PREVENZIONE DELLA MORTE EMBRIONALE PRECOCE NELLA BOVINA DA LATTE: TRATTAMENTO CON GnRH-ANALOGO

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1 Large Animals Review, Anno 4, n. 2, Giugno PREVENZIONE DELLA MORTE EMBRIONALE PRECOCE NELLA BOVINA DA LATTE: TRATTAMENTO CON GnRH-ANALOGO MASSIMO FAUSTINI**, RITA SALVO*, CARLO GASTALDI*, GIOVANNI MAFFEO** ** Istituto di Fisiologia Veterinaria e Biochimica, Università degli Studi di Milano. * Hoechst Roussel Vet, Milano Riassunto Nelle bovine da latte le perdite embrionali precoci costituiscono un importante fattore d ipofertilità (bovine repeat-breeder). La maggior parte di queste perdite avviene fra il 12 e il 18 giorno dopo l inseminazione e coincide con il periodo di riconoscimento materno della gravidanza. La situazione ormonale della bovina condiziona l attività luteolitica pertanto un trattamento atto a stimolare l attività del corpo luteo può risultare utile per prevenire la mortalità embrionale. La somministrazione, mediante singola iniezione da effettuarsi nei giorni dopo l inseminazione, con un analogo sintetico dell ormone di rilascio delle gonadotropine (buserelin) si è dimostrata una valida tecnica per tale indicazione. Questo trattamento è in grado d incrementare il rilascio di LH e quindi agisce sulla funzionalità del corpo luteo. In questo lavoro viene presentata una rassegna degli studi clinici riportati in letteratura riguardante la somministrazione di buserelin in bovine dopo l inseminazione per la prevenzione della morte embrionale precoce. I risultati dimostrano che l uso di buserelin (10 µg/capo/i.m.) giorni dopo l inseminazione, è risultato efficace in termini di miglioramento delle percentuali di concepimento fino a valori del 12% c.a. Summary In dairy cows the embryo loss during early pregnancy is an important ipofertility factor (bovine repeat breeder). The majority of this loss occurs between days 12 and 18 following insemination, and coincides with the period of the maternal recognition of pregnancy. The hormone status of the cow contributes to the luteolytic activity therefore a hormonal treatment is an appropriate technique to prevent embryo mortality. A single injection of a gonadotrophin releasing hormone analogue (buserelin) on Day following insemination proved to be a very successful hormonal treatment. This treatment enhances the LH release thus influencing the activity of corpus luteum. A review of clinical studies in dairy cows regarding the administration of buserelin post insemination to prevent early embryonic death is presented. The results show that the use of buserelin (10 µg/cow/i.m.) 11 to 13 days after insemination, is appropriate to improve conception rate in dairy cows up to 12%. INTRODUZIONE La fase determinante per il mantenimento della gravidanza in tutti gli animali domestici è quella del riconoscimento materno dello stato gravidico. L embrione infatti è un organismo geneticamente differente dalla madre, pertanto, già a partire dalla prima settimana di vita, esso deve modulare diversi fattori immunologici uterini in modo da prevenire qualsiasi reazione da corpo estraneo da parte della madre. Durante le prime fasi della gravidanza l embrione deve indurre un azione di blocco sulla secrezione endometriale delle prostaglandine F2α ad azione luteolitica. Il blocco è determinato attraverso la produzione e liberazione da parte dell embrione di una proteina antiluteolitica (trofoblastina o interferone tau), definita fattore precoce di gravidanza. L azione locale di questo fattore embrionale consente il mantenimento del corpo luteo ciclico e la sua trasformazione in corpo luteo gravidico che, con l elevata produzione di progesterone garantisce il proseguimento della gravidanza insieme con gli altri cambiamenti fisiologici tipici di questo stato. Nella specie bovina l embrione produce il fattore precoce di gravidanza dal 10 al 25 giorno dopo la fecondazione e si ha l inizio del riconoscimento materno della gravidanza a partire dal giorno dalla fecondazione. Appare evidente che un ritardo nel rilascio da parte dell embrione del segnale di riconoscimento o una produzione non sufficiente di questo possano essere fattori responsabili di perdite embrionali precoci.

