La fase stazionaria è generalmente immobilizzata su di una matrice inerte quale agarosio, cellulosa, destrano, poliacrilammide, silice.

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2 Cromatografia La cromatografia è una tecnica di migrazione differenziata mediante la quale si possono separare analiti affini presenti in una miscela In ogni tipo di cromatografia si identificano : Una fase stazionaria (liquida o solida) Una fase mobile (liquida o gassosa) che passa attraverso o sulla fase stazionaria Le tecniche cromatografiche permettono di separare diversi componenti presenti in una miscela in base alla diversa ripartizione tra la fase stazionaria e la fase mobile immiscibili tra di loro La fase stazionaria è generalmente immobilizzata su di una matrice inerte quale agarosio, cellulosa, destrano, poliacrilammide, silice.

3 Matrici utilizzate Agarosio Polisaccaride cosituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6- anidro-l-galattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose, Superose, Bio-Gel A Limiti di esclusione kda Cellulosa Polimero di unita glucosidiche unite da legami β-1,4 (legami crociati tramite epicloridrina) Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami β-1,6. E presente in commercio con il nome di Sephadex (legami crociati tramite epicloridrina). Limiti di esclusione kda. Il Sephacryl e costituito da destrano che forma legami crociati con N,N -metilene bisacrilammide. Limiti di esclusione kda. Il Superdex e un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio. Poliacrilammide Polimero di acrilammide e N,N -metilenbisacrilammide. Disponibile in commercio come Bio-Gel P, limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kda Polistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene Silice Polimero prodotto a partire dall acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica

4 Le separazioni cromatografiche si possono effettuare su Colonna: la fase stazionaria è impaccata in una colonna,la fase mobile viene fatta passare attraverso la fase stazionaria per gravità o mediante l utilizzo di una pompa peristaltica Strato sottile (TLC): la fase stazionaria legata ad una matrice viene stratificata su strato sottile su di una lastrina di vetro, plastica o metallo. La lastra viene posta verticalmente in un recipiente contenete la fase mobile sul fondo che salirà per capillarità

5 Cromatografia Mikhail Tswett (1906) Separazione pigmenti vegetali (clorofille, xantofille, ) su colonne di vetro impaccate con carbonato di calcio. pigmenti separati

6 Formatore di gradiente Serbatoio Sistema cromatografico Pompa Colonna Rivelatore Raccoglitore di frazioni

7 Colonne

8 IMPACCAMENTO DELLA FASE STAZIONARIA IN COLONNA Viene di norma eseguito introducendo con delicatezza in colonna (avendo cura di tenere chiusa l uscita) una sospensione della fase stazionaria nella fase mobile Nel corso dell impaccamento è necessario agitare la parte superiore della sospensione e/o tappare la colonna per assicurare che non rimangano bolle d aria nella fase stazionaria La sospensione di fase stazionaria è versata in colonna fino a quando non viene raggiunta l altezza desiderata A tal punto la colonna è messa in flusso con fase mobile aprendone l uscita sino a completo impaccamento Nessuna parte della colonna deve essere lasciata andare a secco Un impaccamento insufficiente produce un flusso irregolare in colonna (channeling) ed una minore risoluzione

9 CARICAMENTO DEL CAMPIONE Si rimuove dalla superficie della resina la maggior parte della fase mobile, aspirandola, e facendo flussare il rimanente in colonna. Il campione è poi applicato con una pipetta e fatto entrare in colonna. Un volume minimo di fase mobile serve infine a lavare le pareti della colonna dall eventuale residuo di campione rimasto. Un volume più cospicuo di fase mobile è stratificato sulla superficie della colonna. In alternativa, la densità del campione può essere incrementata aggiungendovi saccarosio in concentrazione 1% circa. Quando questa soluzione è stratificata sul liquido che ricopre il letto della colonna, automaticamente si disporrà sul fondo ed entrerà rapidamente in colonna. La metodica è valida solo se il saccarosio non interferisce con la successiva separazione ed analisi del campione. Un terzo metodo prevede l utilizzo di un tubo capillare e/o una siringa, oppure una pompa peristaltica per portare direttamente il campione sulla superficie della colonna.

10 SVILUPPO DELLA COLONNA I componenti contenuti nel campione caricato sono separati l uno dall altro dal passaggio del solvente (fase mobile) nella colonna. E fondamentale che l eluizione avvenga a velocità costante, ciò che è facilmente raggiunto eluendo per gravità. POMPE PERISTALTICHE Le pompe più comuni utilizzano tubi di silicone, polivinilcloruro o fluoruro che, compressi a velocità costante da un disco rotante, rilasciano la fase mobile con la velocità di flusso desiderata. Le pompe ed i tubi, di diametro noto, devono essere preventivamente tarati per determinare la velocità di flusso.

