Fosfoetanolamina sintetico induce arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi nel cancro del seno MCF-7 cellule attraverso la via mitocondriale

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1 Fosfoetanolamina sintetico induce arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi nel cancro del seno MCF-7 cellule attraverso la via mitocondriale Figura. 6. ipotetico meccanismo di induzione di apoptosi da Pho-s in cellule MCF-7. Phos entra nella cellula e, una volta nel citoplasma, induce depolarizzazione mitocondriale membrana (DCM), che, a sua volta, aumenta la permeabilità mitocondriale poro di transizione (PTP) e rilasciando citocromo c nel citoplasma. Lì, lungo con caspasi-9, Apaf-1 e datp, si forma il complesso apoptosoma, che può attivare un (*) caspasi-3-come proteine in cellule MCF-7, membrane inducendo fosfolipidi flip-flop che porta alla esternalizzazione della carica negativa associata alla presenza di fosfatidi serina Fosfoetanolamina (Pho-s) è un composto coinvolto nel turn-over fosfolipidico, che agisce come un substrato per molti fosfolipidi delle membrane cellulari. In un recente studio, abbiamo dimostrato che Pho-s ha un effetto antitumorale nelle varie cellule tumorali. In questo studio abbiamo valutato l'attività antitumorale di sintetica Pho-s on MCF-7le cellule del cancro al seno. Qui mostriamo che Pho-s è citotossico di MCF-7 cellule in modo dose-dipendente, mentre è citotossica per MCF10 solo a concentrazioni più elevate. Inoltre, Pho-s induce un perturbazione nel potenziale di membrana mitocondriale (DCM). Inoltre, Pho-s induce i mitocondri aggregati nel citoplasma e frammentazione del DNA di cellule MCF-7 visualizzati mediante microscopia confocale. In accordo con la riduzione su DCM, abbiamo dimostrato che Pho-s induce apoptosi seguito da un aumento in espressione e l'attività del citocromo capase-3-simili in cellule MCF-7. I nostri risultati dimostrano che Pho-s induce un arresto del ciclo cellulare in fase G1 attraverso l'inibizione della ciclina D1 e stimola p53. Un ulteriore punto culminante di questo studio è la constatazione che Pho-s inibisce Bcl-2, inducendo l'apoptosi attraverso lavia mitocondriale. Presi insieme, questi risultati mostrano che Pho-s è un composto promettente nella lotta contro il cancro. 1. Introduzione Il cancro del seno è il secondo tumore più letale per le donne in tutto il mondo. Attualmente, gli approcci convenzionali per il trattamento del cancro al seno comprendono la radioterapia, la chemioterapia, e ormonale.

2 A dispetto di progressi significativi nella primaria e trattamento adiuvante, molti pazienti soffrono di una ricaduta. Inoltre, una resistenza sistemica è sviluppata per questi trattamenti. L'apoptosi svolge un ruolo fondamentale nella rimozione delle cellule indesiderate e l'evasione di morte cellulare è un marchio di garanzia di cancro [4,5]. Un approccio promettente per il trattamento del cancro al seno sarebbe di sfruttare la suscettibilità di queste cellule di farmaci che inducono apoptosi. È allora necessario identificare composti nuovi e più specifici. Nuovi farmaci per indurre la morte cellulare può rappresentare una più efficace come opzioni terapeutiche per il trattamento del carcinoma mammario. Attualmente, analoghi alchil-lysophospholipid (Alpi) rappresentano una nuova classe di lipidi con attività antitumorale. E 'stato riportato che Alpi sono potenti induttori di apoptosi in tumore maligno cellule. A differenza di molti agenti chemioterapici, Il fosfoetanolamina ammina primaria (PEA), un lipide, è un substrato per molti fosfolipidi delle membrane cellulari, in particolare fosfatidilcolina. È stato dimostrato che phospohoethanolamine sintetica (Pho-s), un centro precursore nella biosintesi dei fosfolipidi, riduce l espressione di pro-apoptotica Bad / Bax nelle cellule di melanoma B16-F10 è porta ad un aumento della caspasi-3 attività, innesca l'apoptosi e blocchi il ciclo cellulare sia la S o la fase G2 / M, a seconda della concentrazione del farmaco. Ancora più importante, il trattamento di B16- F10 melanoma-cuscinetto topi con Pho-s portato a inibizione della crescita tumorale, aumento della sopravvivenza e la riduzione delle metastasi. Il scopo di questo studio è stato quello di indagare il potenziale pro-apoptotico l'attività di Pho-s in cellule MCF-7 caspasi-3-carenti, e verificare che si tratta di via caspasi-indipendente. Figura. 1. Pho-s è citotossica per cellule MCF-7. Le cellule sono state piastrate ad una densità di 104 / pozzetto e trattate con Pho-s a concentrazioni crescenti. R. La MTT mostra che 20 mm (IC50) di Pho-s riduce la vitalità delle cellule dopo 24 ore di trattamento. Per il MCF10, prodotto effetti citotossici Pho-s solo ad una elevata concentrazione (100 mm). La vitalità cellulare è espressa come percentuale di cellule confrontando la densità ottica (540 nm) delle cellule trattate con la densità ottica delle cellule non trattate. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti eseguiti in triplice copia

