Appunti della lezione 10 Coltivazione dei microrganismi

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1 Appunti della lezione 10 Coltivazione dei microrganismi Una condizione necessaria per poter studiare in maniera soddisfacente i microrganismi è poterli coltivare in laboratorio. A questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritive e quali condizioni fisiche essi richiedono. Vaste ricerche hanno determinato le esigenze nutrizionali dei batteri e queste informazioni hanno consentito di sviluppare numerosi terreni o mezzi per la loro coltura. Poiché le esigenze nutrizionali dei batteri variano ampiamente, vi sono notevoli differenze anche riguardo all ambiente fisico che favorisce il loro accrescimento. Esigenze nutrizionali Tutte le forme di vita hanno in comune alcune esigenze nutrizionali riguardo alle sostanze chimiche necessarie per il loro accrescimento ed il loro funzionamento. 1. Tutti gli organismi viventi richiedono una sorgente di energia. Alcune forme di vita possono utilizzare l energia radiante e sono chiamati organismi fototrofi. Gli organismi che ricavano l energia dall ossidazione di composti chimici sono chiamati organismi eterotrofi. 2. Tutti gli organismi viventi hanno bisogno di carbonio sotto qualche forma; tutti richiedono almeno piccole quantità di CO 2, la maggior parte di essi richiede anche alcuni composti organici del carbonio, quali zuccheri e carboidrati. Le piante usano la CO 2 e la convertono in carboidrati tramite la fotosintesi. Anche molti batteri richiedono solo anidride carbonica come unica fonte di carbonio; sotto l aspetto nutrizionale, tutti questi organismi sono autotrofi. Se ricavano l energia dalla luce, sono fotoautotrofi; se invece la ricavano ossidando composti chimici, sono chemioautotrofi. Altri batteri, sotto l aspetto nutrizionale sono simili agli animali, in quanto sono incapaci di utilizzare la CO2 come unica fonte di carbonio e dipendono dagli organismi autotrofi per la produzione di carboidrati e di altri composti organici che usano come alimento. Gli organismi che richiedono una forma organica di carbonio sono eterotrofi. 3. Tutti gli organismi viventi richiedono azoto. I batteri sono estremamente versatili a questo riguardo: alcuni tipi utilizzano l azoto atmosferico, alcuni utilizzano composti inorganici dell azoto e altri ricavano l azoto dalle proteine e da quasi tutti i composti organici dell azoto presenti in natura. 4. Tutti gli organismi viventi richiedono zolfo e fosforo. Alcuni batteri richiedono composti organici dello zolfo, alcuni sono capaci di utilizzare composti inorganici dello zolfo e alcuni sono persino capaci di utilizzare lo zolfo elementare. Il fosforo è di solito fornito sotto forma di fosfati. 5. Tutti gli organismi viventi richiedono parecchi elementi metallici quali sodio, potassio, calcio, magnesio, manganese, ferro, zinco rame, fosforo e cobalto.. Questi elementi sono richiesti in tracce. 6. Tutti gli organismi viventi contengono vitamine e composti vitamina-simili. Nel caso degli animali questi composti devono essere forniti con la dieta. I batteri presentano anche in questo aspetto della nutrizione esigenze variabili. Sebbene tutti i batteri abbiano bisogno di vitamine, alcuni sono capaci di sintetizzare tutte le 1

