CONTRATTILITA IN VITRO

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Giuseppa Mora
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1 Dipartimento dell Emergenza e dei trapianti d Organi CONTRATTILITA IN VITRO Dr. Mariagrazia PICCINNO

2 STUDI IN VITRO: Buona alternativa agli studi in vivo per saggiare gli effetti dei farmaci, ormoni o altre sostanze su particolari tipi di tessuto ed organo.

3 MOLTE VARIABILI Differenze interspecifiche; Organo composto da più strati; Differenze della contrattilità di base in funzione: TOPOGRAFICA FIBRE SELEZIONATE STATO ORMONALE STATO DI SALUTE

4 UTERO Organo cavo muscolo-membranoso Tonaca Sierosa o Perimetrio Tonaca Muscolare o Miometrio Tonaca Mucosa o Endometrio (Pelagalli e Botte, 2003)

5 TOPOGRAFICA nt estro nc

lungo della cellula I filamenti contrattili sono ancorati lungo i margini del sarcolemma

6 MIOMETRIO Formato da singole cellule di forma fusata (da 100 a 500 μm), contenenti le proteine contrattili actina e miosina disposte a formare fasci obliqui rispetto all asse lungo della cellula I filamenti contrattili sono ancorati lungo i margini del sarcolemma in zone costituite da materiale elettrondenso, i cosiddetti corpi densi (Camino e Antoniotti, 1992)

7 MIOMETRIO La disposizione delle fibrocellule permette di distinguere due strati: uno esterno, più sottile, con fibre disposte longitudinalmente uno interno, più spesso, in cui le fibre sono circolare disposte in maniera (Pelagalli e Botte, 2003)

8 FIBRE SELEZIONATE

9 STATO ORMONALE estro diestro

10 La sua bovina ha una temperatura di 104 gradi, il singhiozzo, una brutta tosse e la mastite. Ora le brutte notizie..

11 STATO DI SALUTE diestro

13 MIOMETRIO Muscolo liscio di tipo fasico, capace di contrazioni spontanee di origine miogenica Identificate cellule segnapassi (pacemaker), dette cellule interstiziali di Cajal, capaci di depolarizzazioni spontanee gli stimoli ormonali o neuronali non sono essenziali per l innesco del meccanismo contrattile, ma hanno più che altro un importante azione modulatrice (Duquette et al., 2005; Shmygol et al., 2006)

15 ELETTROFISIOLOGIA Come per tutte le cellule, la membrana plasmatica della fibrocellula muscolare uterina è dotata di permeabilità selettiva e di capacità di trasporto attivo per alcune sostanze DEPOLARIZZAZIONE

19 FOLLICOLO Le cellule muscolari lisce presenti a livello di teca esterna ne modulano la contrattilità; sono cellule fusiformi contenenti dei filamenti del diametro di A (forse fibroblasti modificati). Le ovaie dei mammiferi sono innervate da fibre di neuroni sensitivi simpatici del SNP e da un piccolo numero di fibre parasimpatiche. Nella bovina l innervazione adrenergica è molto sviluppata rispetto ad altre specie animali, essa si intensifica nel corso dello sviluppo follicolare, e raggiunge il massimo al momento dell ovulazione. (Espey, 1978; Morimoto et al., 1981)

20 NE Stimolazione E ++ NE Recettori 1 -adrenergici PLC DAG IP3 PKC Contrattilità parete follicolare Recettori β 2 -adrenergici camp Adenilato ciclasi PKA Rilassamento muscolatura liscia del follicolo (Walles et al., 1982). (Di Giovanni et al., 1992).

Un alterata funzione del sistema simpatico a livello ovarico può costituire un importante elemento eziopatogenetico in corso di cisti follicolari.

22 Un alterata funzione del sistema simpatico a livello ovarico può costituire un importante elemento eziopatogenetico in corso di cisti follicolari. Il carazololo (βbloccante) (1x10-6 M) ha determinato un aumento dell ampiezza delle onde di contrazione spontanea in strips di cisti follicolari. (Cosola et al., 2005). Fig.3 Tracciato meccanografico: è visibile l effetto del carazololo (1x 10-6 M ) su tono spontaneo in strips di parete di cisti follicolari persistenti (30 mm. di diametro, P4 <1 ng./ml).

