Influenza aviaria a bassa patogenicità in Lombardia: evoluzione dell epidemia di G. Zanardi, D. Avisani

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1 Influenza aviaria a bassa patogenicità in Lombardia: evoluzione dell epidemia di G. Zanardi, D. Avisani Influenza aviaria: indagine sierologica e isolamenti virali nella avifauna selvatica ed allevata di A. Moreno Martin 1

2 Influenza aviaria a bassa patogenicità in Lombardia: evoluzione dell epidemia Nella precedente nota pubblicata sul numero 5 del L Osservatorio avevamo descritto la situazione epidemiologica dell influenza aviaria aggiornata alla fine di ottobre La epidemia di influenza aviaria si è evoluta rapidamente e con essa anche i decreti regionali emanati al fine di governarne la diffusione e di regolamentare dal punto di vista sanitario le movimentazioni dei volatili. A fine ottobre ricordiamo che la malattia era presente in quattro comuni della provincia di Brescia ed aveva coinvolto 8 allevamenti di tacchini da carne. Dall inizio di novembre ad oggi la malattia è stata riscontrata anche nelle province di Mantova e di Cremona, proseguendo la sua evoluzione nella provincia di Brescia. Nella provincia di Mantova sono stati individuati 13 focolai di cui 11 in allevamenti di tacchini da carne, 1 in un allevamento di ovaiole, 1 in un allevamento di polli e 1 in un allevamento di faraone. Nella provincia di Brescia sono stati evidenziati altri 11 focolai di cui uno rurale, 7 in allevamenti di tacchini da carne, 2 in polli e 1 in ovaiole. Nella provincia di Cremona, interessata dalla malattia a inizio dicembre, sono stati colpiti due allevamenti, di tacchini da carne e di uno svezzatore (positivi i capponi). L elenco dei focolai e la loro distribuzione geografica aggiornati al 12 dicembre 2002 sono presentati, rispettivamente, in tabella 1 e nella figura 1. In totale gli allevamenti avicoli fino ad ora colpiti dal virus influenzale a bassa patogenicità in Lombardia sono 34, di cui 26 di tacchini da carne (15 in provincia di Brescia, 10 in provincia di Mantova e 1 in provincia di Cremona), 3 di polli (2 in provincia di Brescia e 1 in provincia di Mantova), 2 di galline ovaiole (in provincia di Brescia e di Mantova), 1 presso uno svezzatore della provincia di Cremona,, 1 di faraone in provincia di Mantova,. e uno relativo ad un allevamento rurale di polli in provincia di Brescia. Le vie di infezione emerse dalla elaborazione delle indagini epidemiologiche condotte sono da ricondurre al carico degli animali, ai contatti dei veterinari aziendali e alla movimentazione di automezzi fornitori d mangimi. Nelle tabelle 2, 3, 4 e 5 è riassunta l attività di monitoraggio sierologico e virologico eseguita dall inizio della epidemia ad oggi. Il monitoraggio sierologico e virologico ha interessato, rispettivamente, 746 e 263 allevamenti avicoli con e 407 accessi per controlli ripetuti e per un numero complessivo di e campioni prelevati ed esaminati. Le aziende risultate virologicamente positive sono 18, mentre quelle sierologicamente positive sono 23 (tabella 1). 2

3 Tabella 1. Focolai di influenza aviaria a bassa patogenicità in Lombardia (aggiornamento al 12 dicembre 2002) n progressivo ASL comune prov specie/indirizzo produttivo data positività sierologica data isolamento LPAI virus 1 BS Ospitaletto BS tacchino da carne 11/10/02 neg 2 BS Ospitaletto BS tacchino da carne 11/10/02 neg 3 BS Ospitaletto BS tacchino da carne 11/10/02 neg 4 BS Roncadelle BS tacchino da carne 11/10/02 neg 5 BS Roncadelle BS tacchino da carne 11/10/02 neg 6 BS Isorella BS tacchino da carne neg 16/10/02 7 BS Coccaglio BS tacchino da carne 17/10/02 neg 8 BS Isorella BS tacchino da carne neg 25/10/02 9 MN Solferino MN tacchino da carne 26/11/02 04/11/02 10 MN Medole MN tacchino da carne 04/11/02 neg 11 MN Medole MN tacchino da carne 07/11/02 11/11/02 12 BS Isorella BS rurale 08/11/02 neg 13 BS Lonato BS tacchino da carne neg 11/11/02 14 BS Castemella BS ovaiole 13/11/02 19/11/02 15 MN Medole MN tacchino da carne neg 14/11/02 16 MN Guidizzolo MN tacchino da carne 12/11/02 15/11/02 17 MN Casalmoro MN tacchino da carne 15/11/02 19/11/02 18 MN Guidizzolo MN tacchino da carne neg 22/11/02 19 BS Capriano del Colle BS tacchino da carne neg 22/11/02 20 MN Castiglione delle Stiviere MN tacchino da carne 22/11/02 