Report globale conclusivo 25 giugno 2013

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1 Report globale conclusivo 25 giugno 2013 Dr.ssa Lenna Stefania Titolo del progetto: Ruolo di ER stress/upr e dell antigene HLA-B35 nell attivazione delle cellule immunitarie in pazienti Sclerodermici con Ipertensione Polmonare Progetto di ricerca di durata un anno (Luglio 2012-Luglio 2013) svolto presso il Dipartimento di Reumatologia/Arthrithis Center diretto da Proff.ssa Maria Trojanowska, presso la Boston University in collaborazione e coordinamento con Proff.ssa Raffaella Scorza, Fondazione IRCCS Cà Granda, Milano. Questo studio si propone di determinare il ruolo dell ER stress/upr nell attivazione delle cellule del sistema immunitario come possibile processo chiave nello sviluppo patogenetico della Sclerodermia (SSc) associata all Ipertensione Polmonare (PAH). Questo studio inoltre intende correlare la presenza di ER stress/upr con aspetti clinici nei pazienti SSc e di evidenziare l importanza e il ruolo dell antigene HLA-B35.

2 Recentemente abbiamo dimostrato la presenza di ER stress ( stress del Reticolo Endoplasmatico) e UPR ( risposta al misfolding delle proteine) nelle cellule endoteliali che esprimono l antigene di classe I, HLA-B35 (Lenna et al. J Immunol. 2010; Lenna et al. PLoS One. 2013), suggerendo che HLA-B35 possa indurre ER stress anche in altri tipi cellulari, tra cui le cellule del sistema immunitario. Dati recenti dimostrano un ruolo dell ER stress/upr nello sviluppo di varie malattie tra cui l arterosclerosi, il diabete e il cancro, ma i meccanismi molecolari coinvolti non sono ancora noti e possono essere specifici a seconda del tipo cellulare o del contesto fisiologico. Abbiamo cosi deciso di testare ER stress/upr nelle cellule del sangue (PBMC)nottenuti da pazienti con Sclerodermia in forma limitata (lssc). Abbiamo in particolare testato Bip, marker della presenza di ER stress, e vari geni rappresentativi dell UPR: ATF4, ATF6 e XBP1 splicing. PBMC di pazienti lssc presentano livelli elevati di questi ER stress/upr geni. In particolare i pazienti lssc senza PAH ( lssc-nopah) mostrano livelli significativamente elevati di BiP se paragonati ai controlli sani (HC) (p<0.0001). Livelli ancora piu alti sono stati osservati in pazienti con PAH (lssc-pah) (p<0.0001) se paragonati a HC o (p< 0.05) ose paragonati a lssc-nopah ( fig1). Fig. 1. Livelli di mrna di BiP, ATF4, ATF6 e XBP1 splicing in PBMC. PBMC isolati da controlli sani (HC, n=36), pazienti lssc senza PAH (lssc-nopah, n=34) e pazienti lssc con PAH (lssc- PAH, n=32). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR.

3 Abbiamo poi ulteriormente stratificato i campioni in base alla presenza dell antigene HLA-B35, antigene di classe prima. HLA-B35 è stato associato all aumento del rischio di sviluppo dell Ipertensione Polmonare in pazienti sclerodermici e in particolare all induzione di endotelina 1 (ET-1) ( Scorza et al. Ann N Y Acad Sci. 2002; Sanatniello et al. Tissue Antigens. 2006; Lenna et al. J Immunol. 2010). Tra i geni testati solo BiP presenta livelli elevati in PBMC HLA-B35 positivi rispetto ai campioni HLA-B35 negativi, con differenze statisticamente significative (p<0.05) in entrambi i sottogruppi di pazienti Sclerodermici e di donatori sani (fig.2). ATF4 mostra una differenza significativa nel gruppo lcssc-nopah e nei controlli sani (p<0.005 HC B35- vs B35+ e p<0.001 lcssc-nopah B35- vs B35+) ma non nei campioni di pazienti lcsscpah. Inoltre, gli elevati livelli di ATF6 osservati nei pazienti lcssc-pah, non risultano influenzati dalla presenza dell antigene HLA-B35. In contrasto gli individui lcssc-pah HLA-B35-positivi presentano un elevata espressione di XBP1 splicing se paragnati ai pazienti lcssc-pah HLA-B35-negativi (p<0.05) (fig. 2). Fig2. Livelli di mrna di BiP, ATF4, ATF6 e XBP1 splicing in PBMC stratificati per la presenza dell antigene HLA-B35 (B35+). HC B35+ (n = 7), HC B35- (n=29); lcssc-nopah B35+ (n = 12), lcssc-nopah B35- (n=22); lcssc-pah B35+ (n = 14), lcssc-pah B35- (n=18). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR.

