Metabolismo dell azoto

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1 Metabolismo dell azoto Tutti gli organismi sono capaci di convertire l ammoniaca in composti organici azotati cioè sostanze contenenti legami C-N Sono molto meno gli organismi in grado di sintetizzare ammoniaca a partire da N inorganico, cioè l azoto molecolare (N 2 ), costituente principale dell atmosfera terrestre, e lo ione nitrato (NO 3 ), presente nel suolo ed essenziale per le piante Il primo processo di riduzione dell N 2 in NH 4 + è detta FISSAZIONE BIOLOGICA DELL AZOTO, ed è svolta da particolari microrganismi in simbiosi o meno con piante Il secondo processo di RIDUZIONE DEI NITRATI presenti nel suolo è ampiamente diffuso sia in piante che microrganismi

2 Nella biosfera c è un costante equilibrio tra l azoto totale inorganico e quello organico La conversione dell azoto dalla forma organica, attraverso la fissazione biologica o la riduzione dei nitrati, è controbilanciata dal catabolismo e cioè dalla DENITRIFICAZIONE e dalla DECOMPOSIZIONE Il catabolismo produce ammoniaca e altri composti organici azotati che possono essere metabolizzati da diversi batteri: Nitrosomonas ossida l ammoniaca a nitrito Nitrobacter ossida il nitrito a nitrato I batteri denitrificanti catabolizzano invece l ammoniaca a N 2

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5 Gli animali eterotrofi utilizzano azoto già contenuto in molecole organiche vegetali. Essi poi utilizzano i "mattoni" per la costruzione delle proprie proteine Al contrario delle piante, gli animali effettuano l'escrezione di N sotto forma di urea ed acido urico. Da queste molecole può essere nuovamente liberata NH 3 per attività della ureasi (batteri, terreno, piante) NH 3 si forma anche in processi di putrefazione Nel terreno è presente NH 3 sotto forma di NH 4 + assorbita dai colloidi

6 Fissazione dell'azoto atmosferico Dando uno sguardo al ciclo dell'azoto è chiaro che l'azoto fissato in forma inorganica (nitrati ed ammoniaca) ed organica tende, attraverso vari processi, a ritrasformarsi in N 2 Occorre pertanto un processo contrario che renda l'n 2 atmosferico di nuovo disponibile per le piante (riduzione dell'n 2 a NH 4+ ). Questo avviene attraverso la FISSAZIONE BIOLOGICA DELL AZOTO ATMOSFERICO Secondo una stima, la fissazione dell'n 2 annualmente a 9x10 10 Kg ammonta

7 La fissazione dell N 2 è prerogativa esclusiva di alcuni batteri ed alcune specie di alghe blu, liberi o in simbiosi con piante superiori I microrganismi fissatori si distinguono a seconda della pianta ospite: 1 gruppo: Leguminose Queste piante ospitano nei tubercoli radicali una forma degenerata del Rhizobium (come batteroide) Inizialmente si pensava che si trattasse di una malattia, in quanto no era nota la capacità di fissazione dell azoto atmosferico Esiste una stretta associazione metabolica fra la pianta ospite ed il Batteroide. Né il Rhizobium né la pianta sono in grado da soli di fissare l'n 2 Non si conoscono i fattori che attraverso la simbiosi consentono al Batteroide di fissare l'n 2

8 2 gruppo: non Leguminose Anche in angiosperme e gimnosperme si trovano microrganismi in tubercoli radicali. L'endofita delle angiosperme non è ancora ben noto. Probabilmente si tratta di Actinomiceti. Presso alcune gimnosperme svolgono questo ruolo simbiotico alcune alghe blu Il contributo di organismi non simbionti al totale dell'n 2 fissato è relativamente scarso Esistono tuttavia batteri N 2 -fissatori nell'intestino di mammiferi (uomo, maialino d'india). Essi sono stati molto utili per chiarire i meccanismi biochimici della fissazione (Clostridium pasteurianum, Azotobacter vinelandii, Klebsiella pneumoniae, Bacillus polymyxa, Rhodospirillum rubrum)

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11 Meccanismo di fissazione dell'azoto Il punto focale della N 2 -fissazione è costituito dalla reazione catalizzata da un enzima: la NITROGENASI La fissazione dell'azoto attraverso estratti liberi da cellule procede solo in anaerobiosi L'enzima viene infatti disattivato irreversibilmente dalla presenza di O 2 Questo e la mancanza di un isotopo radioattivo dell'azoto spiegano le difficoltà incontrate nel chiarire questo meccanismo