11 Formatore di gradiente Colonna Serbatoio Pompa Rivelatore L eluizione può avvenire con un unico tampone (eluizione isocratica) o cambiando il ph, o la forza ionica del tampone (eluizione in gradiente o mediante steps) Raccoglitore di frazioni

12 ELUIZIONE ISOCRATICA Sviluppo della colonna con l utilizzo di un solo solvente ELUIZIONE IN GRADIENTE Si operano variazioni continue di ph, concentrazione o polarità

13 SISTEMI DI RIVELAZIONE La rivelazione può basarsi sull assorbimento nella zona dell ultravioletto, sulla spettroscopia a fluorescenza, su variazioni dell indice di rifrazione, sull emissione di radioattività. I sistemi di rivelazione più comuni registrano l assorbimento di luce nell ultravioletto. Gli strumenti migliori rivelano le proteine nell intervallo nm e nm.

14 B A Formatore di gradiente Pompa peristaltica colonna Collettore di frazioni

15 Cromatografia su strato sottile Thin layer cromatography (TLC): La tecnica è semplice, veloce e permette l'analisi di più campioni contemporaneamente. Rf (fattore di ritenzione o di ritardo) Rf= Distanza percorsa dall analita Distanza percorsa dalla fase mobile

16 Cromatografia su carta

17 Quale è il criterio di separazione in una cromatografia delle diverse molecole presenti in una miscela? Cosa bisogna sapere per poter rendere ottimale la separazione dei diversi analiti?

18 Alla base di qualsiasi tecnica cromatografica vi è la ripartizione di un analita nelle due fasi, mobile e stazionaria, immiscibili tra di loro. Ogni analita avrà interazioni diverse con la fase mobile e con quella stazionaria e quindi avrà un suo coefficiente di distribuzione o ripartizione Kd Il valore di Kd è dato dal rapporto tra la concentrazione dell analita nella fase A e la concentrazione nella fase B. K = d Kd [ A] A [ A] B 0.09 = 0.91 = 0.1 [A]A = 0.09 [A]B = 0.91 Nel caso l analita è ugualmente solubile in entrambe le fasi Kd sarà uguale a1

19 Principio di separazione cromatografica su colonna Un analita, che si muove lungo una colonna, si distribuisce simmetricamente in una banda più concentrata al centro. La sua eluizione può essere rappresentata graficamente da una gaussiana in cui la quantità di soluto è funzione del volume eluito S ml di eluato Distribuzione lungo una colonna cromatografico di un analita con Kd=1

20 Analiti con diversa Kd presenti nella fase mobile caricati su colonna saranno eluiti in volumi diversi A Kd<1 Kd>1 Kd=1 Un soluto con Kd=1 si collocherà nella zona centrale

21 Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco cromatografico. In condizioni cromatografiche ideali il picco cromatografico ha la forma di una curva gaussiana.

22 Altezza del picco(h): distanza tra il punto massimo e la linea di base Larghezza della base del picco (W): lunghezza del segmento interpolato all intersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base (W b = 4 σ) Larghezza a metà altezza: larghezza misurata a metà altezza del picco (W H = 2.354σ) Area totale sottesa: proporzionale alla concentrazione

23 Altri parametri importanti in una separazione cromatografica t R Cromatogramma t M t R Tempo Tempo di ritenzione (t R ): tempo impiegato da ciascun analita ad essere eluito dalla colonna. Tempo morto (t M ): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna. Tempo netto di ritenzione (t R ): tempo trascorso nella fase stazionaria (t R =t R -t M ). Analogamente si definiscono i corrispondenti volumi: Volume di ritenzione o eluizione (V R ): volume di fase mobile necessario ad eluire l analita della colonna. Volume morto (V M ): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

24 Tempo e volume di ritenzione o eluzione (t r e V r ) sono in relazione l uno con l altro tramite la velocità di flusso Fc V r = t r x Fc (Fc = flusso [volume/tempo]) La velocità di flusso dipende dalle dimensioni della colonna, dalle caratteristiche delle particelle che compongono la fase stazionaria, dalla viscosità della fase mobile Il volume di eluizione è correlato al volume della fase stazionaria (V s ), al coefficiente di distribuzione dell analita (K d ) e al volume morto (V M ) che si trova intorno alle particelle impaccate di fase tazionaria Volume morto V r = V M + K d V s

25 Il successo di una cromatografia consiste consiste nel separare completamente un analita da una miscela di composti simili ossia dalla Risoluzione dei diversi picchi cromatografici

26 PARAMETRI CHE DETERMINANO LA RISOLUZIONE CROMATOGRAFICA SELETTIVITA : capacità del sistema di eluire diversi analiti con velocità il più possibile diverse. La selettività si misura come rapporto tra i tempi di ritenzione EFFICIENZA: rapporto tra il tempo di ritenzione e larghezza del picco. E la misura degli effetti di diffuzione. CAPACITA : è la misura della quantità di materiale che può essere risolto senza sovrapposizione dei picchi

