Tra scienza e innovazione, i lieviti enologici oggi

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1 Lieviti enologici al microscopio elettronico (foto gentilmente concessa da Lallemand). FOCUS CANTINA LIEVITI NON SACCHAROMYCES, LE TAPPE DELLA RICERCA La ricerca portata avanti da numerosi istituti italiani e stranieri ha permesso di descrivere le performance qualitative di molti lieviti non Saccharomyces e di studiare la variabilità esistente tra i diversi ceppi di una stessa specie. Avendo quindi verificato le proprietà che alcune di queste specie sono in grado di apportare al vino e selezionato i ceppi di maggior interesse, è stato necessario valutare le possibili modalità d uso di questi microrganismi, la carica con la quale essi debbano essere inoculati in rapporto a quella di Saccharomyces cerevisiae, il momento di inoculo, contemporaneo o sequenziale, e la sensibilità ai diversi fattori della vinificazione come la temperatura e la presenza di anidride solforosa (Domizio et al., 2011). Tra scienza e innovazione, i lieviti enologici oggi ALESSANDRA BIONDI BARTOLINI Consulente R&S (Pescia, PT) Dalle fermentazioni miste con ceppi selezionati di lieviti non Saccharomyces, ai ceppi di Saccharomyces cerevisiae migliorati grazie alle nuove tecniche messe a disposizione dalla genomica, le aziende del biotech enologico seguono da vicino il mondo della scienza, mettendo a disposizione prodotti sempre più sicuri e specifici per ogni tipo di applicazione e stile enologico, nel rispetto della tipicità e della biodiversità. terizzare con ceppi autoctoni i territori di provenienza. Alcuni studi recenti, nonché l esperienza dei produttori interessati alle fermentazioni spontanee, hanno portato alla constatazione che l uso di un unica specie, sebbene in grado di dare sicurezza e pieno controllo del processo fermentativo, potrebbe comportare un impoveri- Nel rispetto della biodiversità: non solo Saccharomyces Negli ultimi decenni la ricerca e l industria hanno concentrato i loro sforzi nella selezione di numerosi ceppi di Saccharomyces cerevisiae con caratteristiche tecnologiche e qualitative molto diverse, rispondendo in molti casi anche all esigenza di caratmento nella complessità dei vini rispetto a quanto avviene per effetto delle popolazioni miste naturalmente presenti nei mosti. L attenzione si è quindi rivolta allo studio delle proprietà delle numerose specie di lieviti di generi diversi presenti nei mosti, detti nel loro complesso lieviti non Saccharomyces, con lo scopo di isolare i ceppi più interessanti per poter riprodurre nelle fermentazioni enologiche quanto avviene in natura, senza per questo assumersi i rischi connessi alla mancanza di gestione dei processi biologici di una fermentazione spontanea. Molti lieviti non Saccharomyces sono dotati di attività enzimatiche, come le glicosidasi, superiori e più attive di quelle presenti in cerevisiae, in grado di liberare gli aromi, terpeni e norisoprenoidi, presenti nelle bucce e nei mosti. 20

2 Torulaspora e Amarone Per limitarci alle esperienze svolte nel nostro Paese, un lavoro del Centro per la Sperimentazione in Vitivinicoltura della Provincia di Verona e del Dipartimento di Biotecnologie dell Università di Verona (Azzolini et al., 2012) ha valutato la possibilità di utilizzo e le modalità di inoculo di un ceppo di Torulaspora delbruekii nella fermentazione di uve Amarone. I risultati hanno dimostrato come Torulaspora sia in grado, soprattutto nelle prove effettuate con inoculo sequenziale, di colonizzare il mosto anche a gradazioni alcoliche particolarmente elevate, come quelle sviluppate nelle fermentazioni dell Amarone. I risultati aromatici hanno evidenziato come nelle fermentazioni miste siano molti i composti aromatici sviluppati in modo significativamente diverso, a vantaggio di una maggiore intensità e complessità dei vini