Maturazione dell RNA e controllo dell espressione genica

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1 Maturazione dell RNA e controllo dell espressione genica 26 Aprile 2017 Corso di Genetica Molecolare Cecilia Mannironi Is.tuto di Biologia e Patologia Molecolari CNR cecilia.mannironi@uniroma1.it

2 Marzo 2015 Total No of Genes: Protein-coding genes: Total No of Transcripts: Protein-coding transcripts: Total No of Genes: Protein-coding genes: Total No of Transcripts: Protein-coding transcripts: 50162

3 Nell uomo e nello scimpanze le regioni codificanti del genoma sono identiche al 99.7%..The results of this study thus support an important role for alterna3ve splicing in establishing differences between humans and chimpanzees.

4 Maturazione dell mrna La maturazione dell mrna, che comprende capping, splicing, editing (indicato dagli asterischi) e poliadenilazione, precede la traslocazione dal nucleo al citoplasma, dove avviene il processo della traduzione. Si noti la struttura ripartita dell mrna con le regioni non tradotte al 5' e al 3' (5'UTR e 3'UTR) e la regione codificante (CDS).

5 Maturazione del trascritto primario

6 Editing dell RNA Edi.ng C-U Edi.ng A-I

7 Editing C-U del gene per l Apolipoproteina B Entrambi i prodotti proteici del gene ApoB sono coinvolti nel metabolismo dei lipidi, ma con funzioni diverse: la forma di 4563 aa epatica è coinvolta nel trasporto del colesterolo e dei trigliceridi endogeni, quella di 2153 aa intestinale nel trasporto ai vari tessuti dei lipidi assunti con la dieta. L enzima che catalizza l editing è APOBEC1(apolipoprotein-B editing enzyme, catalytic polypeptide like-1).

8 Editing A-I Meccanismo di deaminazione dell adenosina Sanaz Farajollahi and Stefan Maas 2010

9 L inosina si comporta come una guanina L inosina si appaia con la citosina

10 Recoding indotto da Editing Se l editing interessa una sequenza di RNA codificante puo determinare sostituzione amminoacidica nel prodotto genico Val AUU viene normalmente caricato da un trna Ile. In seguito ad editing A-I il codone Ile (AUU) è convertito in un codone Val (IUU) c IUU AUU AAAAA Il cambiamento di lettura del codice genetico determinato da editing dell RNA è detto Recoding. Questo costituisce un meccanismo molecolare di espansione del landscape proteico.

11 Editing A-I Editing Q/R della subunita GluR2 dei recettori ionotropici L editing Q/R (glutammina sostituita da arginina) determina modificazioni funzionali del recettore e riduzione della permeabilita al Ca 2+ dei recettori ionotropici per il glutammato

12 I recettori GluR sono etero-oligomeri e GluR non è mai presente come omopolimero GluR2 L arginina nel loop del poro costituisce un segnale di ritenzione per il Reticolo Endoplasmatico. Questo meccanismo impedisce la formazione di canali GluR2 omo-oligomerici che interferirebbero con una normale trasmissione sinaptica eccitatoria

13 La reazione di editing A-I è catalizzata dalle ADAR (Adenosine Deaminase Acting on RNA). L espressione delle ADAR è universale nei metazoi Nei mammiferi esistono 3 isoforme, ADAR 1-3. ADAR 1 è ubiquitaria, ADAR 2 è espressa maggiormente nel cervello, ADAR 3 è espressa esclusivamente nel cervello e non ha attivita catalitica ma regolativa Le ADAR riconoscono una struttura secondaria dell RNA Duplex imperfetto di 9-15 nucleotidi, che si puo formare tra sequenze distanti anche 1000 nt

14 L editing interessa sia RNA codificanti che RNA non codificanti

15 L editing precede lo splicing dell mrna La maturazione dell mrna, che comprende capping, splicing, editing (indicato dagli asterischi) e poliadenilazione, precede la traslocazione dal nucleo al citoplasma, dove avviene il processo della traduzione. Si noti la struttura ripartita dell mrna con le regioni non tradotte al 5' e al 3' (5'UTR e 3'UTR) e la regione codificante (CDS).

16 Tipica struttura di un introne da splicing nucleare Sequenze introniche consensus Sito donatore GU al 5, sito di ramificazione contenente una A che si trova in prossimità di un tratto polipirimidinico (Y) n, che precede il sito accettore AG al 3'. Questi segnali, che permettono il riconoscimento e la rimozione degli introni, sono contenuti in motivi oligonucleotidici più estesi, rappresentati in basso, dove la dimensione del carattere corrispondente alla base è proporzionale al suo grado di conservazione (notare che qui il sequence logo è dato come DNA e quindi contiene T anziché U).

17 Il processo di splicing nucleare Nel processo di splicing nucleare avvengono due reazioni di trans-esterificazione: 1. la prima reazione di trans-esterificazione fa si che l adenina del sito di ramificazione sia coinvolta in tre legami fosfodiesterici (ingrandimento mostrato a destra) 2. la seconda reazione di trans-esterificazione concatena gli esoni e libera l introne sotto forma di struttura a forma di cappio (lariat). Il processo di splicing nucleare richiede l intervento di un grande complesso macromolecolare denominato spliceosoma, costituito da 200 proteine e 5 RNA

18 Un singolo gene puo generare anche centinaia di trascritti maturi diversi

19 L AS puo modificare l output proteico

20 Pattern piu comuni di splicing alternativo (AS)

21 Lo splicing alternativo (AS) è un fenomeno altamente regolato Piu del 95% dei geni umani vanno incontro a splicing alternativo Pattern alternativi di processamento dell RNA costituiscono un meccanismo di espansione del proteoma Il suo malfunzionamento è alla base di molte patologie L interazione dei componenti dello splicing snrnp (U1 ecc) con proteine di regolazione dello splicing (SRF) permette la scelta di siti alternativi di splicing. Le SRF sono fattori che lavorano in trans riconoscendo elementi in cis presenti sul pre-mrna

22 Il processamento alternativo di un mrna puo interferire con l espressione e la regolazione dell mrna 3 UTR diversi conferiscono inoltre diversa stabilita e localizzazione del mrna

23 Controllo di qualita dell mrna nucleo Il complesso del poro nucleare riconosce ed esporta solo mrnps contenenti mrna completi e completamente processati. Il complesso che lega il Cap e le proteine che legano la coda di poly(a) devono essere presenti nei mrnp. Se avviene ritenzione di un introne questo inibisce il trasporto nucleocitoplasma dell mrna che viene quindi degradato.

24 Controllo di qualita dell mrna citoplasma L inizio della traduzione dell mrna richiede l interazione tra le 5 -capbinding proteins e le poly(a)-binding proteins. RNA mancanti di queste strutture non sono tradotti

25 mrna danneggiati sono degradati da esonucleasi che attaccano il 5 e 3 non protetti Degradazione dell mrna nel lievito

26 Nonsense-mediated mrna decay (NMD) L AS o una mutazione del gene possono portare alla comparsa di un segnale di stop prematuro (non sense o premature termination codon, PTC). Questo fenomeno attiva negli eucarioti un meccanismo di controllo di qualita dell RNA che porta alla degradazione del messaggero.

27 NMD EJC: exon junc.on complex

28 NMD

29 NMD Il NMD è un processo citoplasma.co che rivela la presenza di PTC all interno di un mrna e ne determina la degradazione.

30 RNA Interference (sirna) Howard Hughes Medical Ins.tute (HHMI) Science Educa.on Program