2 vitamine necessarie partendo da altri composti presenti nel mezzo colturale. Altri non cresceranno se non verranno fornite loro una o più vitamine preformate nel terreno di coltura. Le ricerche sulla nutrizione dei batteri hanno condotto alla scoperta di alcune delle vitamine necessarie agli esseri umani. Anche gli studi sul metabolismo batterico hanno aiutato a comprendere come queste vitamine sono sintetizzate e come funzionano. Nella diap. 4 sono elencate le vitamine più richieste dai batteri per il proprio accrescimento insieme alle specie che presentano l esigenza. 7. Tutti gli organismi viventi richiedono acqua; infatti, tutte le sostanze nutritive devono essere in soluzione prima di poter entrare negli organismi. Tipi nutrizionali di batteri Nella diap. 5 sono riportati i tipi nutrizionali di microrganismi. Tra i batteri fototrofi vi sono specie che utilizzano CO 2 come principale fonte di carbonio; questi organismi sono detti fotolitotrofi. Altri batteri richiedono un composto organico e sono quindi chiamati fotoorganotrofi. I batteri del genere Nitrobacter sono capaci di ossidare i nitriti in nitrati e fissare la CO 2 per soddisfare le esigenze di energie e di carbonio. Thiobacillus thioparus ricava l energia dall ossidazione dello zolfo elementare e dei composti organici dello zolfo. Queste specie sono esempi di organismi chemiolitotrofici. Molti altri organismi chemiotrofi richiedono composti organici del carbonio da cui ricavano energia. Tali specie sono dette chemioorganotrofe. I batteri fotolitotrofi e chemiolitotrofi sono chiamati autotrofi. I batteri fotoorganotrofi e chemioorganotrofi sono detti eterotrofi. Per quanto riguarda la complessità chimica delle sostanze nutritizie necessarie per l accrescimento, gli organismi autotrofi presentano le esigenze più semplici. Per esempio, un terreno di coltura avente la composizione indicata nella diap. 6 sostiene l accrescimento di solfobatteri (batteri ossidanti lo zolfo) autotrofi. Il fatto che un organismo possa accrescersi e riprodursi in tale miscela di composti chimici semplici indica che ha un elaborata capacità di sintesi, cioè che è capace di trasformare questi composti in carboidrati, grassi, proteine, acidi nucleici, vitamine e in altre sostanze altrettanto complesse che costituiscono la cellula vivente. I terreni usati per coltivare gli altri batteri autotrofi somigliano alla formula indicata nella diap.6, ma differiscono in quanto altri composti chimici potrebbero essere sostituiti o aggiunti per soddisfare le specifiche esigenze della specie. Un terreno di coltura costituito da composti chimici noti è un terreno chimicamente definito o sintetico. I batteri eterotrofi sonostati studiati più estesamente degli autotrofi perché i batteri eterotrofi, in un certo senso, ci riguardano da vicino. Infatti, in questo gruppo di batteri si trovano tutte le specie che causano malattie negli esseri umani, animali e piante. Ma ciò non significa che i batteri autotrofi siano meno importanti: al contrario, essi sonodella massima importanza nei processi meno cospicui, ma indispensabili, che si svolgono in natura, quale il riciclaggio degli elementi attraverso i sistemi biologici. I batteri eterotrofi, sebbene costituiscano un importante gruppo nutrizionale, variano notevolmente quanto alle specifiche sostanze nutritizie di cui necessitano per 2

3 l accrescimento (diap. 7). Tutti necessitano di una forma organica di carbonio, ma differiscono nei tipi di composti organici del carbonio che sono in grado di utilizzare. Una diversità ancora maggiore si manifesta riguardo alla loro esigenza di azoto: per alcuni è sufficiente l azoto atmosferico, per altri sono sufficenti i composti inorganici dell azoto, per altri ancora sono necessari uno o più composti organici dell azoto. Alcuni batteri eterotrofi si accresceranno in un terreno di coltura privo di vitamine, mentre altri richiederanno una o più vitamine o sostanze vitamine-simili. Come indicato nella diap. 7, i batteri eterotrofi possono avere esigenze nutrizionali relativamente semplici o complesse, secondo le specie. Nella diap. 8 sono confrontati i terreni di coltura per E. coli e per i lattobacilli. Sia E. coli che i lattobacilli sono eterotrofi, ma è impressionante la differenza nel numero e nella complessità delle sostanze nutritizie chimicamente necessarie per l accrescimento delle specie di ciascun genere. Si confronti la composizione del terreno per la coltivazione di E. coli con quella del terreno riportato nella diap. 6. La differenza importante tra questi terreni è il glucosio: l organismo autotrofo soddisfa tutta la sua esigenza di carbonio con l anidride carbonica (l energia è fornita dall ossidazione dello zolfo), mentre E. coli ricava la maggior parte del suo carbonio dal glucosio e riceve la sua energia dall ossidazione o dalla fermentazione del glucosio. Terreni batteriologici I terreni descritti finora hanno una composizione chimica nota (terreni sintetici o chimicamente definiti) e sono destinati alla coltivazione di specifici tipi di batteri. Occorrono un gran numero di sostanze chimiche pure per coltivare i batteri che hanno le esigenze nutrizionali dei lattobacilli. Per la coltivazione dei batteri in laboratorio si usano certe complesse materie grezze quali i peptoni, l estratto di carne e l estratto di lievito. Terreni di questo tipo promuovono l accrescimento di un gran numero di batteri ed altri microrganismi (diap. 9); si aggiunge l agar come agente solidificante quando si desidera un terreno solido. La presenza di estratto di lievito migliora la qualità nutrizionale del terreno in quanto contiene parecchie delle vitamine B e delle altre sostanze che promuovono l accrescimento. Tipi di terreni colturali. Sebbene la maggior parte dei microrganismi eterotrofi si accrescano bene su agar nutritizio, altri vi si accrescono male o non vi crescono affatto. Infatti, alcuni microrganismi eterotrofi hanno una complessa esigenza di vitamine ed altre sostanze che promuovono la crescita e vengono definiti eterotrofi esigenti. Inoltre, occorrono molti terreni speciali che facilitino il riconoscimento, il conteggio e l isolamento di certi tipi di batteri. Per soddisfare queste necessità si possono utilizzare diversi terreni di coltura i quali, sulla base della loro applicazione o funzione, possono essere classificati come segue: TERRENI ARRICCHITI. L aggiunta di componenti quali il sangue, il siero o gli estratti di tessuto vegetale al brodo nutritizio fornisce altre sostanze nutritizie che conferiscono al terreno la capacità di sostenere l accrescimento dei microrganismi eterotrofi esigenti. TERRENI SELETTIVI. L aggiunta di certe sostanze chimiche specifiche al terreno impedirà l accrescimentodi un gruppo di batteri senza inibire altri. Per esempio, il 3