ottenuti con l inoculo sequenziale. Specie Candida zemplinina Candida stellata Metschnikowia, liberazione degli aromi e tenore alcolico Un altro lievito, Metschnikowia pulcherrima, produce alfa arabinofuranosidasi, enzima che in combinazione con la beta D glicosidasi libera gli aromi glicosidati, rendendoli percepibili olfattivamente e incrementando così l intensità e la complessità aromatica dei vini. Il ceppo MP346 di questo lievito è stato isolato dall Università di Santiago del Cile per la fermentazione di mosti bianchi e rosati e la liberazione di aromi terpenici e tiolici. Il lievito, il cui nome commerciale è Flavia, è prodotto in forma di lievito secco attivo (avendo superato anche le prove di essiccabilità) da Lallemand e distribuito in Italia da Dal Cin. Utilizzato in combinazione con specifici ceppi di Saccharomyces cereviasiae, come Rhone 4600 e Rhone 2056, Flavia favorisce l espressione varietale dei vini bianchi e rosati, spiega Arianna Volpini di Dal Cin. In particolare, le attività enzimatiche proprie di questo lievito permettono la liberazione dei terpeni (linalolo e geraniolo) presenti in forma di precursori inodori nel mosto. In vini Sauvignon blanc è stata rilevata inoltre una maggiore liberazione di 4 metil 4 mercapto 2 pentanone (4MMP) e 3-mercaptoesanolo (3MH), molecole tioliche dai descrittori tipici di bosso, ginestra, pompelmo e frutto della passione. I NON SACCHAROMYCES IN ENOLOGIA Proprietà enologiche/ obiettivo dell'uso in coltura mista o con inoculo sequenziale con Saccharomyces cerevisiae Fruttosofilo, consumo acido acetico, fermentazione vini dolci; basse rese in etanolo; elevata produzione di glicerolo Incremento del contenuto in glicerolo (cellule immobilizzate); incemento della componente aromatica In un altra ricerca svolta da un gruppo di ricercatori australiani e spagnoli (Contreras et al., 2013) l inoculo sequenziale di un ceppo selezionato di Metschnikowia pulcherrima con un ceppo di Saccharomyces cerevisiae ha permesso di ridurre la resa in etanolo, producendo vini con un contenuto finale in alcol significativamente diverso da quello ottenuto con altri lieviti Saccharomyces e non Saccharomyces. Candida, alcol e glicerolo Anche Candida zemplilina presenta aspetti interessanti relativamente alla possibilità di produrre fermentazioni con minori rese in alcol ed elevate quantità di glicerolo. Ceppi selezionati di questo lievito sono stati testati, in modo indipendente, dai ricercatori dell Università di Sassari (Zara et al., 2012) e dall Istituto Regionale del Vino e dell Olio della Sicilia (Ponticello et al., 2013). I risultati dei due studi hanno messo in evidenza che la riduzione della resa in alcol è un carattere influenzato dal ceppo di Candida utilizzato, mentre il carattere legato all arricchimento in glicerolo si presenta in modo ripetibile nei ceppi diversi della stessa specie. Riferimento in letteratura scientifica Ransiou K, et al, 2012; Comitini et al., 2101; Ponticello et al., 2013; Zara et al., 2012 Ciani e Ferrro, 1996; Ciani e Ferraro, 1998; Ferraro et al., 2000; Soden et al., 2000 Kluiveromyces thermotolerans Riduzione acido acetico, incremento acidità totale KapsopoulouK et al., 2005; Ciani et al., 2006 Kluyveromyces wickerhamii e Wicheranomyces anomalus (Pichia anomala) Metschnikowia pulcherrima Produzione di tossine anti-brett Produzione di polisaccaridi; riduzione di acidità volatile; liberazione di aromi glicosidati; riduzione resa in etanolo Comitini et al. 2004; De Ingeniis et al., 2009; Comitini e Ciani, 2011 Ganga et al., 2012; Comitini et al. 2011; Contreras et al., 2013 Pichia Klyverii Liberazione aromi tiolici da precursori aromatici in SB Anfang et al., 2009 Schizosaccharomyces pombe Torulaspora delbrueckii Degradazione acido malico; produzione acido acetico e off flavour Riduzione di acido acetico, produzione composti aromatici positivi; incremento contenuto in glicerolo Ciani et al., 1995; Silva et al., 2003; Benito et al., 2012 Ciani et al., 2006; Bely et al., 2008; Comitini et al., 2011; Azzolini et al., 2012 Proprietà di alcuni lieviti non Saccharomyces di interesse enologico, testati in fermentazioni miste o sequenziali con Saccharomyces cerevisiae (e in alcuni casi in forma di cellule immobilizzate). I riferimenti bibliografici, così come la lista delle specie di interesse enologico, non intendono essere esaustive e fornire una bibliografia completa sull argomento. 21