4 Questi risultati mostrano che l attivazione di ER stress/upr e associata alla Sclerodermia in forma limitata (lssc), in particolare in pazienti con PAH e suggeriscono un ruolo patogenetico dell antigenehla-b35 nella sviluppo della malattia. Per testare ulteriormente questa ipotesi, abbiamo deciso di utilizzare un analisi di espressione genica attraverso microarray in PBMC ottenuti da pazienti lssc per poter determinare se esiste una particolare attivazione di ER stress/upr nei pazienti con PAH. Abbiamo inizialmente condotto un analisi di microarray in PBMC di controlli sani (HC) trattati con un noto induttore di ER stress (tapsigargina, TG) per 2,4,8,12 e 24 ore. Abbiamo poi selezionato i gruppi di geni maggiormente attivati: geni delle proteine chaperones (HSPs) e geni dell interferone (IFNs) (fig 3). L espressione di tali geni e stata poi ulteriormente verificata attraverso qpcr in PBMC HC trattati con TG ( dati non mostrati). Figure 3. Gruppo delle proteine chaperones (HSPs cluster) e dei geni dell interferone (IFNs cluster) in PBMC di controlli sani trattati con tapsigargina per 2, 4, 8, 12 e 24 ore. Rappresentazione dell espressione dei due gruppi di geni ottenuti dall analisi con microarray.

5 Abbiamo cosi stabilito un ER stress/upr signature nei PBMC ottenuti da controlli sani. Successivamente abbiamo determinato la frequenza di questa signature in PBMC ottenuti da pazienti lssc con e senza PAH. Tra il gruppo di HSPs, solo la classe 40 (HSP40/DNAJ) e risultata elevata in PBMC di lssc. In particolare le isoforme DNAJB1 e DNAJB11. Paragonati a donatori sani, PBMC di lssc senza PAH mostrano livelli elevati di DNAJB1 (p<0.0001) con ulteriore aumento nei pazienti lcssc con PAH (p<0.0001). DNAJB11 è rusultato meno espresso ma comunque elevato nei campioni di pazienti lssc-pah (p<0.05) (Fig. 4). Inoltre, l espressione di DNAJB1 è in correlazione con l incremento della pressione polmonare arteriosa (PAP), indice di severità di PAH dei pazienti lssc (r=0.56, p< 0.05). Figure 4. Livelli di mrna di DNAJ/HSP40 (DNAJB1 e DNAJB11) in PBMC. PBMC isolati da controlli sani (HC, n=36), pazienti lssc senza PAH (lssc- NoPAH, n=34) e pazienti lssc con PAH (lssc-pah, n=32). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. Il grafico (in basso) mostra la correlazione tra pressione polmonare arteriosa (PAP) e i livelli di DNAJB1 in pazienti lssc- PAH.

6 Abbiamo poi ulteriormente stratificato i campioni in base alla presenza dell antigene HLA-B35. E interessante notare che la presenza di questo antigene mostra una correlazione positiva con DNAJB1 in ogni singolo gruppo (p< HC B35- vs HC B35+, p<0.05 lssc-nopah B35+ vs lssc-nopah B35- and lssc-pah B35+ vs lssc- PAH B35-) (Fig.5). La correlazione tra DNAJB1 e severita della malattia (PAP), precedentemente osservata, non è legata alla presenza dell antigene HLA-B35 nei PBMC dei pazienti. Figure 5. Livelli di mrna di DNAJB1 e DNAJB11 in PBMC stratificati per la presenza dell antigene HLA-B35 (B35+). HC B35+ (n = 7), HC B35- (n=29); lcssc-nopah B35+ (n = 12), lcssc-nopah B35- (n=22); lcssc-pah B35+ (n = 14), lcssc-pah B35- (n=18). I Iivelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. Abbiamo testano alcuni dei geni dell interferone identificati nell analisi iniziale di microarray (IFIT1, IFIT2, IFITM1 e IRF4). Tutti questi geni sono risultati altamente espressi nei campioni lssc vs HC. Tuttavia non abbiamo osservato un ulteriore aumento nei pazienti lssc-pah (Fig 6) confermando dati precedentemente pubblicati (Christmann RB. et al. Arthritis Rheum. 2011; Pendergrass S. et al. J Invest Dermatol. 2012; York M. et al. Arthritis Rheum. 2007). Stratificando i PBMC per la presenza di HLA-B35, abbiamo osservato un aumento significativo di IFIT1 in lssc (p<0.05 lssc-nopah B35- vs lssc-nopah B35+ e lssc-pah B35- vs lssc-pah B35+). Interessante e nontare che donatori sani HLA-B35 positivi mostrano bassi livelli di IRF4