27 SELETTIVITA la selettività indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche a velocità il più possibili diverse ed è espressa dal fattore di separazione α = t R2 / t R1 La selettività non è tuttavia sufficiente per una buona risoluzione cromatografica qualora i picchi sono larghi e tali da sovrapporsi

28 Fattori che determinano la risoluzione di una colonna cromatografica Selettività Capacità di separare due picchi

29 EFFICIENZA L efficienza della colonna è correlato al numero dei piatti teorici Una colonna cromatografica si può considerare come costituita da una serie di zone adiacenti in ognuna delle quali l analita si distribuisce all equilibrio tra fase mobile e fase stazionaria. Ogni zona viene detta piatto teorico e la sua estensione è detta altezza del piatto (H) Il numero dei piatti teorici è

30 Maggiore è il numero dei piatti teorici maggiore è l efficienza della colonna quindi aumentando la lunghezza della colonna si possono aumentare il numero dei piatti teorici Ma il limite dipende dai fenomeni di diffusione L altezza equivalente dei piatti teorici(hept) HETP= L/N L= lunghezza colonna N= numero piatti teorici L efficienza della colonna sarà tanto maggiore quanto minore sarà il valore di HETP e quanto maggiore sarà N Colonne efficienti hanno N con valori compresi tra e , l altezza (H) di pochi micron.

31 Risoluzione L effetto della selettività, dell efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione è così schematizzabile: scarsa risoluzione picchi non separati buona risoluzione dovuta a buona efficienza picchi stretti picchi distanti buona risoluzione dovuta a buona selettività

32 Scarsa selettività ed efficienza = picchi non risolti Aumento di efficienza Aumento di selettività Aumento di efficienza ma non di selettività

33 Asimmetria dei picchi cromatografici I picchi cromatografici possono avere una forma gaussiana non simmetrica. Si possono avere due tipi di deformazioni: fronting: il tracciato sale lentamente e scende rapidamente tailing: il tracciato sale bruscamente per scendere lentamente Le cause di fronting e tailing possono essere ricondotte a: Sovraccarico Introduzione del campione lenta o comunque scorretta Adsorbimento irreversibile della sostanza nella fase stazionaria Ridotta solubilità del campione nella fase mobile

34 Riepilogando.. Sviluppo della colonna: questo termine indica il passaggio dell'eluente attraverso la colonna. Volume di eluizione, Ve = volume di fase mobile richiesto per eluire un particolare soluto. Tempo di ritenzione, t R = è il tempo corrispondente per l'eluizione del soluto ad una determinata velocità di flusso. Il flusso dell'eluente deve avvenire a velocità costante => si preferisce usare quindi una pompa peristaltica Lo sviluppo della colonna che prevede l'impiego di un unico solvente come eluente è noto come separazione isocratica. In molti casi, per aumentare il potere risolutivo dell'eluente, è necessario variare in modo continuo il ph, la forza ionica o la polarità del solvente: eluizione tramite gradiente. Per fare un gradiente si devono mescolare due solventi in una opportuna proporzione prima di immetterli nella colonna. Per questo si utilizzano generalmente dei formatori di gradiente.

35 CROMATOGRAFIA SU COLONNA: la fase stazionaria è impaccata in una colonna di vetro o di metallo; la fase mobile la attraversa per gravità o sotto pressione. + rivelatore, registratore, collettore di frazioni

36 Raccolta e analisi delle frazioni l'eluato può essere analizzato in continuo e la frazione contenente un particolare composto essere raccolta appena rilevata. L'eluato dalla colonna viene fatto passare attraverso una cella a flusso di volume molto piccolo (tipicamente 8 mm 3 ) posta nel rivelatore. Il segnale generato dal rivelatore viene registrato e ogni composto emergente è identificato da un picco. Il sistema di rivelazione si può basare sull'assorbimento della luce visibile o ultravioletta, oppure sulla fluorescenza, sulla variazione dell'indice di rifrazione dell'effluente. l'eluato in alternativa può essere suddiviso in tante piccole frazioni che verranno analizzate in una fase successiva. Il sistema che consente di raccogliere l'eluato in una serie di frazioni è detto collettore di frazioni, concepito per raccogliere un determinato volume di effluente di ciascuna provetta prima di spostare nella posizione di raccolta la provetta successiva.

37 pompa/e FPLC colonna Collettore. Rivelatore UV Tipo di tecnica pressione pompe FPLC LP psi peristaltiche FPLC MP psi pistone FPLC HP psi reciprocanti HPLC psi 0.60 registratore

38 Tipo di tecnica pressione pompe FPLC LP10-50 psi tipo di pompa utilizzata: peristaltica B A Formatore di gradiente Pompa peristaltica colonna Pompa peristaltica Collettore di frazioni

39 Colonne

40 Sistema FPLC

41 Sistema AKTA Explorer Tipo di tecnica pressione pompe FPLC HP psi reciprocanti

42 Tipo di tecnica pressione pompe HPLC psi reciprocanti Colonne cromatografiche per HPLC