3 FOCUS CANTINA LIEVITI Kluyveromyces, Wicheranomyces e il controllo del Brett Dalla ricerca svolta da Maurizio Ciani e dai suoi collaboratori dell Università Politecnica delle Marche (Comitini et al. 2004; De Ingeniis et al., 2009; Comitini e Ciani, 2011) è emersa la capacità di alcuni ceppi Kluyveromyces wickerhamii e di Wicheranomyces anomalus (o Pichia anomala) di produrre una tossina di natura proteica chiamata KWKT in grado di controllare la crescita e l attività metabolica del lievito contaminante Brettanomyces bruxellensis, aprendo di fatto uno spiraglio su una possibile lotta biologica nei confronti di questo organismo dannoso per la qualità dei vini. I nuovi ceppi con proprietà anti-brett sono stati poi moltiplicati e testati in fermentazioni pure o in associazione tra loro e con Saccharomyces e vengono prodotti e distribuiti con il nome commerciale di BrettOut K e BrettOut W in forma di lievito fresco attivo dalla società emiliana SG Biotech, che propone nella sua gamma anche altri lieviti non Saccharomyces: I risultati migliori nelle prove effettuate si sono avuti utilizzando in associazione i due lieviti con capacità inibente nei confronti di Brettanomyces, nel rapporto di una parte di Kluyveromyces wickerhami e 3 parti di Wicheranomyces anomalus, e inoculando nelle successive ore il ceppo di Saccharomyces cereviasiae che completerà la fermentazione alcolica, spiega Marcello Galetti di SG Biotech. Pichia e gli aromi fruttati Ai ceppi selezionati di Torulaspora delbruekii, in grado di dare caratteristiche interessanti a livello aromatico, e di Kluiveromyes thermotolerans, grazie al cui metabolismo si possono avere incrementi anche considerevoli dell acidità dei mosti, proposti già da qualche anno dalla danese Christian Hansen, distribuita in esclusiva in Italia da Enologica Vason, si aggiunge quest anno un ceppo di Pichia kluyveri particolarmente efficiente nella liberazione di aromi fruttati a partire dai precursori presenti nell uva, che viene fornito in forma congelata e adatta all inoculo diretto. Il miglioramento genetico di S. Cerevisiae I QTL Le tecniche di mappatura genetica dei caratteri quantitativi (QTL) sono state utilizzate nelle fasi preliminari dello screening sulla selezione massale realizzata nel 2009 da diverse fermentazioni spontanee in Borgogna, che ha portato i ricercatori di Laffort che operano presso l ISVV dell Università di Bordeaux a selezionare il nuovo ceppo Zymaflore CH9. Come è stato dimostrato nelle prove comparative su scala industriale svolte nelle stagioni successive alla sua selezione in entrambi gli emisferi dice Antonio Grazietti di Laffort Italia il ceppo Zymaflore CH9 presenta una breve fase di latenza, una Vmax non eccessivamente elevata (velocità massima di fermentazione correlabile in condizioni di stress al rischio di arresto fermentativo, ndr) e una cinetica rapida e decisa in tutte le condizioni. Il nuovo ceppo è adatto alla fermentazione di mosti da uve Chardonnay, dei quali esalta le note di mandorla, nocciola fresca e pane tostato ed esprime vini caratterizzati da grande rotondità e grassezza. Reidratazione di un lievito secco attivo. L ibridazione intraspecifica Oltre alla selezione massale, che identifica e seleziona da una popolazione naturale gli individui con i caratteri