La combinazione di sorafenib ed everolimus mostra attività antitumorale in modelli preclinici di mesotelioma pleurico maligno

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1 La combinazione di sorafenib ed everolimus mostra attività antitumorale in modelli preclinici di mesotelioma pleurico maligno The combination of sorafenib and everolimus shows antitumor activity in preclinical models of malignant pleural mesothelioma. Pignochino Y, Dell'Aglio C, Inghilleri S, Zorzetto M, Basiricò M, Capozzi F, Canta M, Piloni D, Cemmi F, Sangiolo D, Gammaitoni L, Soster M, Marchiò S, Pozzi E, Morbini P, Luisetti M, Aglietta M, Grignani G, Stella GM. BMC Cancer May 8;15(1):374. Il mesotelioma pleurico maligno non ha attualmente un regime terapeutico del tutto efficace e rappresenta un problema sanitario irrisolto. Anche se la maggior parte dei meccanismi molecolari che portano alla fase di iniziazione del mesotelioma e poi alla sua progressione sono ancora da chiarire, è risaputo che in questa patologia molte vie di segnalazione sono alterate. Una migliore comprensione della biologia del MPM è la priorità sia per quanto riguarda la messa a punto di agenti terapeutici, sia per la selezione dei pazienti che potranno raggiungere un beneficio clinico dalla relativa terapia. A differenza di altri tipi di cancro, la progressione del MPM generalmente non impatta su organi distanti, bensì interessa gli organi vicini alla pleura, principalmente i polmoni e la cavità addominale e peritoneale. Su questa base, è stato quindi ipotizzato che l attivazione della famiglia delle proteine ERM (ezrina-radixina-moesina), presenti nelle zone della membrana cellulare maggiormente coinvolte nei processi di adesione e motilità cellulare, possa avere un ruolo nell indurre un particolare pattern di diffusione locale della patologia. La proteina ezrina gioca un ruolo cruciale nella proliferazione e formazione di metastasi di molti tumori aggressivi (come il sarcoma) ed è attivata tramite fosforilazione durante la crescita cellulare, sia nelle cellule sane che nelle cellule tumorali. Lo stesso gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato per la prima volta che questo pathway può essere un bersaglio terapeutico in modelli preclinici di osteosarcoma, attraverso l impiego dell inibitore multichinasico sorafenib. In particolare, questo composto inibisce proprio la fosforilazione del complesso ERM nei siti critici.

2 E stato quindi sperimentato l effetto antitumorale in vivo ed in vitro di uno specifico inibitore della via di segnalazione di mtor, everolimus, in combinazione con sorafenib. Anche se entrambe le molecole sono attualmente usate in studi clinici di fase II per il MPM, non ci sono ancora dati disponibili riguardo gli effetti della loro combinazione. In questo lavoro, per la prima volta, è stato dimostrato che le proteine della famiglia ERM sono attivate nel MPM ed ezrina, in particolare, ha un ruolo nella proliferazione cellulare e nella migrazione delle cellule del mesotelioma. Inoltre è stato dimostrato che la combinazione di sorafenib ed everolimus ha un attività antitumorale nei modelli preclinici di MPM in vitro ed in vivo. mtor e ERM sono attivati nel MPM umano Sono stati analizzati 30 campioni di MPM (10 casi per ogni sottotipo istologico epitelioide, sarcomatoide, bifasico) derivati da toracoscopie effettuate al dipartimento di pneumologia dell IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia. Tutti i pazienti hanno riferito di avere avuto esposizione occupazionale o ambientale all amianto. Tramite immunoistochimica è stata valutata l espressione di mtor fosforilato e di ERM fosforilato; mtor è risultato essere espresso nella maggior parte dei casi (83%), sia sarcomatoidi che epitelioidi. ERM è risultato presente con un livello di espressione moderato-alto in quasi tutti i campioni (93%), senza l associazione ad un particolare istotipo. Sorafenib ed everolimus inibiscono mtor, ERK1/2 MAPK nelle linee cellulari di MPM L attivazione della cascata dei segnali di mtor e ERK1/2 MAPK gioca un ruolo fondamentale nella progressione tumorale. In modelli preclinici di MPM è stata quindi indagata la druggability di questi pathways molecolari usando sorafenib ed everolimus; il termine druggability indica la capacità di un bersaglio biologico di essere modulato da un ligando, ad esempio un farmaco. Sono state trattate sette differenti linee cellulari di MPM con sorafenib ed everolimus per 24 ore; quindi è stata analizzata l espressione proteica attraverso la tecnica del western blot. E stata confermata una riduzione della fosforilazione dei pathways molecolari di mtor e MAPK in tutte le linee cellulari trattate con everolimus o sorafenib, rispettivamente.

