LEZIONE II DUPLICAZIONE DEL DNA Dott. Paolo Cascio
L INFORMAZIONE GENETICA CONTENUTA NEL DNA DEVE ESSERE TRASMESSA ESCLUSIVAMENTE DALLA SEQUENZA DELLE QUATTRO BASI (A, T, G, C). LE MUTAZIONI GENETICHE DEVONO RAPPRESENTARE DELLE ALTERAZIONI NELLA SEQUENZA DELLE BASI. LE PROTEINE MUTANTI PRESENTANO DELLE ALTERAZIONI NELLA SEQUENZA DEGLI AMINOACIDI. LE PROTEINE SONO POLIMERI DI AMINOACIDI LEGATI TRA DI LORO DA LEGAMI PEPTIDICI SOLO QUANDO UNA PROTEINA ASSUME LA SUA CORRETTA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE, O CONFORMAZIONE, E IN GRADO DI FUNZIONARE EFFICACEMENTE. LA FUNZIONE DIPENDE DALLA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE E LA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE E DETERMINATA DALLA SEQUENZA AMINOACIDICA IL GENE PUO ESSERE DEFINITO COME UNA SEQUENZA DI NUCLEOTIDI ADIACENTI CHE SPECIFICANO LE SEQUENZE AMINOACIDICHE DELLE PROTEINE DELLA CELLULA. LE SEQUENZE NUCLEOTIDICHE E QUELLE AMINOACIDICHE CORRISPONDENTI SONO COLINEARI. I MECCANISMI MOLECOLARI CHE STANNO ALLA BASE DELLA COLINEARITA TRA SEQUENZE
DUPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI LA DUPLICAZIONE DEL CROMOSOMA BATTERICO CIRCOLARE INIZIA IN UN UNICO PUNTO E PROCEDE BIDIREZIONALMENTE FINO A QUANDO TUTTO IL CROMOSOMA NON E STATO COPIATO. LA ZONA IN CUI LA PARTE NEOSINTETIZZATA INCONTRA QUELLA NON DUPLICATA E DEFINITA FORCELLA DI DUPLICAZIONE. LA REPLICAZIONE INIZIA IN UN PUNTO DI ORIGINE FISSO E PROCEDE IN DIREZIONI OPPOSTE FINO A CHE LE FORCELLE DI REPLICAZIONE SI INCONTRANO. IN E. COLI SONO STATI SCOPERTI TRE ENZIMI CHE POSSONO CATALIZZARE LA SINTESI SU STAMPO DEL DNA (DNA POLIMERASI I, DNA POLIMERASI II, DNA POLIMERASI III). DNA POLIMERASI I: RIPARA LE LESIONI SUBITE DALLA CATENA DI DNA E INTERVIENE NEL PROCESSO DI SALDATURA DEI FRAMMENTI DI OKAZAKI. DNA POLIMERASI II: PARTECIPA ALLA RIPARAZIONE DELLA CATENA DI DNA.
DNA POLIMERASI III: E RESPONSABILE DELL ALLUNGAMENTO DELLA CATENA DEL DNA DURANTE LA DUPLICAZIONE. LA DNA POLIMERASI III ESISTE IN UNA FORMA PIU SEMPLICE (CON ATTIVITA MINIMA E DI TIPO DISTRIBUTIVO) FORMATA DA TRE SUBUNITA (α, ε, θ) E IN UNA FORMA MOLTO PIU ATTIVA (NOTA COME OLOENZIMA) COSTITUITA DA 11 SUBUNITA DI 10 TIPI DIFFERENTI. L ENZIMA SINTETIZZA IL DNA AGGIUNGENDO UN NUCLEOTIDE PER VOLTA ALL ESTREMITA 3 DELLA CATENA IN ACCRESCIMENTO. IL NUCLEOTIDE AGGIUNTO DERIVA DA UN DESOSSIRIBONUCLEOSIDE-5 - TRIFOSFATO (dntp). PER QUESTA REAZIONE E, INOLTRE, NECESSARIO Mg ++, POICHE I dntp PER POTER ESSERE UTILIZZATI DEVONO ESSERE COMPLESSATI CON IL MAGNESIO. LO SCHELETRO ZUCCHERO-FOSFATO SI FORMA PER TRASFERIMENTO DI UN GRUPPO NUCLEOTIDICO DA UN dtnp AL GRUPPO OSSIDRILICO 3 DEL RESIDUO NUCLEOTIDICO TERMINALE DELLA CATENA DI DNA IN ALLUNGAMENTO. L IDROLISI DEL PIROFOSTATO (PP) AD OPERA DI UNA PIROFOSFATASI FORNISCE L ENERGIA NECESSARIA ALLA REAZIONE. L ENZIMA OPERA AD UNA VELOCITA DI CIRCA 1000 RESIDUI NUCLEOTIDICI AL SECONDO.
