Fattori ambientali che influenzano la crescita microbica Sostanze nutritive: carbonio, azoto, fosforo, zolfo, ioni metallici Temperatura ottimale

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1 Fattori ambientali che influenzano la crescita microbica Sostanze nutritive: carbonio, azoto, fosforo, zolfo, ioni metallici Temperatura ottimale (mesofili: C, psicrofili: 0-10 C, termofili: C) ph ottimale: solitamente neutro, batteri acidofili: ph 1 2, batteri basofili: ph Pressione: di solito pressione atmosferica ma esistono batteri barofili (batteri nei sedimenti marini) Concentrazione salina: ottimale quella fisiologica (0,75% NaCl), ma esistono batteri alofili (15-25% NaCI, batteri marini o di mari salati) e batteri alotolleranti (7-8% NaCl) Pressione osmotica

2 Atmosfera di incubazione Presenza o assenza di ossigeno (aerobi o anaerobi obbligati, aerobi-anaerobi facoltativi) Aerobi obbligati non hanno la fermentazione, ma la fosforilazione ossidativa Anaerobi obbligati hanno la fermentazione, ma non la fosforilazione ossidativa, possono mancare di alcuni enzimi (catalasi, perossidasi, superossido-dismutasi) microaerofili: crescono bene in presenza di CO 2 (10%) L assenza o presenza di ossigeno influenza il metabolismo batterico, soprattutto per la resa energetica. Prendendo ad esempio il metabolismo dei carboidrati (glicolisi), i batteri producono ed immagazzinano energia (ATP) mediante fermentazione, respirazione anaerobia oppure respirazione aerobia. Resa energetica: fermentazione (2 ATP) < respirazione anaerobia < respirazione aerobia (38 ATP).

3 Nutrizione Microbica I batteri per la loro crescita hanno bisogno di: acqua, vari ioni, fonti di carbonio, azoto, energia Fonti di carbonio Autotrofi CO 2 come unica o principale fonte di carbonio per le biosintesi Eterotrofi Fonti di energia Fototrofi Chemiotrofi Fonti di idrogeno o elettroni Litotrofi Organotrofi Molecole organiche preformate ridotte, provenienti da altri microrganismi Luce Ossidazione di composti organici o inorganici Molecole inorganiche ridotte Molecole organiche

4 Principali tipi nutrizionali tra i microrganismi Principali tipi nutrizionali Fotolitotrofi autotrofi Fonti di energia Energia luminosa. Donatore inorganico di idrogeno/elettroni (H/e - ). CO 2 come fonte di carbonio Microrganismi rappresentativi Alghe; Solfobatteri porporini e verdi; Batteri verdi-blu (cianobatteri) Fotorganotrofi eterotrofi Chemiolitotrofi autotrofi Chemiorganotrofi eterotrofi Energia luminosa. Donatore organico H/e-. Carbonio organico (o CO 2 ) come fonte di energia Sostanze inorganiche come fonte di energia. Donatore inorganico H/e -. CO 2 come fonte di carbonio Sostanze organiche come fonte di energia. Donatore organico H/e -. Carbonio organico come fonte di energia Batteri porporini non sulfurei; Batteri verdi non sulfurei Batteri ossidanti lo zolfo Batteri dell idrogeno e del Ferro; Batteri nitrificanti Protozoi; Funghi; molti batteri non fotosintetici I primi 3 gruppi comprendono molti microrganismi ambientali, indispensabili nei cicli della materia (carbonio, azoto, zolfo, fosforo, ferro). L'ultimo gruppo comprende molti microrganismi patogeni o commensali, che soddisfano le loro esigenze contraendo rapporti con organismi superiori (simbiosi, commensalismo, parassitismo, predazione) Batteri esigenti (molti patogeni) richiedono la presenza nell'ambiente di fattori di crescita: sostanze organiche di varia natura (vitamine, aminoacidi, nucleotidi) indispensabili per lo sviluppo (incapacità di sintetizzarle)

