ESPERIMENTI CON ORGANI ISOLATI
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- Evangelista Simoni
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1 ESPERIMENTI CON ORGANI ISOLATI
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3 LA SPERIMENTAZIONE 1. Modelli semplificati (cellule in coltura, esperimenti in vitro, organi isolati studi di binding) 2. Modelli complessi (esperimenti in vivo) 1+2. Informazioni fondamentali per l uso clinico di un farmaco, ma influenzato da assorbimento, farmacocinetica e meccanismi riflessi.
4 PERCHE SI UTILIZZA QUESTO TIPO DI TECNICA NELLA FARMACOLOGIA SPERIMENTALE? Per identificare il tipo e l ordine di grandezza di risposta che si ha per una sostanza sconosciuta Per poter quantificare l effetto farmacologico di una sostanza Per consentire la previsione di un possibile effetto terapeutico
5 Esiste una notevole corrispondenza tra i recettori isolati nell animale e quelli dell uomo L isolamento di un organo permette di eliminare le variazioni delle influenze circolatorie ed ormonali. Viene però mantenuta la divisione fisiologica in compartamenti del tessuto (il vascolare, l interstiziale, l intracellulare). Si può pensare che le risposte ai farmaci ottenute nell animale siano predittive di quelle dell uomo
6 DA DOVE PROVIENE UN ORGANO ISOLATO? Da animali di laboratorio sani o da animali con patologie spontanee o indotte chirurgicamente o farmacologicamente Dall uomo come by products di procedure chirurgiche o mediante la rapida acquisizione postmortem Un tessuto in vitro non è un tessuto in vivo, è quindi opportuno modificare i sali della soluzione fisiologica per mantenere il preparato nella condizione più adeguata.
7 CARATTERISTICHE DI UN ORGANO (o TESSUTO) ISOLATO Devono avere alcuni requisiti fondamentali: capacità a rimanere vitali stabilità omogeneità anatomica
8 Composizione del sangue [Il sangue può essere considerato come un tessuto connettivo, formato da cellule sospese in una matrice fluida, chiamata plasma Ha una azione principalmente di trasporto: ossigeno, le sostanze nutritizie, metaboliti, ormoni, ecc] PLASMA H 2 O Soluti organici Elettroliti Proteine Albumina Globuline Fibrinogeno siero ELEMENTI CELLULARI Piastrine Eritrociti Leucociti Neutrofili Eosinofili Basolfili Linfociti Monociti granulociti leucociti linfoidi
9 Principale composizione del plasma Cationi Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Altri minerali ferro, rame, iodio in tracce; Anioni Cl -, fosfati, solfati, bicarbonati, proteine, acidi organici Proteine albumina, globuline, fibrinogeno Azoto non proteico urea, ac. urico, creatinina, creatina, sali di ammonio Sostanze nutritizie H 2 0 (90%) glucosio, ac. lattico, aminoacidi, colesterolo, fosfolipidi, lecitina Gas N 2, O 2 (2%), CO 2 (60%)
10 Soluzioni fisiologiche per organi isolati (isotoniche con il plasma) Fisiologica è l attributo che si associa a numerose soluzioni saline Plasma normale Na + = 145 mmol/l Cl - = 110 mmol/l ph = 7.4 Soluzione salina (isotonica) NaCl 0.9% = g/l MW (NaCl) = = mmol/l ph = 7 (6.8 a 37 C)
11 Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati (mmoli/litro) Ringer anfibi Krebs ileo stim musc.schel. Tyrode cuore ileo Ringer Tyrode Locke De Jalon utero Reiter NaCl KCl MgSO NaH 2 PO KH 2 PO Glucosio NaHCO CaCl Gas aria 95% O 2 5% CO 2 O 2 O 2 95% O 2 5% CO 2 95% O 2 5% CO 2
12 SOLUZIONI FISIOLOGICHE per organi isolati La soluzione fisiologica deve: assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive apporto di O 2 (?) temperatura 37 C (?) corretta composizione ionica ph costante osmolarità costante
13 Variabile: CONCENTRAZIONE IONICA CONCENTRAZIONI DI ALCUNI ELETTROLITI (mm) E DELLE PROTEINE (g/100 ml) NEL PLASMA DI ALCUNE SPECIE Uomo Ratto Porcellino d India Na K Cl Ca proteine
14 Variabile: SOLUZIONE TAMPONE Miscela di acido debole e della sua base coniugata: la sua funzione è quella di minimizzare la variazione di ph Perché una coppia coniugata possa essere considerata come un tampone di rilevanza fisiologica: a) pka = ph fisiologico + 1 b) sufficiente capacità tampone
15 Variabile: TEMPERATURA Variabile fisiologica Influenza la risposta basale di un tessuto Influenza la risposta a farmaci Influenza il ph della soluzione Esempi: Utero di ratto femmina T basse = ridotto consumo di ossigeno tissutale
16 Strumentazione base per organi isolati e perfusi non stimolati bagnetto a camicia bombola di oxicarb ciclotermo (temperatura C) trasduttore amplificatore registratore 16