neg 21 BS Poncarale BS tacchino da carne neg 22/11/02 22 BS Brescia BS polli 28/11/02 neg 23 BS San Gervasio Brescia BS tacchino da carne neg 29/11/02 Castiglione delle 24 MN Stiviere MN ovaiole neg 03/12/02 25 BS Poncarale BS tacchino da carne 03/12/02 neg 26 MN Goito MN tacchino da carne 03/12/02 neg 27 MN Monzambano MN tacchino da carne neg 06/12/02 28 MN Ceresara MN polli 06/12/02 neg Gadesco Pieve 29 CR Delmona CR tacchino da carne 06/12/02 neg 30 MN Solferino MN faraone neg 09/12/02 San Gervasio 31 BS Bresciano BS tacchino da carne neg 09/12/02 32 BS Lonato BS tacchino da carne 04/12/02 neg 33 CR Cappella dè Picenardi CR svezzatore 10/12/02 neg 34 BS Poncarale BS polli 10/12/02 neg La situazione nel Veneto è altrettanto preoccupante. Infatti, al 16 dicembre risultano colpiti 76 allevamenti (59 focolai confermati), 71 nella provincia di Verona e 5 in provincia di Vicenza, di cui 71 di tacchini da carne, 2 di tacchini, 2 di broiler e uno di polli. La strategia di gestione congiunta dei focolai tra le due regioni interessate non prevede più l abbattimento degli allevamenti di tacchini da carne colpiti, ma bensì la loro macellazione controllata trascorse tre settimane dalla data dell ultimo isolamento virale. Nel caso di allevamenti di, di galline ovaiole e di altre specie avicole, lo stamping out rimane il metodo di eradicazione e di gestione del focolaio con invio delle carcasse al rendering. Dal punto di vista normativo, dall inizio di novembre sono stati emanati diversi decreti regionali: - Decreto dalla regione Lombardia n del 5 novembre 2002 che abroga il precedente n e concernente la Istituzione di una zona di restrizione delle movimentazioni di volatili a est delle strade statali 236 e 482 3

4 della provincia di Mantova e regolamentazione sul restante territorio della sorveglianza e dei controlli per l invio al macello ; - Decreto dalla regione Lombardia n del 12 novembre 2002, che abroga i precedenti n 19372, e e che definisce la Istituzione e regolamentazione della zona di protezione in caso di focolaio, comprese le operazioni di pulizia e disinfezione, la Istituzione di una zona di restrizione alle movimentazioni di volatili delle AASSLL di Mantova e Brescia e sua regolamentazione, la Regolamentazione degli accasamenti nelle AASSLL di Mantova e Brescia e le Misure da applicare per il restante territorio della regione Lombardia per l invio dei tacchini alla macellazione oltre alle misure di biosicurezza da osservare; - Decreto della regione Lombardia n del 27 novembre 2002 su Misure di contenimento dell influenza aviaria da stipiti a bassa patogenicità sul territorio della regione Lombardia che abroga il precedente n e in cui vengono normate le misure sanitarie da applicare nelle zone di protezione istituite in seguito alla evidenza di un focolaio; la individuazione di una zona di attenzione nelle province di Brescia e di Mantova in cui viene regolamentata la movimentazione dei volatili e i controlli da effettuare; le misure sanitarie da applicare nel restante territorio regionale. - Decreto della regione Lombardia del 11 dicembre 2002 n su Influenza aviaria. Programma di vaccinazione. - Decreto della regione Lombardia n del 11 dicembre 2002 su Misure di contenimento dell influenza aviaria da stipiti a bassa patogenicità sul territorio della provincia di Cremona La novità nel controllo della malattia è la introduzione della vaccinazione obbligatoria di emergenza nella zona colpita dall influenza aviaria che copre i comuni delle province di Brescia, Mantova, Verona a sud dell autostrada A4, parte dei comuni della provincia di Vicenza e di Padova. Il piano vaccinale è stato approvato dalla Commissione UE a inizio dicembre e reso applicativo dalle due regioni a partire dall 11 dicembre 2002 per una durata di almeno 18 mesi. Le specie soggette a vaccinazione sono i tacchini da carne, le galline ovaiole, i capponi e i galletti. Il vaccino impiegato in una prima fase perché prontamente disponibile è omologo (H7N3) e va utilizzato prioritariamente nelle galline ovaiole, mentre all inizio del prossimo anno sarà disponibile un vaccino eterologo (H7N1) da utilizzare nei tacchini. La gestione del piano vaccinale vede coinvolti, sotto il coordinamento del Centro di referenza nazionale per l nfluenza aviaria dell IZS delle