TEORICAMENTE LA DNA-POLIMERASI III POTREBBE AGIRE CON DUE MECCANISMI DIVERSI: 1) DOPO CHE UN NUOVO RESIDUO E STATO AGGIUNTO ALLA CATENA, L ENZIMA POTREBBE STACCARSI E LEGARSI A CASO SU DI UN ALTRA CATENA INCOMPLETA (PROCESSO DI SINTESI DEFINITO DISTRIBUTIVO). OPPURE 2) UNA VOLTA CHE LA POLIMERASI HA INIZIATO LA SINTESI DEL DNA SU UN FILAMENTO CHE FUNGE DA STAMPO, RIMANE LEGATA AD ESSO FINCHE TALE FILAMENTO NON VIENE COMPLETAMENTE REDUPLICATO (PROCESSO DEFINITO PROGRESSIVO). SPERIMENTALMENTE SI E POTUTO DIMOSTRARE CHE IL MECCANISMO D AZIONE DELLA DNA-POLIMERASI III (VEDI ESPERIMENTO) E PROGRESSIVO. QUANDO IN VIVO L ENZIMA SI ASSOCIA AD UN CROMOSOMA PROBABILMENTE NON SE NE DISSOCIA FINO A QUANDO L INTERO CROMOSOMA NON E STATO REDUPLICATO.
LE VARIE SUBUNITA DELL OLOENZIMA HANNO CIASCUNA UNA FUNZIONE SPECIFICA: 1) LA SUBUNITA α CATALIZZA IL TRASFERIMENTO DI UN GRUPPO NUCLEOTIDICO IN DIREZIONE 5 3. 2) LA SUBUNITA β AGGANCIA SALDAMENTE L OLOENZIMA ALLA CATENA DI DNA. 3) LA SUBUNITA τ HA IL COMPITO DI TENERE UNITE COME DIMERO 2 MOLECOLE DI DNA POLIMERASI III. 4) LA SUBUNITA ε HA ATTIVITA ESONUCLEASICA 3 5. 5) LE RIMAMENTI 6 SUBUNITA FORMANO IL COMPLESSO γ La subunità β conferisce alla DNA polimerasi III il suo meccanismo d azione progressivo. Due subunità β, infatti, formano un dimero ad anello attorno al DNA che scorre lungo l α-elica trascinando con se tutto l oloenzima. L iniziale formazione dell anello β richiede l idrolisi i ATP ad opera del complesso γ. LA DNA-POLIMERSAI III E CAPACE DI CORREGGERE GLI ERRORI SULLA CATENA DI DNA IN FORMAZIONE CAUSATI DA UN NON CORRETTO ACCOPPIAMENTO DELLE BASI. QUESTO E POSSIBILE PERCHE LA SUBUNITA ε POSSIEDE UN ATTIVITA ESONUCLEASICA 3 5 CHE
IDROLIZZA IL LEGAME FOSFODIESTERE TRA IL RESIDUO TERMINALE E IL RESTO DELLA CATENA. L OLOENZIMA INCORPORA UNA BASE SBAGLIATA CIRCA UNA VOLTA OGNI 10.000 REAZIONI DI ALLUNGAMENTO (TASSO DI ERRORE 10-4 ). QUESTI ERRORI VENGONO CORRETTI DALL ATTIVITA ESONUCLEASICA DELLA SUBUNITA ε CHE, A SUA VOLTA, HA UN TASSO DI ERRORE DI 10-3. LA COMBINAZIONE DI QUESTE DUE REAZIONI SEQUENZIALI PRODUCE UN TASSO COMPLESSIVO DI ERRORE DI 10-7 (UNO DEI PIU BASSI MAI RISCONTRATI PER UN ENZIMA). QUINDI ENORMI MOLECOLE DI DNA VENGONO REDUPLICATE CON POCHISSIMI ERRORI. ALTRE PROTEINE COLLABORANO, INOLTRE, CON LA DNA-POLIMERASI III. 1) LE ELICASI CATALIZZANO LO SVOLGIMENTO DELL α-elica A LIVELLO DELLE FORCELLE DI DUPLICAZIONE. 