Strategie immunoterapeutiche basate su anticorpi intracellulari contro tumori causati da HPV Luisa Accardi Dipartimento di malattie infettive, parassitarie ed immunomediate Reparto di Patogenesi Molecolare
Il vaccino profilattico anti-hpv rappresenta uno dei traguardi più avanzati della immunologia e della medicina Tuttavia: La vaccinazione non è efficace contro tumori che stanno insorgendo o sono già impiantati perché non è in grado di eliminare lesioni associate ad HPV in cui non sono espressi livelli rilevanti di L1 Chirurgia, radioterapia, chemioterapia sono invasive o danno effetti collaterali L outcome dei pazienti HNSCC e CC è rimasto invariato nell ultimo decennio Nei paesi in via di sviluppo (80% dei casi di tumore associato ad HPV), il costo elevato e la conservazione rappresentano un problema Saranno necessari almeno 20 anni per un impatto significativo sui tassi di tumore della cervice Quindi: Molto può essere ancora fatto in termini di trattamenti terapeutici efficaci per il cancro della cervice uterina e i tumori testa-collo HPV-associati
Carcinogenesi del cancro della cervice e strategie immunoterapeutiche prevenzione primaria del Esposizione tumore attraverso a HPV la vaccinazione HPV vaccini Infezione terapeutici persistente : evocare nell ospite una risposta immunitaria terapeutica contro le cellule infettate da HPV, che prevenga Lesioni pre-cancerose l infezione persistente ed elimini tumori primari, secondari e cellule residue Invasività
Strategie per il miglioramento dei vaccini Per i vaccini profilattici: Quelli del futuro dovrebbero cross-proteggere contro 15 tipi di HPV tumorale ed essere meno costosi: sono in studio quelli basati su L2 (Tumban et al 2011, Jagu et al 2011, Yoon et al 2012) Migliorare conservazione, trasporto e somministrazione del vaccino Per i vaccini terapeutici: ricerca di nuovi sistemi di delivery come fago lambda, adenovirus o vaccinia virus (Ghaemi et al 2010; Ying at al 2011; Zhao 2011), pseudovirioni (Peng et al 2010) o carriers come le particelle magnetiche batteriche (Tang et al 2011) vaccini a DNA: strategie per migliorare l espressione, il processamento e la presentazione dell antigene e prolungare la vita delle DCs (Tsen et al 2007; Kim et al 2005); migliorare l efficacia terapeutica tramite molecole immunostimolatrici derivanti da piante (Massa et al 2011) nuovi formati vaccinali: oligomeri sferici di E7 (Cerutti et al, 2011) modulazione delle T regs (Cao et al 2010; Ying et al 2011); modulazione del microambiente tumorale tramite molecole costimolatrici (Kanodia et al 2010) ottimizzazione delle vie di immunizzazione (Decrausaz et al 2011) terapia combinata: vaccinazione con long peptides di E7 + agente antivascolarizzazione (Zeng et al 2011); E7-DCs + radioterapia (Jeon et al 2011) Strategie terapeutiche alternative alla vaccinazione, applicabili anche in combinazione con le terapie tradizionali
E6 ed E7: antigeni tumorali bersaglio nell immunoterapia del cancro cervicale E6 Inibizione dell apoptosi degradazione proteica Immortalizzazione trasformazione tumorale evasione della risposta immunitaria E7 Azione pro-apoptotica in assenza di E6 sintesi del DNA differenziamento cellulare proliferazione cellulare trasformazione tumorale
