Non Invasive Prenatal Test

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Filippa Gasparini
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1 Analisi citogenetica dei cromosomi fetali mediante prelievo invasivo Screening non invasivo delle aneuploidie ddddd cromosomiche mediante test combinato Metodiche convenzionali per lo screening e la diagnosi delle anomalie cromosomiche Analisi ad alta risoluzione (arraycgh) dei cromosomi fetali mediante prelievo invasivo Screening non invasivo delle aneuploidie cromosomiche sul DNA libero del plasma materno Metodiche di recente implementazione per lo screening e la diagnosi delle anomalie cromosomiche Analisi non invasiva dell'intero genoma fetale su DNA libero del plasma materno Prospettive future nella diagnosi prenatale

Lancet. 1997 Aug 16;350(9076):485-7. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS.

2 Lancet Aug 16;350(9076): Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS. Nuffield Department of Clinical Biochemistry, John Radcliffe Hospital, University of Oxford, UK. Tipizzazione dello stato RhD fetale nel DNA fetale libero estratto dal plasma di donne in gravidanza RhD negative. Origine del cffdna

3 Il materiale che si analizza: cfdna È composto da DNA FETALE e da DNA MATERNO (cffdna + cfmdna) Quindi nell analisi è molto importante la frazione fetale (FF) FF = cffdna/cfdna A cominciare dalla 10a settimana è mediamente la FF raggiunge un valore adatto al test (8-10%)

4 400/800 bp Sequenziamento Sanger 100/200 bp Sequenziamento Massivo ad alto Parallelismo (MPS) x150 x220 x170 x120 x155 x210 x140 x180 x160 x145 x155 x170 x200 x210 x145

5 Due metodi di sequenza del cfdna utilizzati nella NIPT Sequenza a livello dell intero genoma (Random Sequencing) Sequenza di regioni polimorfiche di specifici cromosomi (Targeted Seq) Conta dei frammenti originati da ogni cromosoma. Si determina la proporzione dei frammenti derivati dal crom. 21 rispetto ai frammenti degli altri cromosomi In presenza di T21 la proporzione dei frammenti cromosoma 21 sarà aumentata. Selezione di frammenti polimorfici (SNPs) localizzati su cromosomi selezionati e successiva sequenza. Vengono calcolati i rapporti fra le sequenze polimorfiche sul cromosoma 21 e paragonate a simili rapporti calcolati su altri cromosomi. In presenza di T21 il rapporto fra le sequenze polimorfiche del cromosoma 21 sarà alterato rispetto a gli altri cromosomi euploidi.

6 FRAZIONE FETALE Deve essere superiore al 4% Attualmente non esiste un metodo standardizzato per la determinazione della FF Sono utilizzati 4 diversi approcci e non ci sono studi di comparazione fra i diversi metodi misura di frammenti Y specifici (valido solo nel 50% delle gravidanze) studio della metilazione (il DNA materno è meno metilato del fetale) misura dei rapporti fra frammenti polimorfici di origine paterna rispetto a quelli materni frazionamento in base alla lunghezza dei frammenti (quelli di origine fetale sono più corti)

7 FRAZIONE FETALE Descritti alcuni Falsi Negativi che presentavano una buona FF, possibili cause: mosaicismo placentare gemello morto in utero (vanishing twin) E stato stimato che il 2% dei campioni prelevati oltre le 10 settimane di gestazione contiene una FF al di sotto della soglia critica del 4%

8 Sensibilità e Specificità DR (sensibilità) FPR (specificità) T21 99,2% 0,09% T18 96,3% 0,13% T13 91,5% 0,13% 45,X 90,3% 0,23%

9 Condizioni attualmente comprese nel cfdna test Comuni aneuploidie autosomiche Trisomia 21 Trisomia 18 Trisomia 13 Aneuploidie dei cromosomi sessuali 45,X 47,XXX 47,XXY 47,XYY Sindromi da microdelezione/microduplicazione: Delezione 1p36 S. di Jacobsen (11q) S. di Wolf-Hirchhorn (4p) S. di Prader-Willi e Angelman (15q) S. del Cri du chat (5p) S. di DiGeorge (22q) S. di Langer-Giedion (8q24)

10 CAUSE DI FALSI POSITIVI Condizioni materne o trattamenti che compromettono la qualità del cfdna Deficienza vit B12 Malattie autoimmuni Colestasi intraepatica Tumori Aneuploidie cromosomi sessuali o autosomiche in mosaico (marker) Mosaicismo Confinato alla Placenta Morte di gemello in utero

11 CAUSE DI FALSI NEGATIVI Bassa Frazione Fetale (< 4%) Obesità materna Gravidanza gemellare (FF bassa per singolo feto) Condizioni materne o trattamenti che compromettono la qualità del cfdna Deficienza vit B12 Malattie autoimmuni Colestasi intraepatica Aneuploidie cromosomi sessuali o autosomiche in mosaico (marker) Triploidie Mosaicismi Feto/Placenta

12 Modelli di implementazione: TEST PRIMARIO Da proporre a tutte le donne in gravidanza in sostituzione degli attuali screening La sensibilità e specificità del test permetterebbe di aumentare il numero di feti con trisomia 13, 18, 21 correttamente individuati, riducendo i FP ed i FN e le diagnosi invasive. Necessità di mantenere ecografia del I trimestre (NT) per non ridurre l efficienza diagnostica.

13 Modelli di implementazione: TEST CONTINGENTE Utilizzato come test di screening secondario, opzionale prima di accedere alla diagnosi invasiva, qualora il test combinato sia risultato a rischio aumentato. In questo caso rimarrebbe inalterato il tasso di FN (feti non individuati dallo screening combinato, 5-10%). Il tasso di FP si ridurrebbe significativamente e quindi il numero delle procedure invasive e diversi studi hanno dimostrato che tale approccio risulta economicamente vantaggioso. Con la scelta ottimale dei cut-off all interno dei quali offrire il test NIPT si potrebbe minimizzare i FN allargando l offerta del test NIPT alle donne che abbiano ottenuto un risultato al test combinato con rischio intermedio (tra 1:100 e 1:1500)

14 LA NIPT NON È RACCOMANDATA NEI CASI DI: Anomalie ecografiche fetali Gravidanze multiple Vanishing twin Mosaicismi cromosomici presenti nella madre che coinvolgono i cromosomi soggetti ad indagine Gestante nota per essere affetta da tumore Trapianto allogenico d organo Immunoterapia, radioterapia, emotrasfusione eseguita entro i 3 mesi precedenti

15 Punti chiave da considerare nella consulenza pretest Chiarire che si tratta di un test di screening e non un test diagnostico Descrivere i limiti del test (le comuni trisomie costituiscono circa il 50-60% delle anomalie cromosomiche identificate con l analisi del cariotipo) Riassumere i quadri clinici delle condizioni soggette allo screening Definire sensibilità e specificità del test Raccomandare che i risultati positivi del test siano confermati con un test diagnostico per la determinazione del cariotipo fetale o neonatale. Menzionare la possibilità di risultati inattesi che riguardano la salute materna

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