più interessanti dal punto di vista enologico, le tecniche di miglioramento genetico dei microrganismi, similmente a quanto avviene per le specie vegetali, prevedono anche l ibridazione intra e interspecifica e la tecnica del DNA ricombinante (quest ultima applicata per ottenere i cosiddetti microrganismi transgenici o OGM, attualmente non commercializzati in Europa). Le tecniche di ibridazione consistono nel riprodurre fenomeni di incrocio che avvengono anche spontaneamente in natura, essendo il lievito un organismo in grado di riprodursi per via sessuata. I ceppi che se ne ottengono non sono microrga- 22

4 DAL SEQUENZIAMENTO ALLA SELEZIONE Lo studio della genomica e delle sue applicazioni (Saccharomyces cerevisiae è stato il primo eucariote il cui genoma sia stato sequenziato, nel 1996) ha permesso di identificare cromosomi e geni nei quali vengono codificati i caratteri responsabili dei fenotipi più interessanti dal punto di vista enologico. Diversi sono stati negli ultimi anni i casi in cui queste acquisizioni hanno trovato applicazione nello sviluppo di nuovi prodotti, rendendo più selettivo e rapido lo studio delle popolazioni e della loro variabilità. nismi geneticamente modificati. Un applicazione è quella realizzata nella collaborazione tra SupAgro, INRA di Montpellier, ICV (Institute Cooperative du vin) e Lallemand per ottenere il ceppo Lalvin ICV OKAY. Nella selezione di ICV OKAY le tecniche di selezione classiche sono state combinate con la mappatura QTL (Quantitaive Trait Locus), tecnica che permette di identificare le regioni del genoma correlate con l espressione dei caratteri quantitativi, spiega Francesco Loparo di Lallemand Italia. I ricercatori dell INRA hanno trasferito i geni responsabili della bassa produzione di H 2 S, SO 2 e acetaldeide da un ceppo donatore ad un altro ceppo molto robusto e dotato di buone capacità fermentative. Una serie di reincroci con quest ultimo ha permesso di recuperare la maggior parte del genotipo parentale, rendendo il nuovo ceppo migliorato diverso solo per i caratteri desiderati introdotti. OKAY è una perfetta sintesi che combina eccellenti capacità fermentative con una ridottissima produzione di SO 2, H 2 S e acetaldeide. Queste caratteristiche permettono di avere una maggiore frazione di solforosa presente nella sua forma libera e attiva, riducendo nel contempo il rischio di aromi solforati. Inoltre la bassa produzione di solforosa rende questo lievito particolarmente compatibile con la fermentazione malolattica, spiega ancora Loparo. Grazie alla collaborazione con i genetisti dell Università di Bordeaux, la società francese Lamothe Abiet propone già da diversi anni una ricca gamma di lieviti ottenuti da ibridazione, alla quale si aggiunge per la prossima vendemmia un nuovo ceppo adatto per i vini rossi: Il nuovo ceppo MK14 è stato sviluppato usando la tecnica dell incrocio per migliorare un ceppo già leader di mercato per la produzione dei vini rossi, spiega Ada Ciarla, responsabile per l Italia dell azienda francese. Il risultato è stato un ceppo con le ottime capacità fermentative già presenti in quello di partenza, combinate ad una bassissima produzione di acidità volatile, acidi grassi a catena media e anidride solforosa, anche in condizioni di elevate gradazioni alcoliche. MK4 accentua le note fruttate ed è in grado di apportare freschezza alle vendemmie più mature e concentrate. Inoltre è in grado di integrare la struttura tannica dando volume e lunghezza in bocca. P2 L IBRIDAZIONE TRA LIEVITI La figura qui di fianco (da Berlese-Noble et al., 2014; Blondin, 2013; modificata) mostra il procedimento adottato per ibridare due ceppi parentali di ibridi e i successivi cicli di reincrocio (backcrossing) per il recupero del genoma di uno dei due ceppi dopo il trasferimento assistito da marcatori molecolari di uno o più caratteri.