2) LA PROTEINA CHE SI LEGA AD UN SINGOLO FILAMENTO (SSB) IMPEDISCE AI FILAMENTI DI DNA DENATURATI DI RIFORMARE L α- ELICA O DELLE ANSE A FORCINA (CHE ARRESTEREBBERO L AZIONE DELLA POLIMERASI).
LA DNA-POLIMERSAI III CATALIZZA L ALLUNGAMENTO DELLA CATENA DI DNA SOLO IN DIREZIONE 5 3. TUTTAVIA, UN ESAME DELLA FORCELLA DI DUPLICAZIONE RIVELA CHE LA SINTESI 5 3 PUO ESSERE CONTINUA SOLO SU DI UN FILAMENTO. NELL ALTRO FILAMENTO, CHE HA UNA POLARITA OPPOSTA, LA SINTESI 5 3 PROCEDE IN DIREZIONE OPPOSTA RISPETTO ALLA FORCELLA DI DUPLICAZIONE. IL NUOVO FILAMENTO FORMATOSI PER POLIMERIZZAZIONE 5 3 NELLA DIREZIONE DELLA FORCELLA E CHIAMATO FILAMENTO GUIDA. L ALTRO FILAMENTO, FORMATOSI PER POLIMERIZZAZIONE 5 3 IN DIREZIONE OPPOSTA ALLA FORCELLA E CHIAMATO FILAMENTO LENTO. IL FILAMENTO LENTO DEVE NECESSARIAMENTE ESSERE SINTETIZZATO IN FRAMMENTI, CIASCUNO DEI QUALI VIENE POLIMERIZZATO IN DIREZIONE 5 3. SOLO IN UN SECONDO MOMENTO I FRAMMENTI NEOSINTETIZZATI VENGONO LEGATI TRA LORO A FORMARE UN FILAMENTO COMPLETO (SINTESI DISCONTINUA DEL DNA). LA PROVA DELLA SINTESI DISCONTINUA DEL DNA E STATA OTTENUTA MARCANDO IL DNA NEOSINTETIZZATO CON 3H-TIMIDINA
ED ESAMINANDO, POI, LA STRUTTURA DEGLI INTERMEDI DI DUPLICAZIONE LA TIMIDINA TRIZIATA VIENE SOMMINISTRATA PER UN BREVE PERIODO ALLE CELLULE DI E. COLI IN FASE DI DUPLICAZIONE. LA SINTESI DEL DNA VIENE BLOCCATA A DIVERSE RIPRESE E IL DNA NEOSINTETIZZATO VIENE ISOLATO. LE MOLECOLE DI DNA NEOSINTETIZZATO SONO DI DUE TIPI: MOLECOLE DI DNA MOLTO GRANDI (CONTENETI CIRCA META DELLA RADIOATTIVITA TOTALE) E FRAMMENTI DI 1000-2000 NUCLEOTIDI (CONTENETI L ALTRA META DELLA RADIOATTIVITA ). LE MOLECOLE GRANDI DI DNA DERIVANO DALLA SINTESI CONTINUA DEL FILAMENTO GUIDA. I FRAMMENTI PIU PICCOLI, INVECE, DERIVANO DALLA SINTESI DISCONTINUA DEL FILAMENTO LENTO. QUESTI PICCOLI FRAMMENTI