2 52 Prevenzione della morte embrionale precoce nella bovina da latte Nelle bovine da latte ad elevata produzione le perdite embrionali durante la fase iniziale della gravidanza costituiscono un fattore di ipofertilità che clinicamente può essere rilevata con il ritorno in estro della bovina (bovine repeat breeder) e la necessità di ripetute inseminazioni per ottenere la fecondazione 1. La maggior parte di queste perdite embrionali avviene fra il 12 ed il 18 giorno dopo l accoppiamento e rappresenta una causa importante (15-30%) dell insuccesso degli interventi fecondativi nella bovina da latte 2. È stato rilevato che le bovine soggette a perdita embrionale precoce generalmente presentano livelli più bassi di progesterone nel plasma e nel latte durante il periodo dal 10 al 16 giorno dopo l accoppiamento 3. Tale abbassamento determina l incremento dei fattori ad attività luteolitica endometriali, come le PG-F2α 4, e quindi facilmente in questi casi si assiste alla lisi del corpo luteo con conseguente perdita embrionale precoce e ritorno in estro della bovina. Il trattamento ormonale della bovina, in questa fase critica e precoce della gravidanza, può risultare quindi utile al fine di bloccare o limitare la luteolisi. Negli ultimi anni sono state effettuate diverse ricerche sperimentali atte ad identificare il trattamento ormonale più idoneo per ridurre il tasso di perdita embrionale precoce. La somministrazione, mediante singola iniezione, da effettuarsi nei giorni dopo l inseminazione, con 10 µg/capo/i.m. di buserelin (Receptal - Hoechst Roussel Vet), analogo sintetico dell ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH), si è dimostrata tra le tecniche più vantaggiose per tale indicazione. In risposta a tale trattamento, infatti, si ottiene un incremento del rilascio di gonadotropine che induce la rapida luteinizzazione dei follicoli ovarici in via di sviluppo. In questo modo si previene la secrezione di estrogeni e prostaglandine F2α e s induce la formazione di un corpo luteo accessorio che incrementa la produzione di progesterone in modo che l embrione abbia maggiori probabilità di sopravvivenza in questa fase delicata in cui non si è ancora del tutto sviluppato il meccanismo ormonale del riconoscimento madre-feto 5 (Fig. 1). In questo lavoro viene presentata una rassegna degli studi clinici riportati in letteratura, effettuati con la somministrazione di buserelin per la prevenzione della mortalità embrionale precoce nella specie bovina al fine di valutarne le diverse possibilità applicative. STUDI CLINICI IN CAMPO Bostedt e Okyere 6 in un esperienza condotta su 153 bovine repeat breeder (2-3 ritorno post-inseminazione) hanno trattato, secondo un criterio randomizzato, 69 animali con 20µg / capo/i.m. di buserelin al 12 giorno dopo l inseminazione, mentre 84 bovine di controllo venivano trattate con 5 ml/capo/i.m. di soluzione fisiologica. Dal punto di vista ormonale la determinazione del progesterone nel latte ha permesso di evidenziare che gli animali trattati con buserelin, e successivamente diagnosticati gravidi, presentavano un incremento significativo (p<0.01) della concentrazione di quest ormone dopo 6 ore dal trat- Il meccanismo d azione del GnRH-analogo somministrato gg post-inseminazione buserelin 10 µg Luteinizzazione dei follicoli secondari Stimolo alla produzione di LH/FSH Potenziamento del CL gravidico produzione progesterone ed inibizione estradiolo maggior produzione di progesterone Prevenzione della morte embrionale precoce FIGURA 1

3 Large Animals Review, Anno 4, n. 2, Giugno tamento, rispetto alle bovine di controllo. Inoltre dopo il trattamento con buserelin si rileva infatti un aumento significativo, per circa 6 ore, della concentrazione di LH nel plasma, confermando l effetto positivo del GnRH nell incrementare temporaneamente la concentrazione di progesterone in circolo mediante la liberazione di LH. In questa prova il trattamento effettuato al 12 giorno dopo l inseminazione ha incrementato sensibilmente la percentuale di gravidanze (+ 10%) rispetto al gruppo di bovine di controllo. Anche da quanto riportato in un altra ricerca 7 condotta in 10 diversi allevamenti si rileva nelle bovine trattate, con 10 µg/capo/i.m. di buserelin il 12 giorno dopo l inseminazione, un incremento statisticamente