5 FOCUS CANTINA LIEVITI L ibridazione interspecifica Anche l ibridazione tra specie diverse del genere Saccharomyces è una tecnica di miglioramento utilizzata per ottenere ceppi con caratteristiche intermedie o che combinano caratteri interessanti presenti nei due ceppi parentali. L Istituto Sudafricano di Stellenbosch ha ottenuto con questa tecnica il primo ibrido interspecifico tra Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces paradoxus, una specie presente nelle fermentazioni spontanee. Il nuovo lievito ibrido, prodotto e distribuito da Anchor con il nome di Exotic SPH, è in grado di degradare parzialmente l acido malico, favorendo l avvio della fermentazione malolattica e produrre alte quantità di glicerolo. Saccharomyces paradoxus spiega Enrico d Andrea di Enologica Vason, distributrice esclusiva di Anchor in Italia è isolabile da diverse specie di quercia in Europa ma sembra sia spesso presente anche nei vigneti croati. I ricercatori che ne hanno valutato le performance in vinificazione hanno ottenuto buone cinetiche fermentative e vini con piacevoli profili aromatici. Inoltre Paradoxus possiede due tratti genetici non comuni a S. cerevisiae che possono risultare utili nel processo di vinificazione: l attività pectolitica e la capacità demalicante, che sono state entrambe trasferite nel nuovo ibrido Exotic SPH. I lieviti specifici per il Sauvignon blanc La peculiarità del profilo aromatico di Sauvignon blanc, caratterizzato da composti di natura tiolica come il 3 MH (mercaptoesan- 1-olo) con aroma di pompelmo, il 4MMP (4 mercapto-4 metil pentan one) con aroma di ribes nero, bosso o ginestra e il 4 MHA (4 mercaptoesil acetato) con aroma di frutto della passione, pone da anni le strutture di ricerca impegnate nella selezione e nel miglioramento dei lieviti di fronte alla necessità di individuare ceppi in grado di trasformare efficacemente i precursori aromatici presenti nelle uve. L Università di Aukland in Nuova Zelanda, regione leader nella produzione di Sauvignon blanc di qualità con una marcata caratterizzazione aromatica, ha sviluppato con la tecnica dell ibridazione un nuovo ceppo di lievito, UOA Maxithiol, prodotto e commercializzato da Maurivin, distribuita in Italia da Tebaldi Srl. Le diverse generazioni del programma di ibridazione sono state sottoposte ad una selezione sulla base della capacità di fermentare a basse temperature in condizioni di scarse disponibilità nutritive e in presenza di solfiti, racconta Nir Levav di Tebaldi. Da questo pool di nuovi ibridi è stato selezionato un nuovo ceppo di lievito in grado di fermentare vigorosamente a basse temperature e di produrre vini con aromi intensi e altamente fruttati. Per aumentare la produzione di aromi è stata applicata a questo ceppo una procedura standard di reincrocio per introdurre geni alla base di caratteri supplementari, come la capacità di produrre importanti quantità di 3MHA, oltre a quelle degli altri composti tiolici varietali, e il carattere POF negativo (Phenolic Off Flavour) che lo rende incapace di produrre aromi fenolici sgradevoli. Una soluzione diversa è quella identificata da Perdomini IOC che, allo scopo di garantire la massima espressione degli aromi tiolici del Sauvignon, punta non solo su un lievito adatto alla trasformazione dei precursori dell uva, ma anche su una strategia nutrizionale adatta alla loro rivelazione e conservazione. Il kit ImpackThiols spiega Davide Berti della ditta di San Martino Buon Albergo (VR) è composto da un lievito, IOC Révélation Thiols, adatto ad esprimere il suo potenziale e quello delle uve Sauvignon, e da Prothiols, composto da nutrienti e antiossidanti, che stimola la rivelazione dei tioli e la produzione di glutatione tipica del lievito associato. L impianto In-Line Ready (Oenobrands-Silverstone) per l aggiunta diretta di lieviti senza reidratazione. La facilità d uso Un altro fronte di innovazione per i prodotti biotecnologici per l enologia è quello re- 24