Venezie, i veterinari aziendali, i veterinari ufficiali delle AASSLL interessate, i laboratori diagnostici degli Istituti Zooprofilattici di Brescia e di Padova, gli Osservatori Epidemiologici per la raccolta, il controllo, e l invio dei dati del monitoraggio sierologico e virologico, necessari per la produzione della reportistica chiesta dalla Commissione UE per valutare l andamento della epidemia e della corretta applicazione del piano vaccinale. Il Piano può essere agevolmente consultato o scaricato dal sito dell Osservatorio epidemiologico del Veneto (crev.regione.veneto.it). Circa l origine di questa nuova epidemia, i dati preliminari sulla assenza di siti di glicosidazione a livello della porzione globulare dell emoagglutinina fanno ritenere che lo stipite in causa sia caratterizzato da un basso livello di adattamento ai volatili domestici, facendo presumere la sua introduzione dall ospite selvatico. La ricomparsa del virus LPAI a distanza di due mesi (ottobre) dalle prime positività sierologiche (luglioagosto) è correlabile alla perpetuazione della infezione in serbatoi non ancora identificati. La persistenza del virus nelle aree attualmente colpite e il suo passaggio a specie diverse dal tacchino, sulla base della precedente esperienza, rende possibile una sua mutazione con caratteristiche di alta virulenza. Per scongiurare questo catastrofico scenario in aree densamente popolate di specie sensibili e considerando la ben nota contiguità e stretta relazione funzionale degli allevamenti avicoli con la possibilità di passaggi seriali interspecifici, la possibilità di affiancare alla profilassi diretta l intervento vaccinale, che consenta di limitare la circolazione virale e di immunizzare la popolazione suscettibile, è apparsa una decisione improcrastinabile. 4

5 Tabella 2. Aziende avicole controllate sierologicamente dal 11/10 al 11/12/2002 prov broilers ovaiole polli n aziende controllate suddivise per specie allevata tacchini da carne tacchini fagiani faraone quaglie altre specie BG BS CO CR LC LO MI MN PV SO VA totale Numero totale di allevamenti controllati:un allevamento prelevato più volte è contato una sola volta totale Tabella 3. Attività di monitoraggio sierologico a livello aziendale e campioni esaminati dal 11/10 al 11/12/2002 prov broilers ovaiole n aziende controllate suddivise per specie allevata tacchini polli da carne tacchini fagiani faraone quaglie altre specie totale totale campioni BG BS CO CR LC LO MI MN PV SO VA totale Numero di controlli negli allevamenti i controllati:un allevamento prelevato più volte è contato più volte Tabella 4. Aziende avicole controllate virologicamente dal 11/10 al 11/12/2002 prov broilers ovaiole polli n aziende controllate suddivise per specie allevata tacchini da carne tacchini fagiani faraone quaglie altre specie BG BS CO CR LC LO MI MN PV SO VA totale Numero totale di allevamenti controllati:un allevamento prelevato più volte è contato una sola volta totale 5

6 Tabella 5. Attività di monitoraggio virologico a livello aziendale e campioni esaminati dal 11/10 al 11/12/2002 prov broilers ovaiole n aziende controllate suddivise per specie allevata tacchini polli da carne tacchini fagiani faraone quaglie altre specie totale totale campioni BG BS CO CR LC LO MI MN PV SO VA totale Figura 1. Distribuzione geografica dei focolai di influenza aviare 6

7 Influenza aviaria: indagine sierologica e isolamenti virali nella avifauna selvatica ed allevata Introduzione Nel novero delle ipotesi sulla origine delle epidemie di influenza aviaria tipo A sottotipo H7N1 a bassa e ad alta patogenicità verificatesi nel e l attuale epidemia a bassa patogenicità da virus influenzale tipo A sottotipo H7N3 che sta colpendo le regioni Lombardia e Veneto, ha sempre trovato ampio risalto la possibilità di un passaggio interspecie del virus dai selvatici alle specie allevate industrialmente. Tenuto conto di questa possibilità è di vitale importanza disporre di accurate indagini epidemiologiche in grado non solo di individuare i canali di più frequente diffusione del virus, ma anche di fornire informazioni, quando possibile, relative al possibile ruolo epidemiologico delle differenti specie aviari selvatiche. I virus influenzali sono stati isolati dalla maggior parte delle principali famiglie di uccelli