significativo di gravidanze al primo servizio (+ 12%). Inoltre, proseguendo lo studio nelle bovine non gravide e re-inseminate ai cicli successivi, si è evidenziato nel gruppo trattato, dopo ogni intervento fecondativo con GnRH analogo, una sensibile diminuzione di bovine vuote rispetto ai controlli (- 5%), una riduzione significativa del periodo parto-concepimento ( - 6 giorni) e la riduzione del numero medio di servizi/gravidanza (Tab. 1). La stessa somministrazione effettuata dopo 8-10 giorni dall inseminazione ha permesso di accertare che il periodo in cui effettuare il trattamento risulta fondamentale per ottenere risultati di efficacia clinica. Il trattamento precoce (8-10 giorno post-inseminazione) non avrebbe infatti alcun effetto sulla fertilità delle bovine (Tab. 2). Questi risultati sono stati confermati da MacMillan et al. 8 in un ampia ricerca in campo durata tre anni ed utilizzando un totale di 2525 bovine, provenienti da 36 allevamenti diversi, trattate con due diversi dosaggi di buserelin (5µg/capo/i.m. e 10µg/capo/i.m) e in periodi diversi (dal 1 al 13 giorno post-inseminazione). I risultati clinici ottenuti dimostrano un interazione significativa tra trattamento e periodo (p < 0,05) e un effetto correlato al dosaggio. Il trattamento con buserelin ha incrementato significativamente il tasso di concepimento quando effettuato nel periodo tra l 11 e il 13 giorno dopo l inseminazione ed al dosaggio di 10 µg/capo/i.m. In bovine sottoposte a modulazione dell attività ciclica ovarica con prostaglandine F2α, il trattamento con buserelin (10µg/capo/i.m.), al giorno dopo l inseminazione, ha determinato un significativo miglioramento (p < 0,01) del tasso di concepimento (60% vs. 44% rispettivamente per gli animali trattati e di controllo non trattati) ed il confronto tra animali trattati solo con buserelin e animali trattati con PGF2α e buserelin, ha evidenziato un incremento maggiore e significativo di bovine gravide nel gruppo inseminato dopo l induzione dell estro 9. Sheldon e Dobson 10 hanno effettuato una vasta sperimentazione su 1446 bovine divise in gruppi trattati-controlli omogenei per alimentazione, stabulazione, periodo del parto, età, provenienza del seme utilizzato nella F.A. e tecnico addetto all inseminazione artificiale. I risultati della sperimentazione rilevano che nelle bovine trattate con 10 µg/capo/i.m. di buserelin, 11 giorni dopo la prima inseminazione, si è registrato un significativo incremento del tasso di gravidanza rispetto ai controlli (60,0%; n = 520 nei trattati vs. 50,6%; n = 520 nei controlli; p < 0,01). Nello stesso studio sono state inoltre trattate 136 bovine dopo la 2 a inseminazione e 67 dopo il 3 servizio. Anche in questo caso negli animali trattati si sono evidenziate percentuali di gravidanze significativamente maggiori rispetto ai controlli (Tab. 3). Tabella 1 Parametri riproduttivi in bovine trattate al 12 giorno post-inseminazione con 10 µg/capo/i.m. di buserelin e bovine controllo Trattate Controlli N BOVINE TOTALI SERVIZIO N gravidanze (%) 210 * (65.4%) 172 (53.4%) N bovine vuote (%) 111 (34.6%) 150 (46.6%) SERVIZI RIPETUTI N bovine re-inseminate 109 (1) 150 N gravidanze (%) 92 (84.4%) 117 (78.0%) N TOTALE BOVINE GRAVIDE (% sul totale) (94.1%) (89.7%) N BOVINE VUOTE (% sul totale) (5.3%) (10.2%) N TOTALE SERVIZI RIPETUTI N MEDIO SERVIZI/GRAVIDANZE INTERVALLO MEDIO PARTO-CONCEPIMENTO (GG) 85.3 * 91.4 * vs controlli = statisticamente significativo (P<0.01) (1) = Due bovine sono state escluse dallo studio

4 54 Prevenzione della morte embrionale precoce nella bovina da latte Tabella 2 Parametri riproduttivi in bovine trattate ai giorni 8 e 10 post-inseminazione con 10 µg/capo/i.m. di buserelin e bovine controllo Trattate al gg. 8 Trattate al gg.10 Controlli N bovine N gravidanze al 1 servizio (%) (60.2) (60.1) (62.7) N servizi ripetuti N di gravidanze dopo inseminazioni ripetute (%) (56.8) (40.3) (39.5) N bovine vuote (%) (5.4) (10.2) (8.9) servizi/gravidanze Intervallo parto-concepimento (gg) Tabella 3 Percentuali di bovine gravide a seguito del trattamento con 10 µg/capo/i.m. di buserelin post-inseminazione e bovine controllo N bovine % di bovine gravide 11 giorno post-1 a inseminazione Trattamento con buserelin % * Controlli % 11 giorno post-2 a inseminazione Trattamento con