4 violetto di genziana ad una specifica concentrazione impedirà l accrescimento dei batteri gram positivi senza influenzare quello delle varietà gram negative. In modo analogo, un terreno contenente maltosio come unica fonte di carbonio selezionerà quei batteri che sono capaci di utilizzare questo zucchero. In teoria, si potrebbero selezionare i batteri che sono capaci di accrescersi su composti organici molto insoliti aggiungendo semplicemente questi composti a un terreno ed escludendo tutti gli altri composti del carbonio. TERRENI DIFFERENZIALI. L aggiunta di certi reagenti o certe sostanze chimiche ai terreni può produrre, dopo l inoculazione e l incubazione un tipo di accrescimento o di cambiamento che consente all osservatore di distinguere un tipo di batterio da un altro. Per esempio, se una miscela di batteri è inoculata su agar-sangue, alcuni dei batteri possono provocare l emolisi degli eritrociti. Una zona limpida intorno alla colonia è la prova dell emolisi. In questo caso, l agar-sangue serve nello stesso tempo da terreno arricchito e terreno differenziale. TERRENI DI SAGGIO. Terreni di composizione prestabilita sono usati per il saggio di vitamine, aminoacidi e antibiotici. Sono disponibili anche terreni di particolare composizione per saggiare disinfettanti. MEZZI PER IL CONTEGGIO DEI BATTERI. Particolari tipi di terreni sono usati per determinare il contenuto batterico di sostanze quali il latte e l acqua. La loro composizione deve attenersi a una formula prestabilita. MEZZI PER LA CARATTERIZZAZIONE DEI BATTERI. Un ampia varietà di terreni è impiegata tradizionalmente per determinare il tipo di accrescimento prodotto dagli organismi, come pure la loro capacità di produrre trasformazioni chimiche. TERRENI DI MANTENIMENTO. Per conservare in maniera soddisfacente la vitalità e i caratteri fisiologici di una coltura può essere necessario un terreno diverso da quello che è ottimale per l accrescimento. Un accrescimento rapido e prolifico può essere associato a una rapida morte delle cellule. Per esempio, il glucosio presente in un terreno promuove spesso l accrescimento, ed è probabile che sia prodotto un acido. L esclusione del glucosio è preferibile in un terreno di mantenimento. Un altra distinzione fra terreni può essere stabilita sulla base dello stato fisico. I terreni solidi, quali la fetta di patata, sono impiegati talvolta per la coltivazione speciale di batteri. I solidi liquefattibili sono esemplificati dall agar nutritizio. I terreni semisolidi contengono un piccola quantità (0,5% o meno) di agar, che impartisce una consistenza simile a quella di un budino. I terreni liquidi sono esemplificati dal brodo nutritizio e del latte scremato. Preparazione dei terreni di coltura La preparazione dei terreni implica le seguenti fasi (diap. 11): 1. Ogni ingrediente, o il terreno completamente disidratato, viene disciolto nell appropriato volume di acqua. 2. Si determina il ph del terreno liquido, correggendolo se necessario. Il ph si determina con il piaccametro o con indicatori acido-base. 4

5 3. Si distribuisce il terreno in contenitori adatti, per esempio, bottiglie o beute. 4. Si sterilizza il terreno, di solito in autoclave. 5

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