omogeneizzare tramite rovesciamento. - Lasciar riposare per 10 minuti prima di aggiungere 0,3 ml di reagente di FOLIN. - Omogeneizzare. - Attendere 30 minuti al buio e misurare il grado di assorbanza a 750 mn, regolando lo zero con la soluzione di acqua distillata (concentrazione di BSA pari a 0 µg*ml -1 ). - Tracciare la curva D.O. = f (concentrazione proteica). 7.2 Dosaggio delle proteine dell'estratto Proteico di Lievito - In 3 provette, aggiungere nell ordine: - 0,6 ml di estratto diluito all 1/20 e, 1/30 e e 1/40 e (ossia 30, 30 e 15 µl in 0,6 ml). - 3 ml di reagente C. Omogeneizzare dopo aver chiuso le provette con il parafilm e lasciar riposare per 10 minuti. - 0,3 ml di reagente di FOLIN. Omogeneizzare. - Attendere 30 minuti al buio. - Misurare il grado di assorbanza a 750 nm. 8. Calcoli - Nota: se i valori di assorbanza sono scarsi, ripetere il processo realizzando diluizioni meno importanti dell estratto proteico di lievito (1/10 e, 1/5 e e 1/4 e, ossia 60, 120 e 150 µl in 0,6 ml). - Facendo riferimento alla curva campione, determinare la concentrazione proteica dell EPL in µg * ml -1 e mg*ml -1 tramite lettura diretta o utilizzando la retta di regressione (indicare sulla curva campione l equazione della retta e il coefficiente di correlazione). 8

Allegato 2 1. Metodo al dinitrofluorobenzene 2. Introduzione Questo metodo consente di dosare rapidamente l azoto amminico in una soluzione biologica in relazione a una gamma campione realizzata con un soluzione di glicina. 3. Campo di applicazione Prodotti enologici di origine vegetale o animale. 4. Definizione Il dinitrofluorobenzene o DNFB reagisce con le funzioni NH 2 libere contenute negli acidi amminici formando un composto di colore giallo vivo dosato tramite colorimetria a 420 nm. La reazione si esegue a un ph > 9,3. 5. Reattivi e prodotti Reattivi: - Borace o tetraborato di sodio. - Dinitrofluorobenzene, acido cloridrico 10 M. - Glicina. 6. Strumentazioni - Provette da emolisi - Micropipette - Spettrometro per spettrometria nel visibile - Bagno d acqua a 60 C 7. Campionamento - Preparare una soluzione di tetraborato di sodio al 5% in acqua pura. - Preparare una soluzione di DNFB: introdurre 130 µl di DNFB in 10 ml di etanolo puro al 95%. - Preparare una soluzione di acido cloridrico 2 M. - Realizzare una gamma campione a partire da una soluzione madre di glicina a 2 g/l (M=75,07 g). Per es.: 0, 50 mg/l, 100 mg/l, 200 mg/l, 500 mg/l. - Preparare una soluzione del prodotto da dosare a 2 g/l. 8. Procedimento - In una provetta da emolisi, introdurre: - 380 µl di borace al 5% - 20 µl del campione da dosare - 20 µl di soluzione DNFB - Procedere nello stesso modo per la gamma di glicina - Agitare e porre in un bagno d acqua a 60 C per 30 minuti - Aggiungere 3 ml di HCL 2 M - Agitare e leggere l assorbanza specifica a 420 nm per il campione - Realizzare una retta standard con la gamma di glicina 9. Risultati Riportare il valore di assorbanza a 420 nm del campione sulla retta standard. I risultati sono espressi in g/l di glicina. 9