Bloccare le proteine E6 ed E7: con quali strategie e perché? si RNAs o RNA antisenso, anche in combinazione con agenti chemioterapici (Zhou et al 2012; Tan et al, 2012; Gu et al, 2011; Chen et al, 2011 e 2009; Liu et al 2009; Hong et al, 2009; Sima et al 2008; Jonson et al, 2008) peptidi antagonisti (Guo et al, 2011) sostanze di origine vegetale: Jasmonato di metile (Milrot et al, 2012); Witaferina (Munagala et al, 2011); curcumina (Maher et al, 2011) anticorpi intracellulari (E7: Wang-Johanning et al, 1998; Accardi et al, 2011; E6: Griffin et al, 2006; Accardi et al, manoscritto in preparazione) Le infezioni da papillomavirus hanno caratteristiche che le rendono adatte ad una terapia basata su anticorpi intracellulari: 1) provocano lesioni epiteliali di superficie ben definite 2) le funzioni proteiche virali sono per lo più mediate da interazioni proteinaproteina
Anticorpi in formato a singola catena =scfv Piccoli frammenti anticorpali in grado di legare l antigene Caratteristiche: dimensioni ridotte (27-30 kda) (tumor penetration) facile manipolazione da cui possibile coniugazione a tossine, enzimi, farmaci citotossici e radioisotopi a scopo diagnostico o terapeutico (tumor targeting) Utilizzi possibili: somministrazione diretta come molecole proteiche purificate in gene therapy come anticorpi intracellulari (intrabodies)
Formati di anticorpi ricombinanti basati su scfv
ScFv in applicazioni antitumorali
ScFvs in applicazioni precliniche e cliniche
Intrabodies e HPV Da: Accardi L. (New research in cervical cancer, 2006) L azione degli intrabodies si basa su due meccanismi principali: Knock out fenotipico dell antigene bersaglio Delocalizzazione dell antigene bersaglio rispetto al naturale compartimento cellulare E6 ed E7 bersagli ideali contro cui indirizzare i scfvs
Anticorpi scfv contro HPV16-E7 selezionati tramite Phage Display (library ETH-2) V H V L CDR1 CDR1 ScFv32 YCAK*****FDYW CDR2 CDR2 ScFv32 CNSS******VVFG ScFv43 YCAK****FDYW CDR3 CDR3 ScFv43 ITVS******ATSA ScFv51 YCAK****FDYW scfv ScFv51 CNSS******VVFG ScFv 43M2 ottenuto per mutagenesi sito-specifica
Caratterizzazione in vitro degli scfvs anti-16e7 2,5 2 OD 450nm OD450nm 43 43M1 43M2 1,5 1 0,5 scfv 32 scfv 43 scfv 51 0 0,05 0,15 1,5 3 Ab concentration (mg/ml) E7 E7 P M 32 43 51 ctr- Stabilità termica 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 15' 30' 1h 2h 4h 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h Incubation at 37 C +HSA 43 43M1 43M2 scfv t 1/2 32 15' 43 30' 51 >72 hr 43M1 15' 43M2 24 hr
Espressione ed effetto antiproliferativo di scfvs anti-16e7 in cellule HPV16-positive 51N in SiHa 43M2SD in SiHa scfv plncx 51nuc 51SD
Response (RU) Immunoassays Epitope mapping e prb binding Biacore 23300 23000 22400 22100 21800 21500 21200 scfv 32 scfv 51 scfv 43M2 20900 20600 20300 5300 5500 5700 5900 6100 6300 6500 Time(s) PepSet technology Biacore
ScFv anti-hpv16 E6 selezionato tramite IAC technology Purificazione di scfv I7 da E. coli Termostabilità di scfv I7 a 37 C in presenza di HSA scfv I7nuc ScFvE-I7Nuc EF-BOS anti-e6 scfv Myc-tag cellule SiHa cellule TC-1 Nuclear localization signal
vitalità cellulare Espressione in cellule TC-1 ed effetto sulla vitalità cellulare Studio in vitro della vitalità di TC-1 trasfettate con plasmidi esprimenti scfvs (saggio MTT) Espressione di scfvs in TC-1 mediante sistema retrovirale Studio dell effetto di scfvs anti-16e6 e anti-16e7 nel modello tumorale murino per HPV16: Cellule TC-1 (cellule di epitelio polmonare murino immortalizzate con E6/E7 di HPV16 e trasformate con l oncogene ha-c-ras) inoculate sottocute in topi C57/BL6 MTT scfv I7NUC 43M2SD in TC-1 in TC-1 120 100 80 scfvs anti-e7 scfv anti-e6 60 40 20 C33A TC-1 0 Cellule 43M2SD 51NUC I7NUC
Studio in corso: modello murino cellule TC-1 cellule TC-1 esprimenti scfv anti-16e6 o 16E7 Sviluppo di tumore 0 Inoculo 48h post-trasduzione Settimane post-inoculo