DI DNA SONO CHIAMATI FRAMMENTI DI OKAZAKI. ESISTE, PERO, UN ULTERIORE PROBLEMA. NESSUNA DNA-POLIMERASI NOTA E IN GRADO DI INIZIARE LA POLIMERIZZAZIONE DEL DNA EX NOVO, MA TUTTE RICHIEDONO PER POTER AGIRE LA PRESENZA DEL GRUPPO OSSIDRILICO 3 DI UN CORTO RNA INNESCO. PERCIO LA SINTESI DI TUTTI FRAMMENTI DI OKAZAKI (COSI COME DEL
FILAMENTO GUIDA) COMINCIA CON QUELLA DI UN RNA INNESCO 5 3 AL QUALE LA DNA-POLIMERASI III PUO, POI, AGGIUNGERE DESOSSIRIBONUCLEOTIDI. L RNA INNESCO VIENE SINTETIZZATO DA UN ENZIMA DETTO PRIMASI (O dnag) CHE SINTETIZZA UN CORTO RNA INNESCO (< 15 NUCLEOTIDI) AL SECONDO. POICHE LA FORCELLA DI DUPLICAZIONE SI MUOVE AD UNA VELOCITA DI CIRCA 1000 NUCLEOTIDI AL SECONDO, LA PRIMASI PRODUCE UN INNESCO OGNI 1000 NUCLEOTIDI. A MANO A MANO CHE ALTRO DNA A FILAMENTO SINGOLO COMPARE DIETRO AD ESSA, LA PRIMASI AVANZA CON LA FORCELLA DI DUPLICAZIONE E SINTETIZZA NUOVI INNESCHI PER NUOVI FRAMMENTI DI OKAZAKI. LA PRIMASI E UN COMPONENTE DEL PRIMOSOMA, CHE E UN COMPLESSO MULTIMERICO CHE OPERA A LIVELLO DELLA FORCELLA DI DUPLICAZIONE. IL PRIMOSOMA CONTIENE ALMENO 17 POLIPEPTIDI DIFFERENTI, TRA I QUALI (OLTRE ALLA PRIMASI) 6 MOLECOLE DI dnab E 6 MOLECOLE DI dnac. QUESTI DUE ENZIMI SONO DELLE ELICASI CHE SROTOLANO E SEPARANO I DUE FILAMENTI DELL α-elica UTILIZZANDO A TALE SCOPO L ENERGIA FORNITA DALL IDROLISI DI MOLECOLE DI ATP.
UNA VOLTA CHE I FRAMMENTI DI OKAZAKI SONO STATI SINTETIZZATI, GLI RNA INNESCO VENGONO IDROLIZZATI SIA DALLA RNASI H CHE DALLA COMPONENTE ESONUCLEASICA DELLA DNA-POLIMERASI I. A QUESTO PUNTO IL FILAMENTO LENTO E COSTITUITO DA MOLTI FRAMMENTI DI OKAZAKI SEPARATI DA DISCONTINUITA DOVUTE ALL ASSENZA DI ALCUNI NUCLEOTIDI (DOVE PRIMA ERANO PRESENTI GLI RNA INNESCO). LA DNA-POLIMERASI I POSSIEDE DIVERSE ATTIVITA : 1) ATTIVITA ESONUCLEASICA 5 3 RIMUOVE L RNA INNESCO ALL ESTREMITA DI CIASCUN FRAMMENTO DI OKAZAKI (ESITE ANCHE UN ATTIVITA ESONUCLEASICA 3 5 CHE CORREGGE IL FILAMENTO DI DNA QUALORA VENGANO INSERITI NUCLEOTIDI ERRONEAMENTE APPAIATI). 2) ATTIVITA POLIMERASICA 5 3 RIEMPIE LE LACUNE TRA I FRAMMENTI DI OKAZAKI RIMASTE DOPO L IDROLISI DEGLI RNA INNESCO.