Allegato 3 Separazione delle proteine tramite elettroforesi SDS-PAGE 1. Introduzione L elettroforesi SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide) rappresenta una variante dell elettroforesi correntemente utilizzata per separare le proteine in funzione del loro peso molecolare. 2. Campo di applicazione Individuazione del peso molecolare delle proteine di origine vegetale o animale. Questo metodo può essere applicato a tutti i prodotti di origine biologica, nonché ai prodotti enologici a contenuto proteico. 3. Principio La determinazione del peso molecolare delle proteine è realizzata tramite elettroforesi SDS-PAGE secondo il metodo di Laemmli (1970). Questa tecnica consente di separare le proteine in funzione del loro peso molecolare grazie all SDS (sodio-dodecil-solfato), una molecola a forte carica negativa che uniforma le cariche proteiche, promuovendone la perdita della struttura tridimensionale originaria. La velocità di migrazione dell insieme della molecola denaturata/sds dipende esclusivamente dal peso molecolare delle proteine. Prima di procedere alla denaturazione delle proteine tramite SDS, i ponti disolfuro devono essere ridotti utilizzando del 2-mercaptoetanolo. L ambiente di migrazione è costituito da un gel di poliacrilammide. Il suddetto gel è composto da due parti. Un gel di concentrazione che, come indica il suo nome, consente alle proteine di concentrarsi prima della migrazione nel gel di separazione situato al di sotto. Il gel di concentrazione contiene il 5% di acrilammidebisacrilammide, mentre il gel di separazione ne contiene il 12%. La migrazione è effettuata in un tampone di elettroforesi refrigerato a 12 C e agitato per circa 1 ora e 30 minuti a 80 V per il gel di concentrazione e per circa 3 ore a 170 V per il gel di separazione. Una volta destrutturato, il gel si colora rilevando le bande proteiche. Il peso molecolare delle proteine può essere misurato tramite marcatori di dimensione nota che migrano con i campioni. Per esempio, tramite un marcatore commercializzato da Sigma con il nome di Molecular Weight Standard Mixture avente le seguenti dimensioni: 15, 25, 35, 50, 75, 100 e 150 Kda. 4. Reattivi e prodotti 4.1 Tampone di denaturazione - tampone Tris-HCl 0,125 M ph 6,8 - acqua distillata - SDS al 4% - 2-mercaptoetanolo al 10% - blu di bromofenolo allo 0,2% - glicerolo puro - Fino a volume con acqua distillate 4.2 Gel di separazione, preparazione per 30 ml - 7,50 ml di acrilammide-bisacrilammide - 11,25 ml di tampone Tris-HCl a 0,75 M ph 8,8-0,30 ml di SDS al 10% - 10,95 ml di acqua distillata 10

- 30 microlitri di TEMED per la polimerizzazione - dopo l agitazione, aggiungere 300 microlitri di persolfato di ammonio al 20% 4.3 Gel di concentrazione, preparazione per 10 ml - 1,25 ml di acrilammide/bis-acrilammide - 1,25 ml di tampone Tris-HCl a 0,25 M ph 6,8-0,10 ml di SDS al 10% - 7,4 ml di acqua distillata - 40 microlitri di TEMED per la polimerizzazione - dopo l agitazione, aggiungere 100 microlitri di persolfato di ammonio al 20% 4.4 Tampone di migrazione, preparazione per 1 litro - 12,5 ml di tampone Tris 25 mm ph 8,3-14,4 g di glicina - 977,5 ml di acqua distillata - 10 ml di SDS al 10% 5. Strumentazione Apparecchiature di elettroforesi - placche - pinze - guarnizioni a tenuta stagna - pettine - spaziatori 6. Campionamento 6.1 Denaturazione delle proteine dei prodotti. - I campioni sono trattati in un tampone di denaturazione preparato immediatamente prima del processo di denaturazione. - 50 microlitri di campione sono miscelati con 50 microlitri di tampone denaturante. - La soluzione è poi riscaldata fino a ebollizione per 4 minuti al fine di favorire la denaturazione delle proteine. 7. Procedimento 7.1 Preparazione delle placche. - Le placche di elettroforesi sono pulite prima dell utilizzo con acqua (eventualmente saponata) e alcool al 70%. - Asciugare le placche con della carta, senza lasciare residui o fibre sulle superfici su cui sarà colato il gel. - Giunto a tenuta stagna sulla placca dai bordi rotondi. - Posizionare gli spaziatori e la seconda placca di vetro. - L insieme è poi consolidato utilizzando le apposite pinze. 7.2 Colatura del gel di separazione. - Il gel di separazione è colato tra le due placche tramite una pipetta. - Al fine di evitare la comparsa di bolle all'interno del gel, la superficie è inclinata durante l operazione di riempimento. - Il gel è poi ricoperto di acqua distillata fino a ottenere un piano perfettamente orizzontale. 7.3 Colatura del gel di concentrazione. - Rimuovere l acqua distillata dal gel di separazione. 11