12 Secondo i primi studi effettuati la reazione di fissazione biologica era la seguente: N 2 + 6e- + 6H > 2NH 3 Studi ulteriori sottolinearono che per avvenire la fissazione era necessaria l idrolisi di ATP e veniva liberato idrogeno gassoso Il meccanismo biologico di fissazione richiede inoltre 8 elettroni invece che 6, i due aggiuntivi sono necessari per la produzione dell idrogeno gassoso: 2 + 8e- + 8H+ + ATP -----> 2NH3 + H2 + ADP + Pi

13 La fissazione è quindi operata dall enzima nitrogenasi composta da due proteine: - NITROGENASI RIDUTTASI (omodimero di 64kDa) - NITROGENASI (eterotetramero di 240 kda) -La nitrogenasi riduttasi è una proteine 4Fe-4S che, legando 2 molecole di ATP e una ferredossina, genera un elettrone che viene trasferito alla nitrogenasi -La nitrogenasi catalzza la reazione N 2 2NH 4 +

14 La NITROGENASI è un tetramero e contiene 2 siti catalitici indipendenti (2 centri Fe-S) ed anche un cofattore FeMoCo La nitrogenasi opera la riduzione dell N 2 utilizzando gli elettroni che gli sono stati ceduti dalla Nitrogenasi Riduttasi 8H + + 8e- + N 2 2NH 3 + H 2 Considerando la reazione precedente il bilancio della fissazione dell N 2 è dato da: N2 + 4NADH + 4H ATP 2NH3 + H2 + 4NAD ADP + 16P Ancora oggi non è chiaro perché viene evoluto H 2 durante il processo

15 La NITROGENASI RIDUTTASI è un omodimero che contiene un singolo centro 4Fe-4S e spesso è chiamata Fe-proteina Una caratteristica peculiare della nitrogenasi riduttasi è quella che nella forma ridotta l enzima può legare 2 molecole di MgATP che determina cambiamenti conformazionali della struttura. In questa nuova forma, la nitrogenasi riduttasi si lega più strettamente alla nitrogenasi La nitrogenasi riduttasi ossidata accetta un elettrone che proviene dalla ferredossina, lega 2 moli di MgATP e trasferisce l elettrone alla nitrogenasi L ATP è quindi idrolizzato a produrre 2 moli di MgADP e 2 Pi in una reazione che vede coinvolte entrambi i complessi della nitrogenasi

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17 La NITROGENASI RIDUTTASI trasferisce elettroni sequenzialmente alla nitrogenasi dove essi si accumulano prima nei centri F-S e quindi sono trasferiti al complesso FeMoCo, che a questo punto lega l N 2 Con la riduzione della nitrogenasi, il complesso acquisisce sino a 4 idrogeni prima di legare l N 2 e prima che la riduzione inizi Quando l N 2 si lega, si ha il rilascio dell idrogeno gassoso come prodotto di scarto, ma la nitrogenasi può ancora rilasciare improduttivamente idrogeno senza legare l N 2

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22 La nitrogenasi è sensibile all ossigeno La ragione principale che consente la fissazione dell azoto nei noduli delle radici delle piante infettate da Rhizobium è che questi noduli contengono elevate quantità di LEGHEMOGLOBINA che mantiene l ambiente anaerobico legando tutto l ossigeno che trova accesso ai noduli La leghemoglobina è localizzata nel citosol delle cellule ospite ed è normalmente presente ad elevate concentrazioni

23 REGOLAZIONE DELLA NITROGENASI I geni per la nitrogenasi e la nitrogenasi riduttasi fanno parte di un complesso genico chiamato regulone nif Il regulone nif comprende: - Geni strutturali per il complesso - Geni per il complesso FeMo - Geni che controllano le proteine implicate nel trasporto degli elettroni - Diversi geni regolatori

24 REGOLAZIONE DELLA NITROGENASI La nitrogenasi è sottoposta a regolazione molto rigorosa: - Fissazione è inibita dall ossigeno - Dalla presenza di azoto combinato, ammoniaca, ossidi di azoto e alcuni amminoacidi La regolazione avviene soprattutto a livello di trascrizione: - La trascrizione dei geni nif strutturali è attivata dalla proteina NifA (regolazione positiva) e la nitrogenasi riduttasi fanno parte di un complesso genico chiamato regulone nif e repressa dalla proteina NifL (regolazione negativa)

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27 In presenza di alcune specie di rizobio, le leguminose formano una struttura caratteristica che è il NODULO RADICALE in cui avviene la fissazione dell azoto Nell ambito del nodulo avvengono sia la fissazione dell azoto che la sintesi di ATP da parte del batterio La pianta nei noduli genera acidi organici che nutrono il batterio e forniscono scheletri carboniosi utilizzati per il trasporto dei composti azotati necessari per trasferire l azoto fissato al resto della pianta