23 Anche le sostanze ormonali, implicate nel processo dell ovulazione, possono modulare la contrattilità follicolare. OSSITOCINA PROSTAGLANDINE ORMONI STEROIDEI GnRH

24 OVAIO Sparus aurata

25 VITELLOGENESI QUIESCENZA ATRESIA ESTESA

26 RISULTATI Effetto dell isotocina sull ampiezza di contrazione della tunica albuginea di orata in vitellogenesi, quiescenza e atresia estesa. In riga: c,d: p < In colonna: A,B: p < 0.05; B,C: p < 0.001; D,E: p < 0.01.

27 RISULTATI Effetto dell isotocina sulla frequenza di contrazione della tunica albuginea di orata in vitellogenesi, quiescenza e atresia estesa. In riga: a,b: p < 0.05; c,d: p < In colonna: A,B: p < 0.05; B,C: p < 0.001; D,E: p < 0.01.

28 La somministrazione di isotocina (30 mcg/ml) determina un aumento dell ampiezza di contrazione negli animali in vitellogenesi; effetti s.s. sulla ampiezza di contrazione sono stati registrati per questo gruppo anche dopo la somministrazione della dose successiva (60 mcg/ml). Negli animali in vitellogenesi è stata, inoltre, osservata una riduzione dose-dipendente s.s. della frequenza contrattile; riduzione che si è presentata anche negli animali in quiescenza dopo la somministrazione di 60 mcg/ml.

DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Questi risultati sembrano confermare il coinvolgimento di questo peptide nello stimolare e aumentare l attività contrattile della tunica albuginea in vitellogenesi.

29 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Questi risultati sembrano confermare il coinvolgimento di questo peptide nello stimolare e aumentare l attività contrattile della tunica albuginea in vitellogenesi. L assenza di effetti s.s. negli animali in quiescenza potrebbe essere attribuito alla presenza di diversi meccanismi deputati al controllo della contrattilità e, in particolar modo, all elevata attività contrattile di questa fase. L assenza di recettori per l isotocina potrebbe spiegare la mancanza di effetti nelle ovaie caratterizzate da vasta atresia follicolare; la saturazione degli stessi recettori potrebbe essere responsabile della mancanza di un ulteriore aumento della contrattilità ovarica dopo la somministrazione di 60 mcg/ml, in vitellogenesi.

30 Le sperimentazioni di tipo farmacologico possono essere principalmente di due tipi: 1. DESCRITTIVE: valutano la contrattilità di base e/o se l utero è responsivo ad una determinata sostanza; 2. QUANTITATIVO: descrive numericamente il grado di responsività (calcolando, ad esempio la DE50, la Dmax e l area sotto la curva).

e termostatata a 37 C Collegati mediante filo di seta dall estremità

31 MISURE TENSIOMETRICHE: analisi della motilità in vitro Strips di muscolatura liscia in apposite cuvette di vetro contenenti soluzione di Krebs ossigenata e termostatata a 37 C Collegati mediante filo di seta dall estremità inferiore alla base della cuvetta e dall estremità superiore ad un trasduttore isometrico

34 MISURE TENSIOMETRICHE: analisi della motilità in vitro Bagni termostatati e trasduttori isometrici Variazione di tensione meccanica espressa come STRESS STRESS gpeso 9,8 3 mn l cm 1,056 g cm o massastrips g gpeso l o 10,35 massastrips mn/cm 2

35 TEST DI MOTILITÀ IN VITRO Stabilizzazione di 1h Trazione fissa Stimolazione con Carbacolo (CAR) 10-4 M Risposta contrattile Stimolazione ripetuta dopo 30 Risposta ripetibile PROTOCOLLI SPERIMENTALI

37 2. Contrattilità evocata elettricamente Stimolazione elettrica di campo Elettrodi a campo Stimolatore

38 2. Contrattilità evocata elettricamente FREQUENZA AMPIEZZA INTENSITA 0,1 10 Hz 0,3 ms 571 ma Tracciato delle contrazioni evocate elettricamente in strips di colon umano, rilevate in condizioni isometriche ed espresse in grammi-peso.

39 GRAZIE PER L ATTENZIONE

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