3 Sorafenib ed everolimus inibiscono la fosforilazione di ERM e la migrazione nelle linee cellulari di MPM E stato dimostrato anche come le proteine ERM siano fosforilate nei campioni di MPM; conseguentemente sono stati valutati gli effetti di everolimus e/o sorafenib sull attivazione di ERM nelle linee cellulari di MPM. E stato osservato un lieve incremento della fosforilazione di ERM dopo 24 ore di trattamento con everolimus, mentre sorafenib ha provocato un netto decremento dell attivazione di ERM, sia come agente singolo che in combinazione. E stato inoltre evidenziato come sorafenib ed everolimus da soli ed in combinazione inibiscono la migrazione cellulare, attraverso lo scratch assay, un semplice saggio in vitro che permette di valutare questa capacità. Sorafenib ed everolimus esercitano effetti sinergici sulla crescita e la vitalità delle cellule di MPM E stata valutata l influenza di everolimus e sorafenib sulla vitalità cellulare, esponendo le linee cellulari di MPM a dosi crescenti delle due molecole, da sole o in combinazione, per 72 ore. Sorafenib ha indotto un decremento dose-dipendente del numero di cellule in tutte le linee testate. Il trattamento con solo everolimus ha dato scarsi risultati in merito; il trattamento combinato invece ha dato un grande risultato in termini di riduzione della vitalità cellulare, se confrontato con i singoli agenti. E stata inoltre indagata la capacità di interferire con la crescita cellulare: un trattamento di 10 giorni a basse dosi di everolimus è stato sufficiente a ridurre in modo significativo l area delle colonie cellulari; al contrario, il sorafenib ha mostrato un effetto significativo solo a dosi più elevate. Il trattamento combinato ha dato una risposta potenziata. Everolimus potenzia l effetto pro-apoptico di sorafenib nelle linee cellulari di MPM E stato osservato un decremento nella proporzione di cellule in fase S e G2/M ed un incremento nella proporzione in fase G0/G1, a causa del blocco del ciclo cellulare. Le analisi hanno anche rilevato come nelle cellule trattate con la combinazione delle due molecole vi fosse un contenuto di DNA minore rispetto alle cellule trattate con i singoli agenti. Ciò suggerisce che sorafenib ed

4 everolimus inducono apoptosi nelle cellule del MPM; in realtà sembra che everolimus principalmente potenzi l effetto di sorafenib, inducendo l apoptosi delle cellule di MPM. Gli effetti antitumorali di sorafenib ed everolimus in vivo Basandosi sui risultati ottenuti dagli esperimenti in vitro, è stato valutato il potenziale sinergismo di sorafenib ed everolimus su modelli preclinici di MPM umani ottenuti iniettando sottocute cellule di MPM in topi immunocompromessi. Sorafenib ed everolimus sono stati poi somministrati per via orale, per 4 settimane, osservando come entrambe le molecole abbiano indotto una significativa inibizione della crescita tumorale rispetto ai controlli. La combinazione dei due trattamenti ha ridotto la crescita in modo più evidente, rispetto ai singoli agenti; questo effetto è stato messo in relazione alla maggior presenza di cellule apoptotiche. Inoltre sorafenib ha provocato una netta riduzione dei capillari tumorali; everolimus invece ha causato un debole riduzione della rete vascolare. La combinazione dei trattamenti ha portato ad una deplezione dei vasi sanguigni nell area tumorale quasi completa. In conclusione, everolimus e sorafenib esercitano un attività antitumorale nei modelli preclinici di MPM umano; questi risultati forniscono il razionale per ulteriori indagini cliniche, incoraggiando la pianificazione di trials di fase II con uno schema terapeutico combinato, sorafenib-everolimus, nei pazienti con MPM. VIA DI SEGNALAZIONE mtor: mtor è una proteina chinasi, ovvero una proteina capace di fosforilare altre molecole, regolando la motilità, la crescita, la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule. WESTERN BLOT: tecnica di biologia molecolare che rileva la presenza di una proteina sfruttando l aggancio di un anticorpo specifico contro di essa.

5 SCRATCH ASSAY: test che si effettua graffiando la superficie di una coltura cellulare confluente, utilizzando per esempio l ago di una siringa. Il processo di migrazione delle cellule, fino al momento in cui viene richiuso il graffio causato, viene quantificato tramite analisi al microscopio ottico.