IL PROCESSO MEDIANTE IL QUALE LA DNA-POLIMERASI I SOSTITUISCE GLI RNA INNESCO CON DNA VIENE DEFINITO TRASLAZIONE DELLE DISCONTINUITA. STRUTTURA CRISTALLINA DI UN FRAMMENTO DI DNA-POLIMERASI I. L ENZIMA POSSIEDE UNA FENDITURA LARGA 2 nm E RIVESTITA DA CATENE LATERALI DI AMINO ACIDI CON CARICA POSITIVA CHE POSSONO LEGARE IL DNA. IL FILAMENTO STAMPO VIENE COSI A TROVARSI COMPLETAMENTE INSERITO ALL INTERNO DI QUESTA FENDITURA. LO STADIO FINALE NELLA MATURAZIONE DEL FILAMENTO LENTO DI DNA APPENA SINTETIZZATO E LA SALDATURA DEI FRAMMENTI DI OKAZAKI DA PARTE DELL ENZIMA DNA-LIGASI. QUESTO ENZIMA CATALIZZA LA FORMAZIONE DI UN LEGAME FOSFODIESTERE TRA IL GRUPPO OSSIDRILICO 3 DELL ESTREMITA DI UN FRAMMENTO DI OKAZAKI E IL GRUPPO FOSFATO 5 DEL FRAMMENTO DI OKAZAKI ADIACENTE. IN VIVO LA SINTESI DEL FILAMENTO GUIDA E DI QUELLO LENTO AVVENGONO APPROSSIMATIVAMENTE ALLA STESSA VELOCITA, POICHE I DUE PROCESSI DI REDUPLICAZIONE SONO FISICAMENTE ACCOPPIATI. LE PROTEINE COINVOLTE NELLA SINTESI DEI DUE
FILAMENTI SI ASSOCIANO, INFATTI, A FORMARE UN UNICO COMPLESSO PROTEICO, IL REPLISOMA. UN REPLISOMA PRESENTE NELLA FORCELLA DI DUPLICAZIONE RISULTA PERCIO COSTITUITO DA: 2 MOLECOLE DI DNA-POLIMERASI III (UNA PER IL FILAMENTO GUIDA E UNA PER QUELLO LENTO). 1 PRIMOSOMA COSTITUITO DALLA PRIMASI (CHE SINTETIZZA GLI RNA INNESCO) E DALLE ELICASI (dnab E dnac). 1 PROTEINA REP CHE SVOLGE LA STESSA FUNZIONE DI dnab (CIOE SROTOLARE L α-elica) MA PER IL FILAMENTO GUIDA. 4 PROTEINE SSB CHE SI LEGANO AL FILAMENTO SINGOLO CHE FA DA STAMPO PER IL FILAMENTO LENTO E GLI IMPEDISCONO DI RIFORMARE L α-elica O ANSE A FORCINA. VARIE DNA-TOPOISOMERASI CHE ALLENTANO LA TENSIONE CHE SI ACCUMULA A MONTE DELLA FORCELLA PER LO SROTOLAMENTO DELL α-elica QUANDO LA DNA-POLIMERASI III CHE SINTETIZZA IL FILAMENTO LENTO INCONTRA L RNA INNESCO ATTACCATO AL FRAMMENTO DI OKAZAKI PRECEDENTE, SI DISSOCIA DALLO STAMPO DI DNA
(L ANELLO β SI APRE) MA RIMANE ASSOCIATA AL REPLISOMA PER MEZZO DELLE DUE SUBUNITA τ. QUESTA DNA-POLIMERASI QUINDI NON E ASSOLUTAMENTE PROGRESSIVA IN QUANTO DI TANTO IN TANTO SI STACCA DAL DNA. NEL FRATTEMPO IL PRIMOSOMA PRODUCE UN NUOVO RNA INNESCO A LIVELLO DEL QUALE L ANELLO β SI RIASSOCIA E COSI RICOMINCIA LA SINTESI DI UN NUOVO FRAMMENTO DI OKAZAKI. β τ LA DUPLICAZIONE DEL DNA BATTERICO HA INIZIO IN UN SITO UNICO DETTO SITO DI ORIGINE DELLA DUPLICAZIONE (oric IN E. COLI). oric CONSISTE IN UNA SEQUENZA DI 245 NUCLEOTIDI ALTAMENTE CONSERVATI IN QUASI TUTTI I BATTERI STUDIATI (QUINDI QUESTO SITO SI E CONSERVATO DURANTE L EVOLUZIONE). ADIACENTE AD oric E PRESENTE UN SEGMENTO DI DNA RICCO DI A e T CHE FACILITANO LA DENATURAZIONE DELL α-elica