selvatici in tutto il mondo. Sono stati segnalati isolamenti in ben 88 specie differenti, appartenenti a 22 famiglie e 12 ordini diversi, ed è probabile che il numero di specie sensibili sia superiore. Tuttavia, la frequenza di isolamenti varia notevolmente a seconda della specie, essendo quelle appartenenti all'ordine degli Anseriformes le più frequentemente coinvolte, seguite dalle specie di Charadriiformes ed i Passeriformes. La frequenza degli isolamenti negli uccelli acquatici, specialmente migratori, varia in funzione di numerosi fattori: età degli animali, posizione geografica rispetto alla migrazione, periodo dell'anno, specie interessata, caratteristiche del virus. Dalle specie acquatiche sono state isolati quasi tutti i sottotipi risultanti dalle diverse combinazioni possibili delle 15 emoagglutinine e 9 neuraminidasi virali finora conosciute, sebbene con frequenze diverse in funzione della specie; i sottotipi H9 ed H13 sono tra i più frequentemente isolati in gabbiani e pivieri, mentre sono ritrovati raramente, il primo, o mai, il secondo, nell'anatra. Il ruolo che queste specie rivestono nelle diffusione dei virus influenzali è stato approfonditamente studiato. Si ritiene che questi uccelli si comportino come ospiti naturali, nei quali il virus si replica a livello intestinale per essere poi escreto con le feci a concentrazioni molto elevate (più di DL50 / g di feci) senza però indurre la comparsa di forme cliniche evidenti; ciò indica che questi uccelli costituiscono un mezzo molto efficace di trasmissione del virus per via oro-fecale, mediante le acque di superficie contaminate, nelle quali la sopravvivenza del virus varia in funzione del ceppo e della carica virale, del ph, della temperatura e della salinità delle acque. L'apparente stabilità genetica del virus, dimostrata dai rari fenomeni di drift antigenico, rappresenterebbe il risultato di una stabilità del rapporto ospite (anatra)/ parassita (virus), tale da garantire il mantenimento dell'infezione in natura. Parallelamente la contemporanea circolazione di virus antigenicamente diversi e l'esistenza di infezioni miste, crea la situazione ideale per la formazione di "nuovi virus" in seguito a meccanismi di shift antigenico. L 'isolamento di virus influenzali da uccelli selvatici interessa più frequentemente ceppi a bassa patogenicità; i pochi casi di ceppi ad alta patogenicità isolati in uccelli selvatici corrispondono perlopiù ad animali ritrovati nelle vicinanze di allevamenti infetti nel corso di epidemie di virus HPAI. In Italia, in particolare, le popolazioni serbatoio sono principalmente costituite da individui svernanti nelle regioni artiche del Nord Ovest. In queste popolazioni i giovani soggetti sono quelli maggiormente interessati all'infezione; i flussi migratori portano nel nostro territorio soggetti inetà adulta e quindi già dotati in genere di elevati titoli anticorpali. Al contrario di quanto avviene con le specie di selvatici acquatici, quelle domestiche non sono considerate importanti serbatoi del virus, ma piuttosto ospiti "aberranti" in quanto l'infezione si manifesta in genere con forme cliniche evidenti e con una eliminazione di particelle virali limitata nell'intensità nella durata. Non si ritiene che i virus influenzali siano enzootici in polli o tacchini, anche se vengono isolati frequentemente da queste specie. E' significativo il fatto che, nella maggior parte dei paesi, molte epidemie si siano verificate in allevamenti di tacchini situati lungo le rotte migratorie di alcune specie di uccelli acquatici. Ciò permetterebbe ipotizzare una prima introduzione del virus in seguito a contatti tra uccelli selvatici e domestici. Nell ambito della indagine epidemiologica relativa all'episodio di Influenza aviare del Nord Italia, è stata condotta una raccolta ed una valutazione dei dati riguardanti gli isolamenti virali e le positività sierologiche nella avifauna selvatica e di ripopolamento durante gli anni , nel territorio delle regioni maggiormente interessate all'epidemia. Si è inoltre eseguito l'esame virologico su 342 tamponi cloacali da passeriformi catturati nel Comune di Salerno, nel "Parco Nazionale del Cilento e Vallo di Daino", dove pernottano specie stanziali ma anche alcune migratici, i cui spostamenti comprendono un territorio molto vasto dalla zona sub-sahariana al Nord Europa. Si è anche cercato di verificare i canali di più frequente diffusione del virus H7N1 nel corso della recente epidemia e del possibile ruolo dei selvatici nella sua trasmissione. Nell'ambito della stessa ricerca si sono inoltre effettuati esami virologici e sierologici nei confronti dei virus influenzali sulle specie aviari importate da paesi terzi, 7