- Riempire il piano con il gel di concentrazione fino a raggiungere il livello superiore delle placche di vetro. Mantenere inclinata la superficie. - Posizionare il pettine in modo tale da formare dei pozzi nel gel di concentrazione. 7.4 Deposito dei campioni. - Rimuovere il pettine. - Posizionare le placche e le vaschette di migrazione nella vaschetta dell elettroforesi. - Riempire le vaschette con il tampone di migrazione, iniziando dalla parte superiore e terminando con la parte inferiore. - Deporre 50 microlitri di campione proteico denaturato in ogni pozzo tramite una siringa e facendo riferimento alla tecnica sottomarina. - Deporre anche un marcatore di dimensione nota, posizionandolo verso i bordi dei pozzetti in modo tale da poter rilevare i pozzetti contenenti i campioni. - Una volta terminata l operazione, la migrazione è avviata piuttosto rapidamente al fine di evitare la diffusione dei depositi. 7.5 Avvio e arresto dell elettroforesi. - La durata dell elettroforesi dipende da numerosi fattori: il generatore utilizzato, lo spessore del gel, la quantità di tampone impiegata, nonché la sua diluizione - Chiudere il coperchio della vaschetta. - Verificare che il generatore sia spento o privo di corrente. - Collegare i fili del coperchio al generatore. - Mantenere la temperatura a 12 C. - Collegare il generatore al settore. - Avviare il generatore al voltaggio desiderato: 80 volt per 1 ora e 30 minuti per il gel di concentrazione e 170 volt per 3 ore per la migrazione nel gel di separazione. - Arrestare dell elettroforesi quando il blu di bromofenolo raggiunge il margine inferiore delle placche. - Spegnere il generatore e scollegarlo dalla corrente. - Scollegare i fili del coperchio. - Aprire la vaschetta dell elettroforesi. - Rimuovere il gel sul suo supporto 8. Risultati Le bande perpendicolari al percorso di migrazione corrispondono alle molecole proteiche che possono essere rilevate tramite colorazione. L intensità e lo spessore delle bande dipendono dalla concentrazione proteica. Il marcatore consente di determinare direttamente il peso molecolare delle proteine per ogni banda. 8.1 Colorazione dei gel di elettroforesi Numerose colorazioni possono essere applicate per determinare il più precisamente possibile le proteine presenti nel campione. Colorazione al blu di Coomassie Dopo la migrazione, i gel di elettroforesi sono immersi in una soluzione di colorazione al blu di Coomassie (0,025% di blu di Coomassie R250, 40% di metanolo, 7% di acido acetico) per una notte. 12

Il giorno successivo, gli stessi gel sono sommersi per 30 minuti in un primo bagno decolorante (40% di metanolo, 7% di acido acetico) per rimuovere l eccesso di colorante. Sono poi introdotti in un secondo bagno (5% di metanolo, 7% di acido acetico) regolarmente sostituito fino a ottenere un fondo quasi incolore. Le fasi di colorazione e decolorazione sono realizzate per agitazione a temperatura ambiente. I gel sono conservati in acqua distillata prima di essere analizzati. Colorazione al nitrato d argento La colorazione al nitrato d argento consente di rilevare quantità proteiche più deboli rispetto al metodo con blu di Coomassie. I prodotti utilizzati sono forniti da Biorad e fanno parte del kit Silver Stain Plus. Terminata l elettroforesi, il gel è immerso in un bagno composto da 400 ml di soluzione fissante (50% di metanolo, 10% di acido acetico, 10% di fissativo Enhancer Concentrate in kit, 30% di acqua distillata) per 20 minuti, sotto agitazione e a temperatura ambiente. Il gel è poi risciacquato due volte con 400 ml di acqua distillata per 10 minuti al fine di eliminare l'acido acetico della fase di colorazione. La colorazione è realizzata con 100 ml di una soluzione preparata come segue. In un grande becher, introdurre: - 35 ml di acqua distillata - 5 ml di soluzione Silver Complexe - 5 ml di soluzione Reduction Moderator - 5 ml di reattivo Image Development Una volta che questi prodotti sono stati ben miscelati e prima dell'utilizzo, 50 ml di Development Accelerator sono aggiunti alla suddetta soluzione a temperatura ambiente. La preparazione è poi versata sul gel nella vaschetta di colorazione. Dopo un intervallo compreso tra 20 e 60 minuti, in funzione del campione e della sua concentrazione, appaiono alcune bande brunastre. La reazione è quindi bloccata con una soluzione di acido acetico al 5% per almeno 15 minuti. Il gel è immerso per circa 5 minuti in acqua ultrapura. I gel sono pronti per l analisi che determinerà il peso molecolare delle bande proteiche. Colorazione delle glicoproteine Questo metodo consente di determinare la presenza di glicoproteine nei prodotti da lievito. Utilizza il kit GelCode Glycoprotein Staining commercializzato dalla società Pierce Biotechnology. Terminata l elettroforesi, il gel è fissato per immersione completa in un bagno composto da 300 ml di metanolo al 50% per 30 minuti sotto agitazione. Lavare il gel in un bagno contenente 300 ml di acido acetico al 3% per 10 minuti. Ripetere l operazione ancora una volta. La colorazione può essere bloccata con acqua distillata nel corso della notte. Il gel è poi ricoperto da 25 ml di Oxydizing Solution sotto agitazione per 15 minuti. Il gel è quindi lavato tre volte con 300 ml di acido acetico al 3% per 5 minuti. Una soluzione contenente 25 ml di GelCode Glycoprotein Staining è collocata sul gel per 15 minuti sotto agitazione. Deporre 25 ml di Reducing Solution sotto agitazione dolce per 5 minuti. 13