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33 La cellula ospite scambia con il batteroide essenzialmente MALATO formato dalla sintesi del saccarosio La saccarosio sintasi scinde il saccarosio in glucosio che tramite la glicolisi viene ossidato sino a PEP che è carbossilato ad ossalacetato (OAA) e quindi ridotto a malato L NH 3 formato dalla fissazione nelle cellule ospiti viene inizialmente convertito in GLUTAMMINA e trasportato tramite lo xilema nei vari organi della pianta

34 Saccarosio Malato Batteroide Fissazione N 2 N 2 NH 4 + Glutammina

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36 Il nodulo radicale è quindi formato dalla pianta ospite L infezione avviene normalmente attraverso i peli radicali i quali rispondono a specifici segnali batterici alterando la loro crescita per intrappolare il potenziale simbionte Anche la struttura attraverso cui avviene l infezione (FILAMENTO INFETTIVO) può essere formata dalla pianta e si compone di materiale della parete cellulare Il filamento infettivo riempito di batteri in attiva crescita penetra negli starti radicali per incontrare le cellule della pianta in divisione

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38 Dopo che il filamento infettivo è penetrato in uno o più strati di cellule ospiti, i batteri vengono rilasciati in vacuoli legati alle membrane ed entrano nella cellula ospite Questi vacuoli sono denominati SIMBIOSOMI e possono contenere da uno a più batteri

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40 In simbiosi i batteri differenziano i BATTEROIDI che sono talvolta morfologicamente distinguibili dai batteri liberi

41 I noduli sono strutture relativamente semplici che contengono da decine a poche centinaia di proteine nodulo-specifiche sintetizzate dalla piante e chiamate NODULINE Una caratteristica essenziale della simbiosi è il mutuo riconoscimento tra pianta ospite e simbionti batterici: composti rilasciati dalla pianta inducono l espressione di geni batterici implicati nella simbiosi (geni nod) I segnali associati all espressione di questi geni sono normalmente i FLAVONOIDI

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43 RIDUZIONE ASSIMILATORIA DEI NITRATI Le piante verdi, i batteri ed i funghi sono in grado di prelevare i nitrati dal terreno e ridurli a NH 3 e trasferire quest'ultima nei composti azotati tipici della cellula Il nitrato viene assorbito dalla soluzione circolante del suolo attraverso le cellule epidermiche e corticali della radice Il trasporto di nitrato nelle radici procede con un simporto di 2 protoni. Un gradiente protonico trans-membrana, generato da un H + -ATPasi, permette il trasporto del nitrato contro gradiente e l ATP richiesto deriva dalla respirazione mitocondriale Il nitrato deve quindi essere ridotto a nitrito dalla NITRATO RIDUTTASI e quindi ad ammonio attraverso l azione dell enzima NITRITO RIDUTTASI

44 RIDUZIONE DEL NITRATO: ENZIMA NITRATO RIDUTTASI Il primo step è la riduzione dei nitrati a nitriti Il potere riducente è rappresentato dal NADH o NADPH La NR è un metallo-enzima che possiede siti per il legame con il NAD(P)H e per il nitrato Sono presenti 3 cofattori, forniscono centri redox per il trasporto degli elettroni: - FAD (-272 mv) - un gruppo Fe-eme (-160 mv) - un cofattore contenente molibdeno (MoCo) (-10 mv) NO 3- + NAD(P)H + H + NO 2- + NAD(P) + + H 2 O

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46 RIDUZIONE DEL NITRITO IN AMMONIACA: enzima NITRITO RIDUTTASI NO 2- + NAD(P)H + H + (o Fdred) NH 4+ + NAD(P) + (o Fdox) L enzima responsabile è la NITRITO RIDUTTASI, che è localizzata nei plastidi e per il suo meccanismo occorre fare distinzione fra : a) tessuti non fotosintetizzanti, (radici) e funghi. Il donatore di elettroni in vivo è probabilmente NADPH attraverso ripetute cessioni di 2 elettroni all'no 2-. Il NADPH proviene probabilmente dal ciclo dei pentosi fosfati (ossidativo). Il NADPH riduce la ferredossina in una reazione catalizzata dalla Fd-NADP riduttasi b) tessuti fotosintetici. L'enzima è localizzato nei cloroplasti. L elettrodonatore è la Ferredossina. L'enzima è inducibile da nitrito e nitrato