8 sotto vincolo sanitario, allo scopo di valutare lo stato sanitario di questi soggetti, fondamentalmente appartenenti agli ordini passeriformi e psittacidi, che vengono introdotti nel nostro territorio. Detta ricerca è di notevole importanza se si considera, da una parte la frequenza con cui diverse specie dei passeriformi risultano coinvolte nell'isolamento di virus influenzali e, dall'altra, la mancata conoscenza della situazione epidemiologica e dello stato sanitario dell avifauna nella maggior parte dei paesi di provenienza. Materiali e metodi Popolazione campionata Avifauna selvatica: dai soggetti trovati morti si è eseguito l'esame necroscopico ed il prelievo di visceri, quali trachea, polmoni, tonsille cecali e cervello sui quali effettuare l'esame virologico. Dai soggetti catturati invece, si è prelevato un campione di sangue ed un tampone cloacale. Il prelievo di un doppio campione di sangue a distanza di 15 giorni sarebbe stato auspicabile per rilevare l'eventuale sieroconversione, in quanto il primo campione potrebbe essere stato prelevato prima dello sviluppo di anticorpi. Tuttavia, i possibili problemi di adattamento di animali selvatici a spazi chiusi ed anche l'impossibilità di disporre di una voliera idonea, non hanno permesso il prelievo di un doppio campione. L'esame virologico eseguito sul tampone cloacale dovrebbe comunque permettere di evidenziare quei soggetti appena infettati e non ancora in grado di sviluppare un tasso anticorpale rilevabile. Avifauna da ripopolamento: soprattutto da starne ed fagiani allevati a scopi venatori, sono stati utilizzati i campioni di sangue, prelevati ufficialmente dalle ASL in applicazione di una Circolare della Regione Lombardia, e pervenuti al Reparto di Virologia Specializzata di Brescia dell'istituto Zooprofilattico della Lombardia ed Emilia. La Circolare prevede controlli sierologici nei confronti della pseudopeste e dell'influenza H7 su tutti gli allevamenti di selvaggina presenti nel territorio ed anche sulle partite di soggetti che provenendo dal Veneto, dalla zona di vaccinazione per l'influenza, devono essere liberati in territorio lombardo. Il numero di campioni previsto è di 20 per ogni allevamento o partita di controllata. Inoltre, dai soggetti deceduti, si esegue l'esame necroscopico ed il prelievo di visceri per l'esame virologico. Soggetti importati da paesi terzi: sono stati utilizzati i campioni ufficiali su tutte le partite di animali importati sotto vincolo sanitario, che in genere sono costituiti da soggetti arrivati morti o da animali ammalati o indeboliti, che devono essere soppressi. Esami Virologici Per l isolamento ed identificazione virale si è utilizzata la metodica ufficiale prevista dal D.P.R. 656/96, che prevede l'uso di uova embrionate di pollo (UEP) di 9-11 gg. di età, inoculate per via allantoidea. L'inoculo è costituito da una sospensione di visceri in M.E.M. (minimal essential medium) 1:10 p/v, centrifugata a 3000 rpm per 10' e filtrata a 0,45øm. Sul liquido allantoideo raccolto dalle uova morte a partire dalle 48h e da quelle non morte dopo 6 gg. di incubazione, si è eseguita la prova di emoagglutinazione (HA) utilizzando globuli rossi di pollo al 1%. Inoltre si è realizzata una prova in ELISA sandwich con Mab verso la nucleoproteina A, al fine di determinare l'eventuale presenza di un virus influenzale tipo A nel liquido allantoideo. Detta metodica si è rilevata più sensibile della HA e, a differenza di questa, che identifica qualsiasi virus emoagglutinante presente, fornisce risposta positiva solo in presenza di virus influenzali. Come previsto dalla metodica ufficiale, sui liquidi allantoidei emoagglutinanti si esegue la inibizione della emoagglutinazione (HI) utilizzando gli antisieri nei confronti di tutte le 15 emoagglutinine (H) per la tipizzazione dei ceppi. In seguito, i ceppi sono stati inviati al Centro di Referenza Nazionale per l