Lavare abbondantemente il gel con una soluzione di acido acetico al 3%. Le glicoproteine appaiono sotto forma di bande color magenta. Il gel può essere conservato in una soluzione di acido acetico al 3% prima di essere analizzato. 14

Allegato 4 Cromatografia a permeazione di gel 1. Introduzione Il metodo proposto è una tecnica di separazione di molecole. Questo tipo di cromatografia è anche conosciuto come setacciatura molecolare o cromatografia di esclusione. 2. Campo di applicazione Il profilo di polimeri è studiato nei prodotti biologici mediante cromatografia a permeazione di gel su una colonna ottimizzata per l'analisi delle proteine. Una doppia rivelazione 280/214 nm consente di monitorare l'eluizione di molecole contenenti aminoacidi con anelli aromatici e legami peptidici. 3. Definizione La cromatografia a permeazione di gel permette la separazione di molecole in base alla loro forma e dimensione mediante l uso di una colonna contenente granuli di gel poroso. Le molecole di grandi dimensioni (con un diametro maggiore di quello dei pori) sono escluse ed eluite prima al volume morto (Vm o V0). Le molecole di piccole e medie dimensioni sono eluite successivamente e la loro migrazione è ostacolata dalla loro inclusione nel gel. I soluti sono quindi eluiti in ordine inverso rispetto al peso molecolare. Esiste una relazione lineare tra il volume di eluizione e il logaritmo del peso molecolare. 4. Reattivi e prodotti - NaH2PO4,2 H2O - Na2HPO4,2H2O - NaCl - NaOH 10 M 15

Composto Peso molecolare in kda Albumina bovina 66 Ovoalbumina 45 Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi 36 Anidrasi carbonica bovina 29 Tripsinogeno da pancreas bovino Inibitore della tripsina presente nella soia 24 20 Lattoalbumina 14,2 5. Strumentazione - Colonna cromatografica del tipo Colonne Ge Health Care: Superdex 200 (diametro 10 mm * 300 mm di lunghezza) - Filtro costituito da esteri di cellulosa con porosità: 0,22 µm - Navicella per pesata - Becher da 2 L - Matraccio graduato da 1 L - Membrane da 0,45 µm per soluzioni acquose 6. Procedimento 6.1. Tampone e condizioni cromatografiche In una navicella per pesata, pesare: NaH 2 PO 4 *2 H 2 O = 1,56 g Na 2 HPO 4 *2 H 2 O = 1,58 g NaCl = 14,63 g - Trasferire il tutto in un becher contenente 0,9 litri di acqua ultrapura. Il ph di questa soluzione dovrebbe essere di circa 6,5. Riportarlo ad un ph di 7,2 con NaOH 10 M. - Trasferire il tutto in un matraccio graduato da 1 litro e riempire con acqua ultrapura fino alla linea di livello del matraccio. Filtrare su membrana da 0,45 µm per soluzioni acquose. 16

tempo di ritenzione in minuti temps de rétention en minutes La portata è fissata a 0,6 ml/min. 6.2. Preparazione dei campioni Per analizzare, ad esempio, un prodotto in polvere, diluire 1 g in 100 ml di acqua ultrapura. Filtrare il campione attraverso un filtro costituito da esteri di cellulosa da 0,22 µm 6.3. Taratura della colonna Per tarare la colonna, tracciare una curva del logaritmo del peso molecolare dei campioni di peso molecolare in funzione del tempo di ritenzione. Iniettare la soluzione campione così com è. 7. Risultati Iniettare la miscela di campioni di peso molecolare come indicato al punto 7.3. Tracciare un grafico del logaritmo del peso molecolare dei campioni di peso molecolare in base al tempo di ritenzione. Determinare il peso molecolare dei picchi del prodotto facendo riferimento a questa curva. esempio di exemple curva de di droite taratura d'étalonnage con una avec colonna une superdex Superdex-200 41 39 37 35 33 31 29 y = -14,598x + 55,314 R 2 = 0,9828 27 25 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 logaritmo del poids peso moléculaire molecolare 17