% di topi tumor-free Effetto anti-tumorale di scfv anti-hpv16 E6 ed E7 protezione anti-tumorale da parte di scfv 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Settimane post-inoculo delle cellule tumorali cellule TC-1 plncx scfv anti-hpv16 E6 scfv anti-hpv16 E7
Colocalizzazione degli scfvs intracellulari con E7 E7 merge DIC 43M2SD E7 merge DIC 51nuc E7 merge DIC
Colocalizzazione di scfv 43M2 con la proteina E7 Microscopia confocale di Zulema Percario
Ipotesi di funzionamento degli anticorpi scfv e obiettivi futuri Legame intracellulare agli antigeni target E6 ed E7 con conseguente blocco dei rispettivi pathways cellulari ScFv anti-e6 (nucleare): impedirebbe la degradazione del tumor suppressor p53; consentirebbe l azione pro-apoptotica della proteina E7 sulle cellule tumorali ScFv anti-e7 (RE): eserciterebbe una azione di delocalizzazione della E7 con conseguente effetto antiproliferativo sulle cellule tumorali Obiettivi a breve scadenza: 1) Studio dettagliato in vitro del meccanismo di azione degli scfv 2) Verifica dell efficacia degli anticorpi scfv come agenti terapeutici su tumori già impiantati Obiettivi a media/lunga scadenza: 1) selezionare ulteriori anticorpi scfv con alta stabilità intracellulare e ottimizzarne l efficienza di espressione 2) sviluppare un efficiente sistema di delivery degli scfvs in forma funzionale
Vantaggi e svantaggi di vaccini terapeutici Tipo di vaccino Vantaggi Svantaggi Vettori vivi (virus o batteri) Peptidi Alta immunogenicità, facilitano la diffusione dell antigene tra le cellule Stabili, facili da produrre, possono combinare epitopi multipli Safety limitata, immunità preesistente non consente somministrazioni ripetute Bassa immunogenicità, epitopi definiti Proteine Stabili, facili da produrre Bassa immunogenicità, richiedono adiuvanti DNA Repliconi di RNA Cellule dendritiche Cellule tumorali Stabili, facili da produrre, possono essere ingegnerizzati Non infettivi, nessun rischio di integrazione cromosomale Alta immunogenicità, efficiente presentazione dell antigene Utili se non è noto l antigene tumorale Bassa immunogenicità, non si diffondono in vivo Poco stabili, difficoltà di preparazione e di conservazione Produzione su larga scala laboriosa e costosa Safety scarsa, produzione costosa e laboriosa
Considerazioni conclusive Il funzionamento degli anticorpi scfv non sembra essere basato sull attivazione del sistema immunitario 1) negli stadi avanzati di tumore della cervice, il trattamento con immunoterapici la cui azione è basata sulla stimolazione del sistema immunitario può essere poco efficace a causa delle potenziali condizioni di immunodepressione del paziente 2) non si richiede l uso di adiuvanti Gli anticorpi scfv: 1) possono essere ottenuti in forma stabile, sono facili da produrre e purificare in quantità elevate 2) non presentano problemi di safety 3) potrebbero essere somministrati direttamente in forma purificata 4) hanno efficacia terapeutica selettiva quindi non hanno effetto sulle cellule non cancerose 5) possono essere ingegnerizzati
ISS-MIPI Paola di Bonito Valentina di Carlo Angela Mandarino ISS-EOMM Alessandra Carè Federica Felicetti IFO-Regina Elena Aldo Venuti Francesca Paolini Università Tor Vergata Carla Amici Università Roma TRE Zulema Percario Elisabetta Affabris ISS-BCN/CNMR Paola Torreri Tamara Petrucci ISS-MIPI Colomba Giorgi M. Gabriella Donà Barbara Chirullo Linda Chiappalupi IARC-Lione Massimo Tommasino Rosita Accardi IFO-Regina Elena Marco G. Paggi Anna M. Mileo Layline Genomics-Trieste Michela Visintin Antonino Cattaneo ICGEB-Trieste Lawrence Banks David Pim Finanziato da Progetto AIDS 2010