Influenza Aviare per la determinazione dell'indice di patogenicità intravenoso (IVPI) ed inoltre, per i ceppi H5 ed H7, per la sequenzazione aminoacidica nel sito di clivaggio. Si considerano ceppi di alta patogenicità quelli che presentano un IVPI = 1,2 o multipli aminoacidi basici nel sito di clivaggio. Sono considerati negativi quei campioni che risultano negativi dopo 2 passaggi su UEP con 6 gg. di incubazione per ciascun passaggio. Esami sierologici Ricerca dell'antigene di gruppo (nucleoproteina A): per l'identificazione di anticorpi anti-virus influenzali tipo A, si è scelto l utilizzo del test ELISA rispetto alla immunodiffusione in gel di agar (AGID), per la maggiore sensibilità e specificità. Considerando le specie saggiate in questa ricerca (selvatici e di 8

9 ripopolamento), non si è ritenuto opportuno l'uso di metodiche ELISA indirette presenti in commercio, che prevedono l'uso di un anticorpo anti-specie e che utilizzando un anti-pollo sono pertanto in grado ad analizzare soltanto sieri di pollo o tacchino. Il test ELISA sandwich con Mab verso la nucleoproteina A adottato, non usando un anti-specie ma un MAb marcato che si fissa al complesso Ag-Ac, permette l'analisi di sieri di tutte le specie aviari. Questa prova viene usata come screening anche in considerazione della semplicità di realizzazione e della rapidità di esecuzione. Ricerca delle emoagglutinine : i campioni risultati positivi al test ELISA di screening, sono stati provati con la HI, per identificare l'emoagglutinina nei confronti della quale agiscono gli anticorpi presenti nel siero analizzato. Devono essere condotte 15 prove usando in ognuna una emoagglutinina diversa. Per l'eliminazione delle agglutinine aspecifiche, si mettono a contatto siero e globuli rossi al 10% per 30' a temperatura ambiente e, dopo sedimentazione dei globuli, si recupera il surnatante per l'esecuzione della prova. L 'esecuzione di 15 test diversi prevede la presenza di un notevole quantitativo di sangue, molte volte non disponibile in quantità sufficiente nei campioni di origine; in questi casi, sono stati provate inizialmente le HI nei confronti di H7 ed H5. Per ovviare problemi di positività aspecifiche, che potrebbero essere determinate dalla non totale eliminazione delle agglutinine aspecifiche durante la fase di contatto, o anche dalla presenza di reazioni crociate tra diverse H, quando il titolo anticorpale verso la H omologa è molto elevato, viene utilizzata una ELISA con un MAb specifico verso H7. La messa a punto di questo test è risultata di notevole importanza, soprattutto in seguito alla epidemia di influenza H7N1 che ha colpito il Nord Italia recentemente. Un ulteriore vantaggio della suddetta metodica è dato dalla piccolissima quantità di siero necessaria all esecuzione della prova (10øl). Risultati Virologia Negli anni 2000 e 2001, sono stati analizzati in totale 570 conferimenti per un numero complessivo di 863 soggetti appartenenti a diverse specie (tabella 1).In tabella 2 vengono inoltre indicati i campioni risultati positivi suddivisi per specie e per tipo di agente eziologico isolato. Nell'anno 2000, sono stati isolati virus influenzali su di un totale di 8 campioni; 7 positivi per H7N1 ed 1 per H3N8. Tuttavia, i primi rientrano negli ultimi isolamenti virali della recente epidemia di influenza del mentre l'ultimo apparteneva ad una partita di passeriformi importati da paesi terzi. I soggetti positivi per H7, non appartenevano in nessun caso a specie selvatiche, ma allevate. L'unico caso di positività in anatre ha riguardato un allevamento intensivo, mentre il falco riscontrato positivo era allevato a scopi venatori. Nel corso degli esami virologici per influenza aviare, sono stati isolati altri virus, non oggetto della presente ricerca ma che, data la loro importanza epidemiologica sono stati comunque registrati. Sono infatti risultati positivi 5 campioni per Newcastle Disease (ND) e 2 per altri Paramyxovirus (PMV). Questi due ultimi casi riguardavano passeriformi provenienti da paesi terzi.nel corso del 2001, non sono stati isolati virus influenzali, ma altri virus emoagglutinanti quali il virus della pseudopeste aviare (NDV) ed altri PMV. Tutti gli PMV e 1 NDV isolati hanno riguardato soggetti di importazione. Il virus della pseudopeste, in questo caso, ha presentato un indice di patogenicità intracerebrale di 0,7, al limite quindi del valore per i ceppi velogeni, il che ha determinato un blocco della partita di importazione da parte delle Autorità Sanitarie e gli ulteriori accertamenti previsti per legge. I campioni riguardanti i tamponi cloacali di passeriformi catturati nel Comune di Salerno negli anni sono risultati tutti negativi all'esame virologico. 9