7 se paragonati a donatori sani HLA-B35 negativi. Invece i pazienti lssc con PAH presentano valori di IRF4 leggermenti inferriori rispetto ai donatori sani (p<0.001) (fig.7). Figure 6. Livelli di mrna di IFIT1, IFIT2, IFITM1 e IRF4 in PBMC. PBMC isolati da controlli sani (HC, n=36), pazienti lssc senza PAH (lssc-nopah, n=34) e pazienti lssc con PAH (lssc- PAH, n=32). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. Fig. 7. Livelli di mrna di IFIT1, IFIT2, IFITM1 e IRF4 in PBMC stratificati per la presenza dell antigene HLA- B35 (B35+). HC B35+ (n = 7), HC B35- (n=29); lcssc-nopah B35+ (n = 12), lcssc-nopah B35- (n=22); lcssc-pah B35+ (n = 14), lcssc-pah B35- (n=18). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real- Time PCR.

8 Diverse evidenze suggeriscono la presenza di un legame tra ER stress/upr e infiammazione. Sono stati infatti precedentemente osservati elevati livelli di espressione dei mediatori dell infiammazione (IL-6, IL-13, IFN) in PBMC di pazienti lssc con PAH (Christmann RB. et al. Arthritis Rheum. 2011; Pendergrass S. et al. J Invest Dermatol. 2012). Abbiamo cosi testato i livelli di mrna di IL-6 nei nostri campioni. In accordo con le precedenti osservazioni, IL-6 risulta significativamente elevata nei pazienti lssc vs HC (p<0.0001), con massima espressione nei PBMC di pazienti lssc- PAH (fig.8). Inoltre abbiamo riscontrato una correlazione positiva (r = 0.53, p<0.0001) tra IL-6 e BiP nei PBMC di pazienti lssc. Simile correlazione e stata osservata tra livelli di mrna di DNAJB1 e IL-6 ( dati non mostrati). Figure 8. Livelli di mrna di Il-6 in PBMC. PBMC isolati da controlli sani (HC, n=36), pazienti lssc senza PAH (lssc-nopah, n=34) e pazienti lssc con PAH (lssc-pah, n=32). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. Il grafico mostra la correlazione tra BIP e IL6 in pazienti lssc (r = 0.53, p<0.0001)

9 Quando poi abbiamo stratificato i PBMC per la presenza dell antigene HLA-B35, i livelli di IL-6 sono risultati consistentemente elevati in tutti i campioni lssc positivi per HLA-B35 (p<0.05) (fig. 9). Abbiamo poi riscontrato una correlazione positiva (r = 0.38, p< ) tra l espressione di IL-6 e BiP nei campioni PBMC lssc B35+. Risultati simili sono stati ottenuti per ATF4 e ATF6 paragonati a IL-6 (dati non mostrati). Fig. 9. Livelli di mrna di IL6 in PBMC stratificati per la presenza dell antigene HLA-B35 (B35+). HC B35+ (n = 7), HC B35- (n=29); lcssc-nopah B35+ (n = 12), lcssc-nopah B35- (n=22); lcssc-pah B35+ (n = 14), lcssc-pah B35- (n=18). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. La correlazione tra BIP e IL6 in pazienti lssc stratificati per HLA-B35 è mostrata nel grafico da linea rossa. Questi risultati suggeriscono il possibile contributo di ER stress/upr nell aumento dell infiammazione osservata nei pazienti lssc. Inoltre dati pubblicati supportano anche una correlazione tra ER stress/upr e TLR nell induzione dell infiammazione (Lafyatis R. Et al. Curr Opin Rheumatol 2009; Young K.C. et al. Exp Lung Res 2010 ). Allo scopo di approfondire la correlazione tra ER stress/upr signature in lssc e infiammazione, cosi come il rolo dell antigene HLA-B35, abbiamo deciso di utilizzare un inibitore di DNAJB1 (PES) e verificarne gli effetti sui livelli di IL-6 in: - PBMC di pazienti lssc ( con PAH e NoPAH) - PBMC di donatori sani trattati con diversi TLRs - PBMC di donatori sani che overesprimono l antigene HLA-B35.