5 Elementi principali Carbonio (C) Azoto (N) Zolfo (S) Fosforo (P) Ossigeno (O) Idrogeno (H) Elementi inorganici indispensabili per i microrganismi e loro funzioni Funzione Componente dei composti organici; Fonte di carbonio e di energia Componente dei composti organici. Forme inorganiche (nitrati - NO 3 - e nitriti - NO 2 -) utilizzate come accettori di e - nella respirazione Componente degli aminoacidi metionina e cisteina. Legami S-S contribuiscono a stabilizzare la struttura delle proteine. Alcune forme inorganiche possono essere utilizzate come fonti di energia o come accettori di e - nella respirazione Componente di acidi nucleici e ATP (energia chimica) Componente di numerose molecole organiche. Accettore di e - nella respirazione aerobia Componente della materia organica. Alcuni batteri possono utilizzarlo come fonte di energia L'acqua costituisce un altro elemento fondamentale: acqua libera Solvente, che consente il metabolismo (reazioni metaboliche biochimiche) acqua legata costituente della materia organica Batteri azoto-fissatori Capaci di fissare N 2 atmosferico Fosforo Può essere immagazzinato come materiale di riserva (granuli di volutina)

6 Elementi secondari Magnesio (Mg) Calcio (Ca) Potassio (K) Ferro (Fe) Manganese (Mn) Sodio (Na) Zinco (Zn) Cloro (Cl) Silicio (Si) Elementi inorganici indispensabili per i microrganismi e loro funzioni Funzione Richiesto per alcune attività enzimatiche. Contribuisce a stabilizzare la struttura degli acidi nucleici carichi negativamente Richiesto per la formazione di spore batteriche. Ruolo importante nei movimenti dei microrganismi Ruolo importante nella funzione dei ribosomi. Utilizzato da alcuni batteri per mantenere l'equilibrio osmotico Ruolo importante nel trasporto di elettroni da parte dei citocromi. Influenza la patogenicità dei batteri Può sostituirsi al magnesio nella regolazione di alcune attività enzimatiche Utilizzato da alcuni batteri per mantenere l'equilibrio osmotico. Richiesto da alcuni microrganismi marini Richiesto per la funzione di alcuni enzimi Utilizzato da alcuni batteri per mantenere l'equilibrio osmotico Richiesto da alcune alghe e diatomee

7 Il metabolismo dei microrganismi Cellula insieme di polimeri ordinati altamente improbabile che richiede un continuo apporto di materiali ed energia per mantenersi Metabolismo somma di tutte le reazioni chimiche e biochimiche che avvengono nella cellula, rese possibili dall'apporto di energia e dall'intervento degli enzimi (proteine con funzioni di catalizzatori, che accelerano la velocità delle reazioni a basse temperature) Reazioni di sintesi: anabolismo (richiedono energia) Reazioni degradative: catabolismo (producono energia)

8 Anabolismo (Biosintesi) Livello di organizzazione Cellule Organelli Sistemi sopramolecolari Macromolecole Monomeri o strutture molecolari di base Molecole inorganiche Esempi Batteri, Alghe Funghi, Protozoi Nuclei, Mitocondri Ribosomi, Flagelli Membrane Complessi enzimatici Acidi nucleici, Proteine Polisaccaridi, Lipidi Nucleotidi, Aminoacidi Zuccheri, Acidi grassi CO 2, NH 3, H 2 O, PO 4 3- Costruzione delle cellule Durante le biosintesi un microrganismo, partendo da precursori semplici (molecole inorganiche, monomeri), sintetizza molecole sempre più complesse fino a formare gli organuli e la cellula. Tutto questo richiede grandi quantità di energia libera (ATP e legami ad alta energia) prodotte nel catabolismo. 20 AA migliaia di proteine 4 (5) nucleotidi DNA, RNA monosaccaridi polisaccaridi acidi grassi lipidi

9 Organizzazione dell anabolismo Complessi rapporti tra sintesi e degradazione dei vari costituenti della materia organica. Gli scheletri carboniosi derivano principalmente dall acetil-coa e dagli intermedi del ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA): i precursori sono spesso prodotti in vie amfiboliche Alcune vie biosintetiche hanno percorsi comuni

10 Fasi della sintesi del peptidoglicano Nel citoplasma: 1. Sintesi di UDP-NAG e di UDP-NAM (da UDP-NAG e fosfoenolpiruvato), 2. Aggiunta di 5 AA a UDP-NAM. Sulla membrana interna: 3. Trasferimento di NAM-pentapeptide da UDP a un vettore lipidico della membrana, l undecaprenil-fosfato o bactoprenolo; 4. aggiunta di NAG Bactoprenolo pirofosfato legato a NAM

11 Fasi della sintesi del peptidoglicano Sulla membrana esterna: 5. Trasferimento di NAG-NAM-pentapeptide attraverso la membrana ad opera di bactoprenolo; 6. aggiunta di NAG- NAM-pentapeptide alla catena crescente di peptidoglicano; 7. il bactoprenolo si defosforila e ritorna sulla faccia interna; 8. si formano i legami trasversali ad opera delle transpeptidasi. Il distacco della seconda molecola di D-alanina libera energia utilizzata per l inserimento dei vari frammenti polimerici di peptidoglicano nei siti di allungamento della parete.