3 2.Efetto della Fosfoetanolamina (PHO-s) 2.1 Pho-s causa cambiamento nella morfologia dei mitocondri e condensazione del DNA Abbiamo anche valutato i cambiamenti morfologici delle cellule con il mode Fluorescenza -, utilizzando DAPI per i nuclei e Rho123 per i mitocondri. Dopo il trattamento con 20 mm Pho-s, sono stati osservati diversi cambiamenti morfologici: condensazione della cromatina e frammentazione del DNA, che sono entrambi tratti distintivi di apoptosi, quando il DNA viene scisso in unità nucleosomal. Inoltre, le variazioni mitocondriali durante apoptosi valutate dalla Rho123 colorazione, hanno mostrato che Pho-s induce una frammentazione e aggregazione dei mitocondri, li ridistribuzione attraverso il citoplasma (Fig. 3), con un conseguente crollo del DCM che è considerato il grilletto morte cellulare per apoptosi Figura. 3. Pho-s induce mitocondriale e la frammentazione nucleare. La morfologia mitocondriale delle cellule MCF-7 è stata valutata dopo 12 ore di trattamento con Pho-s e visualizzati mediante microscopia confocale. Cellule non trattate hanno mostrato normale distribuzione intracellulare peri-nucleare e eterogenea dei mitocondri, mentre in cellule MCF-7 trattate con Pho-s, la diminuzione in DCM è stato seguito da profondi cambiamenti nella morfologia mitocondriale e mitocondri vennero aggregati nel citoplasma. DNA la frammentazione è stato rilevato dal colorazione DAPI. Cellule non trattate presentati nuclei luminosi e intatti con diversi nucleoli, mentre le cellule trattate con Pho-s presentati condensato e nuclei frammentati (frecce) Pho-s induce l apoptosi e il G1 arresto del ciclo cellulare in cellule MCF-7 L'analisi del ciclo cellulare mediante citometria di flusso ha rivelato che le cellule MCF-7 trattati a 60 e 30 mm con Pho-s per 24 h e indotta l apoptosi, riconosciuta come il picco sub-g1, mostrato nell'istogramma (picco blu) (Fig. 4). Infatti, la proporzione di cellule e arrestata nella fase G0 / G1aumentato con il trattamento con concentrazioni superiori, suggerendo che Pho-s ha un effetto doppio, sia inducendo apoptosi e inibendo della progressione del ciclo cellulare (Fig. 4C).

4 Figura. 4. L'apoptosi e arresto del ciclo cellulare indotta da Pho-s. istogrammi A. rappresentativi degli effetti apoptotici di Pho-s in cellule MCF-7. Apoptosi delle cellule sono stati riconosciuti come il cellule nel sub-g1phase (blu di picco). B. Percentuale di cellule nella fase sub-g1. C. Percentuale di cellule arrestate nella fase G1. I dati sono i mezzi? SD *** p <0.001 e ** P <0.001 di almeno tre esperimenti indipendenti 2.3. Pho-s induce la modulazione di proteine coinvolte nella morte cellulare da apoptosi in cellule MCF-7 Per studiare ulteriormente il meccanismo di apoptosi indotta da Pho-s, il coinvolgimento di proteine apoptotiche, Abbiamo scoperto che Bcl-2 espressione della proteina è soppresso significativamente (P <0.001) in seguito al trattamento con30 mm di Pho-s, indicando che Pho-s può ridurre Bcl-2 espressione durante apoptosi (Fig. 5). Per determinare se l aumento della permeabilità mitocondriale indotta da Pho-s e rilevato da analisi Dcm correla con il rilascio di proapoptotica proteine, citocromo c espressione è stata misurata. Abbiamo trovato che il 60 e 30 mm di Pho-s indurre il rilascio del citocromo c dallo spazio mitocondriale inter membrane dopo 12 ore di trattamento, un meccanismo che si verifica durante la morte cellulare mediante apoptosi attraverso la via intrinseca (Fig. 5B). Abbiamo anche studiato se p53 potrebbe essere coinvolta in apoptosi mediata Pho-s. È interessante notare che, in cellule MCF-7 trattate con Pho-s a tutte le concentrazioni, c è stato un aumento significativo (P <0,001) di p53 espressione, coerente con il suo ruolo nella p53-dipendente (Fig. 5C). Per verificare se l'attivazione delle caspasi è coinvolto nel apoptosi indotta da Pho-s, abbiamo esaminato il caspasi-3 con attivazione di un substrato specifico. Scissione del substrato Ac- YVAD-AMC era rilevabile entro 12 ore dopo il trattamento con Pho-s in una dose dipendenti, dimostrando che, nonostante il fatto che MCF-7 non esprime il caspasi-3, Pho-s induce apoptosi da un caspasi-3-come attività (Fig. 5D). Perché Pho-s induce un arresto del ciclo cellulare nella fase G0 / G1, abbiamo ipotizzato che Pho-s potrebbe modulare proteine regolatrici del ciclo cellulare. Abbiamo studiato l'espressione di Cyclin- D1 nelle cellule MCF-7 durante apoptosi indotta da Pho-s. È interessante notare che la diminuzione Cyclin- D1expression e stata osservata dopo un trattamento di 12 h con tutte concentrazioni testate di Pho-s, dimostrando la sua ampia antitumorale potenziale (Fig. 5E).

5 Figura. 5. Pho-s altera l'espressione di proteine coinvolte nella apoptosi e nel ciclo cellulare. MCF-7 cellule sono state trattate con 20 mm di Pho-s per 12 h, quindi sono stati raccolti come descritto in Materiali e Metodi. L'espressione di Bcl-2, citocromo c, p53 e ciclina D1 è stata rilevata attraverso l'analisi di fluorescenza da FACS, mentre caspasi-3 attività è stata misurata mediante un saggio fluorimetrico, utilizzando un substrato specifico, Ac-YVAD-AMC. I dati sono i mezzi? SD *** P <0,001 e ** P <0.001 di almeno tre esperimenti indipendenti