10 Tabella 1. Specie aviarie analizzate negli anni specie n conferimenti anno 2000 n conferimenti anno 2001 psitaccidi colombi tortore 1 11 anatidi rapaci 7 1 fagiani 7 5 quaglie 2 8 starne 1 1 pettirossi capinera cinciallegra, cinciarella 9 17 occhiotto, beccafico, sterpazzola, sterpazzolina 5 13 tordi 13 9 merli rondini 1 1 fringuelli 6 6 pavoni 2 1 usignolo 3 1 tucano 0 1 gru 1 0 gazza 1 1 altri passeriformi totale Tabella 2. Numero campioni risultati positivi e specie di appartenenza tipo virus H7N1 7 positivi anno positivi anno specie specie pavone, quaglia, fagiano, - - anatra, falco H3N8 1 passeriformi - - colombi, tortore, tortore, colombi, streptopelia NDV 5 8 passeriformi senegalensis PPMV2 1 passeriformi 4 passeriformi PPMV3 1 passeriformi - - totale Sierologia Nel biennio , un totale di campioni ufficiali, tra soggetti di ripopolamento (fagiani, quaglie e starne) e selvatici (in prevalenza ad anatidi, colombi, tortore e passeriformi),. sono stati sottoposti all'inibizione dell'emagglutinazione per H7. L'ELISA è stata eseguita solo per 800 campioni. I risultati degli esami sierologici sono riassunti nella tabella 3. Purtroppo, l'insufficiente quantità di siero dei 2 campioni risultati positivi all'elisa per la NP, non ha permesso di arrivare ad una completa identificazione degli anticorpi presenti. Sono state, comunque, condotte 4 prove nei confronti di H7, H5, H6 e H9, e sono risultati tutte negative. I 16 casi positivi verso H6 appartengono ad un unico allevamento di fagiani. Tabella 3. Esami sierologici eseguiti negli anni specie n campioni ELISA NP HI (H7) positivi ELISA positivi H7 positivi altre H ripopolamento H6 selvatici non eseguito totale

11 Discussione e conclusioni Nel corso di 2 anni di attività, gli unici isolamenti di virus influenzali H7N1 corrispondono a casi manifestatasi in specie non domestiche nei primi mesi del 2000 in Lombardia, durante l epidemia di influenza. Di questi casi, risultano di notevole interesse l'isolamento di due virus ad alta patogenicità in un falco ed in anatre. Il primo, per la rarità del fenomeno; infatti, a tutt oggi sono stati riportato nel mondo pochissimi isolamenti in rapaci. Il primo caso si riferiva ad un virus H7N3 isolato negli Emirati Arabi nel 1998, simile al virus responsabile della epidemia che si è manifestata in Pakistan nel Il secondo caso di isolamento di virus ad alta patogenicità ha riguardato, come detto, un allevamento di anatre dove, al contrario di quanto viene in genere riportato, il virus aveva determinato una sintomatologia fondamentalmente nervosa con una mortalità superiore al 50%.L'unico altro caso di isolamento di virus influenzale riguarda una partita di soggetti importati da paesi terzi. Tutti gli altri campioni esaminati sono risultati negativi, non solo nei confronti del virus responsabile dell'epidemia di influenza, ma anche di altri sottotipi; il risultato complessivo dell indagine risulta quindi epidemiologicamente confortante. Il numero di campioni di specie selvatiche analizzati non è trascurabile, infatti costituisce circa il 73% del totale dei conferimenti, distribuiti in numerose specie. Circa il 70 % di questi campioni riguardano tamponi cloacali eseguiti in passeriformi provenienti dal Sud Italia, mentre il resto riguarda, fondamentalmente, soggetti trovati morti nei territori maggiormente interessati dall'ultima epidemia di influenza e quindi non provenienti da programmi di cattura finalizzati e appositamente programmati per ottimizzare le probabilità di isolare l'agente eziologico. E' quindi venuto in parte a mancare, per le regioni colpite dall'epidemia influenzale, una fonte di informazioni importante quale quella delle ricerche eseguite sui tamponi cloacali. E' noto infatti che, soprattutto per quanto riguarda le specie ritenute reservoir dei virus influenzali, l'infezione segue fondamentalmente un andamento oro-fecale con