12 Antibiotici che inibiscono la sintesi del peptidoglicano Fosfomicina (analogo del fosfoenolpiruvato) blocca la sintesi di UDP-NAM da UDP-NAG Cicloserina blocca la sintesi di D-Ala e la formazione del dimero D-Ala-D-Ala Bacitracina blocca la defosforilazione del bactoprenolo (che non può essere riutilizzato per il trasporto) β-lattamici (penicilline, cefalosporine) bloccano le transpeptidasi Vancomicina (glicopeptide) blocca l'aggiunta di unità funzionali al peptidoglicano complessandosi al dimero D-Ala-D-Ala

13 Catabolismo (3 stadi) Degradazione di molecole complesse in composti più semplici con liberazione di energia, in parte dispersa come calore ed in parte immagazzinata come ATP, e formazione di scheletri carboniosi per le nuove sintesi. Nello stadio 1 non viene prodotta energia

14 Vie di degradazione del glucosio A sx, Glicolisi (via di Embden- Meyerhof-Parnas): da glucosio ad acido piruvico, via + comune A dx, Via del pentoso fosfato (Entner- Doudoroff): può decorrere insieme alla glicolisi Ciclo degli acidi tricarbossilici (di Krebs): da acido piruvico (acetil-coa) Catena di trasporto degli elettroni: massima produzione di ATP Respirazione aerobia: accettore finale O 2 Respirazione anaerobia: accettore molecola inorganica (nitrati, solfati, CO 2, ecc.)

15 Fermentazioni Lattica (omo-, etero-) Acidofili, muffe, protozoi, muscoli Alcolica Funghi, batteri, protozoi, alghe in assenza di O 2 viene utilizzato l'acido piruvico per riossidare NADH Propionica Acido-Mista alcuni Enterobatteri Trasformazioni del piruvato in diversi prodotti finali ad opera dei vari microrganismi. CoA: Coenzima A Acido-Mista alcuni Enterobatteri Acetica I diversi prodotti metabolici servono per la classificazione dei microrganismi: il profilo biochimico di un batterio ne consente l identificazione

16 Identificazione biochimica dei batteri mediante l uso di terreni differenziali Esempio: terreno di Kligler, particolarmente utile per l identificazione di batteri Gram negativi utilizzazione dei carboidrati (glucosio e lattosio): acidità: colore giallo alcalinità: colore rosso produzione di gas: presenza di bolle o rottura dell agar produzione di idrogeno solforato: annerimento in tutto o in parte del fondo

17 Identificazione biochimica dei batteri mediante sistema API 20E Enterobacter cloacae Nei singoli pozzetti sono contenuti diversi substrati (zuccheri, AA, ecc. ) che il batterio può o meno utilizzare per il proprio metabolismo: nel caso di utilizzazione, c'è un cambiamento del ph e quindi dell'indicatore (cambiamento di colore). L'insieme delle singole prove biochimiche fornisce il profilo biochimico-metabolico caratteristico di ogni specie. mediante metodi automatizzati

18 Classificazione e nomenclatura dei microrganismi Tassonomia Scienza che studia la classificazione degli organismi, ossia il loro inserimento, sulla base di determinate caratteristiche, in raggruppamenti omogenei (taxa), nonché la loro denominazione (nomenclatura) Ceppo (stipite): popolazione microbica derivata da una singola cellula (o virione) iniziale Specie: insieme di ceppi che presentano caratteristiche comuni, morfologiche, metaboliche, genetiche, ecc. Specie Genere Famiglia Ordine Classe Philum Regno

19 Classificazione e nomenclatura dei microrganismi Nomenclatura linneiana 2 termini a desinenza latina 1 termine in corsivo (lettera maiuscola iniziale): indica il Genere (es. Escherichia) 2 termine in corsivo (lettere minuscole): indica la Specie (es. coli) Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Escherichia coli Plasmodium falciparum, Herpes simplex, ecc. Attribuzione alla specie sulla base di: - osservazione microscopica (caratteristiche morfologiche e tintoriali) - prove biochimiche (caratteristiche metaboliche e colturali) - caratteristiche genetiche (DNA, RNA, omologia, ecc.)