6 UN LIEVITO PER RISOLVERE IL PROBLEMA DELL OCRATOSSINA Quello di rendere i vini sempre più sani e genuini è uno degli obiettivi principali della ricerca enologica recente. Molte sono le proprietà adsorbenti e detossificanti messe in evidenza in Saccharomyces e non Saccharomyces, ma sino ad oggi nessuna soluzione è stata trovata per la riduzione per via biologica dell ocratossina. Una ricerca a questo riguardo è in corso presso la Chaplin School of Hospitality and Turism Management della Florida International University e ha lo scopo di sviluppare un lievito geneticamente ingegnerizzato in grado di consumare l ocratossina dei mosti. Il professor Aron Welch ha recentemente vinto un grant federale della National Science Foundation (i finanziamenti pubblici destinati, sulla base del merito e dell importanza della ricerca svolta, ai diversi ricercatori negli USA) per completare le sue ricerche e confida nella possibilità di disporre del nuovo lievito, che sarà sottoposto a brevetto, in meno di un anno. lativo al processo di produzione e alla forma di lieviti e attivanti. In alcuni casi è stato modificato il processo di produzione dei lieviti secchi attivi per proporre prodotti caratterizzati da una maggiore facilità d uso. Facilitare la reidratazione I prodotti E2U (Easy To Use) dei lieviti in forma secca proposti da Springer Oenologie, distribuita in Italia da HTS Enologia, possono essere utilizzati in mosto senza reidratazione o essere reidratati a temperature basse, con acqua a 17-24, più facilmente disponibile in cantina: Easy To Use è il nuovo concetto proposto da Springer Oenologie, un innovativo approccio all enologia che consente di semplificare e velocizzare alcune operazioni di cantina per averne un diretto vantaggio tecnico, pratico ed economico, dice Diego De Filippi di HTS Enologia. Questa innovazione si concretizza con la proposta di nuovi prodotti e strumenti Easy to Use E2U, cioè facili da usare, primi fra i quali il nuovo ceppo di lievito secco attivo SC 22 Easy to Use E2U e il preparato di scorze di lievito in forma liquida ViniLiquid. Aggiungere in linea Oenobrands e Silverston (leader mondiale nella miscelazione solido-liquido) hanno invece sviluppato la tecnologia brevettata In-Line Ready nella quale i lieviti, prodotti in modo adatto ad essere utilizzati direttamente e senza reidratazione, vengono dispersi dal dispositivo di miscelazione solido-liquido e aggiunti in pochi secondi direttamente, in modo omogeneo e nelle giuste condizioni fisiologiche nel serbatoio di fermentazione, indipendentemente dalle sue dimensioni. I ceppi prodotti con tecnologia In-Line Ready sono attualmente cinque tra quelli disponibili nella gamma Fermicru e Fermivin ma l obiettivo è quello di estendere la proposta di ceppi adatti a questa tecnologia a tutta la gamma di ceppi Fermicru e Anchor, spiega Donatella Petegolli di Oenobrands. Liquidi o in crema I lieviti in forma fresca, liquidi o in crema, da utilizzare aggiungendoli direttamente al mosto, non sottopongono le cellule allo stress della disidratazione e non richiedono una fase di reidratazione, che rappresenta un punto critico nella preparazione e nell uso dei lieviti selezionati. Un vantaggio consiste inoltre nella possibilità di riprodurre anche ceppi che, per quanto interessanti da punto di vista enologico, nei lavori di selezione vengono scartati perché non resistenti al processo di essiccazione. La shelf life di poche settimane e la necessità di mantenere la catena del freddo nel corso dei trasporti e della conservazione in cantina sono gli aspetti che limitano la diffusione di questo tipo di prodotto tecnologicamente molto valido e che negli ultimi anni ha trovato conferme nella letteratura scientifica (Maqueda et al. 2011) e in Starter freschi in forma liquida (foto SG Biotech). alcune piccole realtà produttive, come la già citata SG Biotech e la veneta Bioenologia 2.0 di Oderzo (TV). I lieviti in crema sono già attivi e questa caratteristica consente di eliminare il processo di reidratazione, spiega Chiara Beraldo di Bioenologia 2.0. Inoltre, hanno la caratteristica di regolare il ph, aumentando naturalmente l acidità totale ed evidenziando un azione sinergica all aggiunta dell acido tartarico, e sono forti produttori di sostanze antiossidanti, proprietà che prolungano l integrità organolettica del vino nel corso del tempo di stoccaggio e conservazione, in modo assolutamente naturale. n RIPRODUZIONE RISERVATA 25