una mortalità praticamente assente. Di conseguenza, in questo tipo di indagine la realizzazione di tamponi cloacali risulta essere lo strumento di indagine fondamentale. Un dato rilevante è l'elevata percentuale di campioni (52%) provenienti da importazioni da paesi terzi. Tutti i campioni sono stati prelevati all'aeroporto di Milano Malpensa e provenivano da diversi paesi tra cui Cina, Senegal, Mali, Sudamerica; nazioni comunque nelle quali, in molti casi, non sono realizzati controlli rigorosi come nei paesi comunitari e che presentano, in genere, situazioni sanitarie poco note e definite. Considerando l elevata quantità di animali che entra nel nostro Paese per diverse vie commerciali, il rischio di introduzione di agenti patogeni appare decisamente elevato. Anche considerando che l importazione è realizzata sotto vincolo sanitario e che le diverse partite sono comunque sottoposte ai controlli previsti dalla normativa, non si può dimenticare che si prevedono provvedimenti, per quanto riguarda le infezioni virali, soltanto nel caso di isolamento di virus influenzali ad alta patogenicità e di ceppi velogeni di pseudopeste aviare. Dai soli soggetti esaminati nel corso di questa indagine, sono però stati isolati anche tutti i paramyxovirus 2 e 3. Questi risultati coincidono complessivamente con quelli ottenuti in altre ricerche eseguite nel territorio nazionale, dove sono praticamente inesistenti gli isolamenti virali H7 nella avifauna selvatica; dal 1965 al 1999 viene riportato in letteratura un solo isolamento di virus H7N2 in un gabbiano. Nel 2000 sono stati segnalati altri due isolamenti di virus H7N1 in passeri e tortore ma riguardano animali trovati morti nelle vicinanze di due allevamenti infetti durante l'epidemia del Del resto, risulta ridotta anche la percentuale di isolamenti di altri virus influenzali da tamponi cloacali. I risultati degli esami sierologici confermano la situazione epidemiologicamente confortante che si evince dalle indagini virologiche; nessun campione infatti, è risultato positivo per H7 e solo un ridottissimo numero di soggetti sono risultati positivi ad altri sottotipi. Anche in questo caso, i campioni che riguardano la avifauna selvatica non sono numericamente elevati (33% del totale delle analisi). Il resto riguarda soggetti di ripopolamento, fondamentalmente appartenenti ad allevamenti del Nord Italia, controllati ufficialmente per l'influenza. Non sono molto abbondanti anche i campioni prelevati da partite di selvaggina provenienti dalla zona di vaccinazione del Veneto, in quanto solo circa a metà dell'anno 2001 è stata permessa la liberazione di tali soggetti in territorio Lombardo. Da quanto risulta nella presente indagine, non esistono elementi che permettano di ipotizzare un coinvolgimento dei selvatici nella diffusione del virus nella recente epidemia. Sembra inoltre difficile porre in relazione queste specie con l'introduzione della infezione in Italia. Di fatto restano non compiutamente chiarite le eventuali cause della comparsa del primo focolaio. La diffusione del virus tra i differenti focolai, sembra attribuibile fondamentalmente ai circuiti commerciali; la quasi totalità di casi infatti, si è manifestata in allevamenti intensivi nelle zone di maggior concentrazione zootecnica, ed in zone con maggior vicinanza tra insediamenti. Molto basso invece, è risultato il numero di focolai nell'ambito degli allevamenti rurali. Ciò rende più difficile il presunto interessamento dei selvatici nella trasmissione del virus in quanto gli allevamenti intensivi nella zona interessata, sono sostanzialmente tutti isolati dall'ambiente esterno (allevamenti chiusi) e quindi anche dalla fauna selvatica. D'altra parte è stato assodato 11

12 che, nella maggior parte dei casi, la diffusione del virus è stata dovuta alla vicinanza tra allevamenti, al personale e squadre di vaccinazione, ai mezzi di trasporto. A chiudere il quadro complessivo della situazione epidemiologica nel nostro paese, è infine da segnalare che nel corso di ricerche condotte in zone del Centro Sud si sono evidenziate significative incidenze di positività sierologica per influenza tipo A in specie acquatiche selvatiche; è pertanto almeno teoricamente importante mantenere anche in quest'ambito l'attività di sorveglianza e di ricerca. 12