20 Tassonomia dei procarioti

21 Tassonomia dei procarioti

22 Coltivazione dei microrganismi I terreni di coltura Indispensabili per coltivare i microrganismi in laboratorio (isolamento, identificazione, ecc.). Riproducono artificialmente l'ambiente che può soddisfare le esigenze metaboliche. Diversi tra loro per composizione chimica e stato fisico Terreni sintetici (definiti o minimi): composizione nota - fonte di carbonio (CO 2, glucosio o sostanze organiche più complesse) - fonte di azoto (nitrati, ammoniaca) - sali minerali (solfati, fosfati, tracce di altri ioni, ecc.) -acqua -ph Terreni complessi (o arricchiti o completi): alcuni componenti complessi a composizione non esattamente nota - siero o sangue animale, peptoni, estratti di carne o di lievito, - eventuali fattori di crescita (vitamine, ecc.)

23 Coltivazione dei microrganismi I terreni di coltura Terreni selettivi - contengono sostanze che inibiscono la crescita di certi batteri, consentendo la crescita di altri (antibiotici, sali biliari, coloranti, ecc.) (es. agar di MacConkey) Terreni differenziali - contengono particolari substrati che consentono di rilevare attività metaboliche e possono essere utilizzati per identificazioni presuntive iniziali (es. fermentazione di zuccheri, attività proteasica, DNAsica, ecc.) Preparazione dei terreni - tutti i componenti termostabili + H 2 O miscelati e sterilizzati in autoclave - componenti termolabili sterilizzati per filtrazione, aggiunti sterilmente (a 45 C o a freddo )

24 Coltivazione dei microrganismi I terreni di coltura Terreni liquidi (brodocolture) - consentono la coltivazione dei microrganismi in bottiglie, beute, provette - a partire anche da una sola cellula consentono di ottenerne miliardi in tempi rapidi - la crescita microbica determina intorbidamento del terreno - consentono studi sulla curva di crescita Terreni solidi - terreno liquido + agente gelificante: gelatina (fonde sopra i 28 C, è degradata da numerose specie batteriche) agar (+ utilizzato) farina vegetale polisaccaridica ottenuta da alghe (si scioglie a C, risolidifica a 41,5 C, consente la preparazione di terreni, anche con aggiunta di sostanze termolabili) - consentono la crescita con formazione di colonie ( batteri derivati da 1 sola cellula batterica) - consentono la coltivazione dei microrganismi in provette (es. agar inclinato), capsule di Petri

25 Tecniche di isolamento e coltivazione Ago per la semina Ago per la semina Agar inclinato per la semina in provetta

26 Aspetto delle colonie batteriche Forma delle colonie Margine Profilo Superficie Puntiforme Intero Piatto Liscia, lucida Rotonda Ondulato Elevato Ruvida Rizoide Convesso Rugosa Irregolare Lobato Pulvinato Secca, polverosa Filamentosa Filamentoso Umbonata Eroso

27 a b c Colonie batteriche su Agar MacConkey in capsule di Petri (piastre) a: Escherichia coli b: Salmonella typhi c: Klebsiella pneumoniae

28 Colonie batteriche su agar sangue in capsule di Petri (piastre)

29 Curva di crescita batterica Inoculo iniziale Determinazione del numero di batteri vivi in un sistema chiuso (recipiente chiuso, terreno liquido) incremento dei componenti cellulari, aumento delle dimensioni delle cellule, divisione cellulare, aumento numerico della popolazione

30 Curva di crescita batterica Durata dipende dal tempo di generazione Batteri a rapida crescita (tempo di generazione 20 minuti) Curva: ore Batteri a lenta crescita (tempo di generazione alcune ore) Curva: da 48 ore a diversi giorni o settimane (es. Micobatteri)

31 Colture continue: Chemostato Sistema aperto Apporto di terreno sempre nuovo Allontanamento di cataboliti (tossici o prodotti utili) Allontanamento di batteri in eccesso (molti già morti) La coltura rimane costantemente in fase di crescita esponenziale ("coltura giovane") La velocità di crescita è regolata dal flusso del terreno Il tipo di moltiplicazione assomiglia a quello che si verifica nel corso di infezioni negli organismi animali superiori