buserelin % * Controlli % 11 giorno post-3 a inseminazione Trattamento con buserelin % ** Controlli % * = statisticamente significativo rispetto ai controlli per P<0.05 ** = statisticamente significativo rispetto ai controlli per P<0.001 CONCLUSIONI Le perdite embrionali durante la fase iniziale della gravidanza rappresentano senz altro un fattore di ipofertilità che clinicamente può essere rilevato con il ritorno in calore e la necessità di ripetute inseminazioni della bovina. La scarsa potenzialità luteinica del corpo luteo sembra essere una delle cause principali di questo fenomeno. Sulla scorta di quanto segnalato dai diversi Autori che si sono dedicati a questa ricerca emerge che il problema delle perdite precoci del prodotto del concepimento è presente e diffuso in molte realtà zootecniche. La sintesi derivata da questi studi, effettuati in campo su un numero complessivo di bovine, indica nella somministrazione di 10µg /capo/i.m. di buserelin, da effettuarsi nel periodo compreso tra l 11 e il 13 giorno dopo l inseminazione, un valido intervento per ottenere un miglioramento delle percentuali di concepimento nelle bovine da latte. Ogni gruppo di animali trattati ha evidenziato infatti un incremento della percentuale di gravidanze superiore al 10% rispetto ai gruppi non trattati. Particolarmente interessanti sono stati i risultati ottenuti nelle bovine repeat-breeder, dove il trattamento effettuato dopo il 2 o 3 intervento inseminativo ha migliorato la percentuale di concepimento di oltre il 20%. Questo intervento terapeutico è da ritenersi quindi utile come ausilio nella prevenzione della morte embrionale precoce, con relativo aumento della quota di concepimento degli animali trattati. È stato valutato sperimentalmente come il periodo in cui effettuare il trattamento possa essere determinante per il successo clinico alla terapia. Possibili insuccessi possono infatti rilevarsi qualora il trattamento ormonale venga effettuato troppo presto o troppo tardi in rapporto al riconoscimento materno della gravidanza. Fermo restando che vi sono molti fattori che possono influenzare le performance riproduttive delle bovine e la somministrazione di GnRH può influenzare solo una

5 Large Animals Review, Anno 4, n. 2, Giugno parte di questi fattori, riteniamo che l impiego di buserelin nei tempi e nelle modalità sopra riportate rappresenti un ausilio a disposizione dei buiatri per migliorare l efficienza riproduttiva negli allevamenti delle bovine da latte. Parole chiave Bovine, gravidanza, perdite embrionali precoci, GnRHanalogo. Key words Cows, pregnancy, early embryo loss, GnRH-analogue. Bibliografia 1. Matteuzzi A: Repeat Breeders. Atti Soc. It. Buiatria, Bormio (SO). XXV, 91, Chene N., Martal J.: Controllo dello sviluppo embrionale e riconoscimento materno della gestazione. Summa, 27-38, Lamming G.E., Darwash A.O., Back, H.L.: Corpus luteum function in dairy cows and embryo mortality. J. Reprod. Fert., 37, 245, Lamming G.E., Mann G.E.: Progesterone concentrations affects the development of the luteolytic mechanism in the cow. J. Reprod. Fert., Abst. Ser., 11, 9, Mann G.E., Lamming G.E.: Effects of progesterone and oestradiol on the responsiveness of endometrial oxytocin receptors in long term ovariectomised cattle. J. Reprod. Fert. Abstr. Ser., 65, 35, Bostedt H., Okyere K.: Auswirkung einer singulären GnRH-Injektion am 12. Tag postinseminationem auf periphere LH- und Progesteronkonzentration bei wiederholt besamten Kühen. Tierarztl. Umsch., 42, 421, Drew S.B., Peters A.R.: The effect of treatment with a gonadotrophinreleasing hormone analogue on the fertility of dairy cows. 12th Int. Congress of Anim. Reprod. The Hague, The Netherlands, MacMillan K.L., Taufa V.K., Day A.M.: Effects of an agonist of gonadotrophin releasing hormone (buserelin) in cattle. III Pregnancy rates after post-insemination injection during metoestrus or diestrus. Anim. Reprod. Sci., 11,1, Lajili H., Humblot P., Thibier M.: Effect of PGF2α treatment on conception rates of dairy cows treated with a GnRH agonist 12 to 14 days after artificial insemination. Theriog., 36, 335, Sheldon I.M., Dobson H: Effects of gonadotrophin releasing hormone administered 11 days after insemination on the pregnancy rates of cattle to first and later services. Vet. record, 133, 160, 1993.