17 Strumentazione: BAGNETTI A camicia: E un bicchiere di vetro con una camicia intorno alla quale circola acqua calda a 37 C. E il più usato poiché è possibile montare una serie di bagnetti in parallelo. In questo tipo i bagnetto il tessuto è completamente immerso nel liquido. A cascata: Utile per determinare l emivita di alcune sostanze (es: NO) Si possono utilizzare tessuti (organi) diversi Si possono inibire i recettori di un tessuto rispetto ad altri
18 TRASDUTTORI DI FORZA (apparecchi leva) Il tessuto nel bagnetto è collegato ad un apparecchio leva (trasduttore). Tramite il trasduttore si rileva la reattività del tessuto. SEGNALE ELETTRICO
19 Trasduttore isotonico collegato ad ileo di cavia (esempio 1) L ileo isolato di cavia collegato al trasduttore isotonico ed immerso in un bagnetto: l ileo si muove spontaneamente Si somministra ACh e, poiché ci sono recettori muscarinici, il tessuto si contrae: l ileo si accorcia = il trasduttore si abbassa
20 Trasduttore isometrico collegato ad ileo di cavia (esempio 2) L ileo isolato di cavia collegato al trasduttore isometrico ed immerso in un bagnetto: l ileo rimane fermo Si somministra ACh, ma non si ha accorciamento, trattandosi di una leva imperniata, però il tessuto reagisce lo stesso La reazione del tessuto si trasduce in una forza che il tessuto esercita sulla leva.
21 Il movimento del trasduttore è convertito in potenziale elettrico che può essere amplificato e registrato come il movimento della penna su un registratore a carta
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23 Alcuni esempi in commercio
24 COSA LEGGIAMO SUL REGISTRATORE? Nel trasduttore isotonico si ha una variazione di lunghezza (il registratore registra un ampiezza e l unità di misura è in mm) Nel trasduttore isometrico non si hanno variazioni di lunghezza ma avremo una variazione di forza e l unità di misura è il grammo.
25 A COSA SERVE L AMPLIFICATORE? Per segnali di piccola o piccolissima intensità Registrazione e interpretazione del segnale Per segnali di grandezza maggiore Ridurre interferenza di segnali estranei
26 Apparecchiatura per test in vitro su ileo isolato e stimolato elettricamente
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28 Ileo isolato Specie : Guinea pig (rat) Tipo di preparato: si misura l attività contrattile di segmenti di ileo registrati in condizioni isometriche. Quali molecole si valutano: farmaci attivi sui recettori muscarinici, istaminergici, serotoninergici, nicotinici, per la bradichinina e la colecistochinina e farmaci ad effetto spasmolitico o spasmogenico muscolare. Molecole di riferimento: Atropine, BaCl2, Bradykinin, Carbachol, Cholecystokinin, Hexamethonium, Histamine, LTD4, Nicergoline, Nicotine, Papaverine, Pyrilamine, Serotonin. duodeno + digiuno + ileo = tenue
29 Struttura del tratto gastrointestinale Nello spessore della parete di tutto il tubo digerente vi sono numerosissimi gangli situati nella sottomucosa (Plesso di Meissner) e tra lo strato longitudinale e quello trasversale della tonaca muscolare (Plesso di Auerbach) che regolano le varie funzioni dell'apparato digerente.
30 ESPERIMENTI CON LA MUSCOLATURA LISCIA INTESTINALE Innervazione parasimpatica (a mediazione colinergica Plesso mienterico di Auerbach Plesso submucoso di Meissner Innervazione simpatica (inibisce i movimenti peristaltici, a mediazione adrenergica) Fibre lungo le arterie
31 Controllo della funzione gastrointestinale Sistema simpatico inibisce le secrezioni ed eccita la contrazione degli sfinteri (risposta di attacco-fuga) Sistema parasimpatico eccita la contrazione e la motilita intestinale
32 Principali preparati di intestino in vitro Ileo terminale di cavia (metodo di Magnus, 1904) Long strip = fibre muscolari longitudinali di ileo con plesso mienterico di Auerbach (metodo di Paton e Vizi, 1968) Ileo terminale di cavia (metodo di Trendelenburg, 1917) Sacculus del colon di cavia (metodo di Botting) Digiuno di coniglio con stimolazione elettrica periarteriale (metodo di Finkleman, 1930) Duodeno di ratto Ileo di topo Intestino di pesciolino rosso
33 ILEO DI CAVIA: PRELIEVO DEL PREPARATO
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36 Tracciato tipo: effetto di dosi crescenti di acetilcolina su ileo di cavia isolato e perfuso secondo Magnus 36
37 Quali molecole si studiano con i preparati di intestino (dosaggio qualitativo) 1. Agonisti e antagonisti colinergici 2. Agonisti e antagonisti dell istamina e della serotonina 3. Agonisti adrenergici 4. Bloccanti adrenergici 5. Oppioidi (morfina inibisce il release di ACh)
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