32 Colture continue Turbidostato particolare tipo di chemostato fornito di una fotocellula che controlla la torbidità della coltura, regolando di conseguenza il flusso del terreno fresco e l'allontanamento di cellule e cataboliti Questi sistemi consentono di effettuare studi sulle popolazioni microbiche Opportunamente modificati (Fermentatori) vengono utilizzati per la produzione industriale di prodotti microbici, quali: - Antibiotici - Farmaci - Enzimi

33 Tecniche dirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Misure qualitative e quantitative indispensabili per molti scopi - controlli microbiologici di sterilità o di contaminazione Conteggio cellulare: determinazione della concentrazione Conteggio totale: Microscopia Vantaggi: rapidità, fornisce conta totale, permette di osservare la morfologia Svantaggi: non differenzia cellule vive e morte; i batteri sono difficilmente osservabili perchè trasparenti

34 Tecniche dirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Conteggio vitale: Titolazione per diluizione In terreno liquido Aliquote (1 cc) di diluizioni (1:10, 1:100, ecc.) del campione (sospensione batterica), vengono aggiunte a provette contenenti un terreno liquido sterile (limpido). Dopo incubazione, si avrà intorbidamento del terreno dove è arrivata almeno 1 cellula batterica, consentendo di risalire al numero di batteri/ml presenti nel campione iniziale. Tabella statistica di Carpenter Determinazione del MPN (NPP = numero più probabile) Vantaggi: valutazione statistica, senza necessità di conteggio colonie Svantaggi: metodo indaginoso

35 Tecniche dirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Conteggio vitale: Conteggio delle colonie Vantaggi: - distingue cellule vive e morte - consente la ricerca di specifici agenti o gruppi microbici (terreni selettivi) Svantaggi: -consente il conteggio dei soli microrganismi coltivabili Conteggio mediante diffusione su piastra o mescolamento in agar sospensione batterica, a varie diluizioni stratificazione sulla superficie di un terreno solido in piastra o mescolamento con terreno agarizzato liquefatto (42 C), poi versato in piastra incubazione conta n colonie deduzione n batteri

36 Tecniche dirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Conteggio mediante filtrazione su membrana Un volume noto di sospensione batterica o campione liquido viene filtrato su membrane a pori predefiniti (0,45-0,22 µm); la membrana è deposta sulla superficie di un terreno di coltura in capsula di Petri; dopo incubazione si esegue la conta colonie Vantaggio: conteggio di microrganismi in scarsa concentrazione Esempi di colonie su terreni diversi (analisi microbiologica delle acque)

37 Tecniche dirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Conteggio mediante Contatore Coulter Resistenza elettrica: le cellule sono cattive conduttrici di elettricità la sospensione cellulare è fatta passare in una fessura sottilissima con ai lati degli elettrodi; le cellule passando interrompono il campo elettrico con conseguente caduta di voltaggio, proporzionale al volume della cellula, registrata dallo strumento N e forma degli impulsi N e dimensioni delle cellule Svantaggi - conta totale - possibili errori per presenza particelle inanimate

38 Tecniche dirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Determinazione della densità cellulare determinazione del N mediante sistemi fotometrici (torbidità) - Spettrofotometri: turbidimetri, nefelometri Turbidimetria: intensità della luce non deviata (trasmessa) Nefelometria: intensità della luce deviata Relazione tra D.O. e concentrazione batterica (curve di riferimento) Determinazione della Massa cellulare (poco utilizzati) Determinazione del peso secco la sospensione batterica è lavata e centrifugata, asciugata a 100 C (80 C sotto vuoto) e pesata Determinazione del peso umido le cellule sono adsorbite a un filtro di peso noto asciugato a 40 C sotto vuoto e pesato

39 Tecniche indirette per la misura quantitativa di una popolazione microbica Quantificazione di specifici componenti cellulari Possono essere quantificati: Carbonio o azoto organico totale; LPS, lipidi; acidi nucleici (ricerca con nuove tecnologie di Biologia molecolare, quale la Reazione Polimerasica a Catena - PCR), ATP Determinazione del contenuto in ATP ATP associato solo ad organismi viventi (membrana cellulare impermeabile); concentrazione per ogni cellula batterica abbastanza costante: 2-6 nmol per mg - sistema luciferina - luciferasi (lucciole) luciferasi ATP + luciferina ridotta + O > AMP + pirofosfato inorganico + prodotto degradazione + CO 2 + luce apparati fotorilevatori quantità di luce direttamente proporzionale alla concentrazione batterica