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48 Equazione generale NO H + + 8e - NO 3 + H 2 O + OH - Si consumano otto equivalenti di elettroni e otto equivalenti di idrogenioni nella riduzione di un grammoione di NO 3 - a NH 3 La reazione risulta in una alcalinizzazione con la produzione di 1 equivalente di OH-. Ciò induce un accumulo di acidi organici, in particolare di acido malico nel citoplasma e nei vacuoli

49 Interazione tra assimilazione nitrato e metabolismo carbonio Deviazione della sintesi dell amido verso la produzione di aminoacidi ed acidi organici come il malato La PEPcase che catalizza la sintesi di OAA, il quale è quindi convertito in -chetoglutarato, è regolata da alte concentrazioni di nitrato L ADP-glucosio pirofosforilasi è invece sottoregolata alte concentrazioni di nitrato da

50 La luce svolge un ruolo importante nella assimilazione dei nitrati Basse intensità luminose deprimono la riduzione dei nitrati favorendone l'accumulo nei vegetali, soprattutto in corrispondenza di abbondanti concimazioni nitriche Ciò può costituire un pericolo quando i vegetali siano destinati ad alimentazione del bestiame o all'alimentazione umana

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53 Assimilazione dell ammoniaca: BIOGENESI DELL AZOTO ORGANICO Indipendentemente dalla fonte di azoto, tutti gli organismi hanno in comune un numero limitato di vie metaboliche per l utilizzo dell azoto inorganico sotto forma di ammoniaca L ammoniaca in concentrazioni elevate è assai tossica, ma a concentrazioni più basse è un metabolita chiave in quanto serve in reazioni che la convertono in composti organici azotati ENZIMI: A) GLUTAMMATO-DEIDROGENASI B) GLUTAMMINA-SINTETASI C) GLUTAMMATO-SINTASI B 3A

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55 GLUTAMMATO DEIDROGENASI: aminazione riduttiva dell -chetoglutarato -chetoglutarato glutammato

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57 GLUTAMMINA SINTETASI: produzione dell azoto ammidico biologicamente attivo glutammato glutammina

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60 I cloroplasti realizzano una riserva di azoto in forma di Glutammina attraverso la reazione catalizzata della Glutammina-sintetasi. Questo enzima possiede una affinità per NH 4+ di oltre 3 volte superiore di quella della Glutammatodeidrogenasi Per questo si attribuisce all enzima, oltre ad una funzione assimilatrice, anche una funzione disintossicante dei cloroplasti onde evitare un eccesso di NH 4+ (disaccoppiante della fotofosforilazione in vitro)

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64 LA TRANSAMINAZIONE La transaminazione gioca un ruolo molto importante nel metabolismo degli amminoacidi in quanto costituisce una via per la ri-distribuzione dell azoto amminoacidico Il GLUTAMMATO costituisce l amminoacido chiave nel processo di transaminazione Le reazioni di transaminazione sono catalizzate da enzimi detti TRANSAMINASI, che utilizzano come cofattore il PIRIDOSSAL FOSFATO

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66 Il gruppo carbonilico del piridossalfosfato (PLP, vitamina B6) si lega ad un gruppo ammino-terminale formando un IMMINA (base di Schiff)

67 Il PLP opera di concerto con importanti enzimi, le TRANSAMINASI Le transaminasi sono enzimi ubiquitari che catalizzano reazioni di trasferimento di un gruppo amminico da un aminoacido donatore (di solito glutammato) su un -chetoacido accettore, secondo lo schema generale: AA 1 (Glu) + KA 2 KA 1 ( KGA) + AA 2

68 Semireazione 1: il gruppo amminico del Glu è trasferito sul coenzima PLP e si libera - chetoglutarato (il primo prodotto di reazione) Semireazione 2: entra il secondo substrato (es. il chetoacido piruvato) che prende il posto del chetoglutarato e le reazioni sopra indicate procedono verso sinistra, con liberazione di alanina e rigenerazione del coenzima nativo (PLP).

69 Semireazione 1: il gruppo amminico del Glu è trasferito sul coenzima PLP e si libera -chetoglutarato (il primo prodotto di reazione)

70 Semireazione 2: entra il secondo substrato (es. il chetoacido piruvato) che prende il posto del KGA e le reazioni sopra indicate procedono verso sinistra, con liberazione di alanina e rigenerazione del coenzima nativo (PLP)

71 chetoacido amminoacido -chetoglutarico ossalacetico gliossilico piruvico idrossi-piruvico glutammato -semialdeide succinato semialdeide -cheto ß-idrossibutirrico glutammico aspartico glicina alanina serina ornitina aminobutirrico treonina

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