10 I risultati preliminari riguardanti questa parte del progetto, suggeriscono una stretta correlazione tra ER stress/upr e infiammazione. Come si puo osservare in figura 10, pazienti lssc senza PAH e con PAH trattati con l inibitore di DNAJB1 ( I ) mostrano diminuzione di DNAJB1 e conseguente riduzione di IL-6. Fino ad ora abbiamo potuto analizzare solo 2 pazienti lssc con PAH ( uno non ha mostrato alcuna variazione nell espressione di IL-6 dopo trattamento con l inibitore) e 3 pazienti lssc-nopah ( risultato simile a quello mostrato in figura 10). Inoltre nei campioni analizzati non abbiamo osservato alcuna differenza tra PBMC dei lssc- PAH e NoPAH dopo il trattamento. Questo potrebbe essere dovuto al fatto che questi pazienti presentano livelli simili di DNAJB1 e/o IL-6 ( vedi fig. 4 e 8) oppure potrebbe essere causato dalla presenza o assenza dell antigene HLA-B35 ( vedi fig. 5 e 9). Figura 10. Livelli di mrna di DNAJB1 e IL6 in PBMC di pazienti lssc trattati con inibitore per DNAJB1. Rappresentazione di PBMC di pazienti lssc senza PAH (lssc- NoPAH) e con PAH ( lssc-pah) trattati con l inibitore di DNAJB1 (I, dosi 25uM, 50uM, 100uM per 24 ore). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR.

11 I nostri dati in cellule endoteliali (Lenna et al. Plos One 2013) e dati pubblicati in monociti umani suggeriscono una correlazione tra ER stress/upr e TLR nell induzione dell infiammazione. Abbiamo cosi trattato PBMC di donatori sani con diversi TLRs (Poly(I:C)=TLR3 ligand, LPS=TLR4 ligand, importanti nella patologia della Sclerodermia (Farina G.A. et al. J Invest Dermatol. 2010; Bhattacharyya S et al. Am J Pathol. 2013). Come mostrato in figura 11, sia Poly (I:C) che LPS inducono espressione di IL-6 in dose e tempo dipendente. Figura 11. Livelli di mrna di IL6 in PBMC di donatori sani trattati con Poly (I:C) e LPS. Rappresentazione di PBMC di donatori sani trattai con diverse dosi di Poly (I:C) (100ng/ml, 1ug.ml. 2.5ug/ml) e LPS (100ng/ml, 1ug.ml. 10ug/ml) per ore. I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. Al fine di determinare se ER stress/upr signature influenza la risposta dei PBMC all attivazione dei TLRs, ripetermo il trattamento con TLRs in combinazione con l inibitore di DNAJB1 in PBMC di donatori sani. Ripeteremo inoltre l esperimento con PBMCs ottenuti da pazienti lssc ( con PAH e senza PAH) e analizzeremo l espressione di IL-6, IL-13, e altri geni relativi all infiammazione che sono stati associati a lcssc-

12 PAH. Stratificheremo infine i pazienti per la presenza dell anigene HLA-B35 e ne determineremo il possibile ruolo. Per determinare più approfonditamente il ruolo dell antigene HLA-B35 nella correlazione tra DNAJB1 e infiammazione (IL-6), abbiamo overespresso l antigene HLA-B35 ( e un altro antigene di classe prima HLA-B8, utilizzato come controllo) in PBMC di donatori sani. Abbiamo cosi rilevato elevati livelli di DNAJB1 e IL-6 (fig. 12) come precedentemente osservato in PBMC di pazienti lssc-pah B35 positivi. Interessante e notare la diminuzione dei livelli di IL-6 dopo il trattamento con l inibitore di DNAJB1 ( fig. 13). Figure 12. Livelli di mrna di DNAJB1 e IL6 in PBMC di donatori sani dopo overespressione dell antigene HLA-B35. Rappresentazione di PBMC di donatori sani trattati con lentivirus-hla-b35 ( B8) per 48 ore (dosi 0.1MOI, 0.5MOI, 1MOI). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR.

13 Figure 13. Livelli di mrna di DNAJB1 e IL-6 in PBMC di donatori sani dopo overespressione dell antigene HLA-B35 e trattamento con inibitore per DNAJB1 (I). Rappresentazione di PBMC di donatori sani trattati con lentivirus- HLA-B35 per 48 ore (dosi 0.1MOI, 0.5MOI, 1MOI) in combinazione con inibitore per DNAJ1 (I, dosi 25uM, 50uM, 100uM per 24 ore). I livelli di mrna sono stati misurati attraverso Real-Time PCR. Questi risultati preliminari suggeriscono una stretta correlazione tra ER stress/upr e infiammazione, in particolare tra HSP40 (DNAJB1) e IL-6. Ulteriori analisi verranno condotte espandendo il numero di pazienti in modo da ottenere un numero statisticamente significativo di casi per poter affermare che l induzione di IL-6 dipende dai livelli elevati di DNAJB1.