oric PRESENTA QUATTRO SITI DI LEGAME CHE ALL INIZIO DEL PROCESSO DI REDUPLICAZIONE DEL DNA INTERAGISCONO CON dnaa CHE E UNA PROTEINA TETRAMERICA ASSOLUTAMENTE INDISPENSABILE PER L AVVIO DELLA REDUPLICAZIONE. UNA VOLTA CHE LE PRIME 4 dnaa SI SONO LEGATE AD oric, MOLTE ALTRE SE NE AGGIUNGONO. SI VIENE COSI A FORMARE UNA STRUTTURA PARTICOLARE CON UN NUCLEO CENTRALE PROTEICO ATTORNO AL QUALE SI AVVOLGONO DELLE SPIRE DI DNA CHE DETERMINA UNA PICCOLA DENATURAZIONE DEL DNA. QUESTO PROCESSO DI DENATURAZIONE RICHIEDE ANCHE L IDROLISI DI ATP. IN QUESTA BOLLA DI DNA DENATURATO COMINCIANO AD ASSEMBLARSI I COMPONENTI DEL REPLISOMA. PER PRIMA COSA LE PRIMASI SINTETIZZANO L RNA INNESCO PER IL FILAMENTO GUIDA DELLA FORCELLA OPPOSTA. IN UN SECONDO MOMENTO LA PRIMASI COMINCIA A SINTETIZZARE ANCHE L RNA INNESCO PER IL FILAMENTO LENTO. IN QUESTO MODO LA REDUPLICAZIONE PROCEDE PER AMBEDUE I FILAMENTI STAMPO IN ENTRAMBE LE DIREZIONI (QUINDI SONO NECESSARIE 4 MOLECOLE DI DNA-POLIMERASI III).
I superavvolgimenti negativi o positivi del DNA vengono rimossi da enzimi detti Topoisomerasi. Questi enzimi vengono classificati in Topoisomerasi di tipo I e di tipo II. Topoisomerasi di tipo I Meccanismo d azione: 1. L enzima taglia uno dei 2 filamenti di DNA. 2. Si forma un legame fosfoesterico tra il P 5 e l OH di una tirosina dell enzima. 3. L OH 3 si lega all enzima con legami non covalenti. 4. Il filamento non tagliato passa attraverso l interruzione dell altro filamento. 5. L enzima infine risalda il filamento interrotto. 6. Si riforma un filamento identico a quello iniziale ma con un superavvolgimento in meno. Tutto il processo non richiede energia. Qualsiasi enzima che incide e poi richiude un solo filamento della doppia elica di DNA è classificato come Topoisomerasi di tipo I. Le Topoisomerasi di tipo I rimuovono: Nei procarioti solo superavvolgimenti negativi. Negli eucarioti superavvolgimenti sia negativi che positivi.
Topoisomerasi di tipo II (Dette anche Girasi in E. Coli). Sono quelle che rimuovono i superavvolgimenti positivi a monte della forcella di duplicazione dei procarioti. Meccanismo d azione: 1. L enzima taglia entrambi i filamenti di DNA. 2. L a-elica viene fatta passare attraverso il taglio. 3. L enzima richiude il taglio utilizzando energia fornita da idrolisi di ATP.