TERMOFILI IPERTERMOFILI 65-95

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1 TMPRATURA Dove c è acqua possono esserci microbi PSICROFILI 0-20 TRMOFILI MSOFILI 8-46 IPRTRMOFILI STRMI IPRTRMOFILI 65-95

2 TMPRATURA Vr = massima Optimum Tasso di crescita Vr aumenta Minimo temperatura Massimo

3 OPTIMUM MASSIMA MINIMA Gelificazione della M.I. I trasporti rallentano la crescita si ferma Denaturazione delle proteine Collasso della M.I. termolisi ALTA NORMAL BASSA

4 Thermus aquaticus Gli enzimi termoresistenti di Thermus aquaticus sono utilizzati per applicazioni biotecnologiche comune negli ambienti idrotermali: optimum di temperatura attorno a 70 C 70 C 30 C Proteine strutturali termostabili enzimi attivi a temperatura alta Lipidi termostabili (archibatteri) Termofili estremi: topoisomerasi inversa Introduce giri positivi Chaperonine particolari e abbondanti Proteine protettive per il DNA Magnesio (stabilizza il DNA neutralizzando i fosfati)

5 Il limite minimo è correlato alle modificazioni della capacità di solvatazione dell acqua Altera le interazioni idrofobiche Psychromonas ingrahamii (-12 C) Le alte temperature uccidono le cellule batteriche Basse temperature non uccidono Shock termico può uccidere

6 PRSSION

7 PRSSION Pressione Barofili estremi Barofili moderati Non barofili

8 Gli involucri esterni e la membrana, permeabili all acqua proteggono i batteri dallo schiacciamento La pressione agisce impedendo che il volume molecolare aumenti Inibita dalla pressione Forma base Forma attivata Favorita dalla pressione

9 Saccharomyces non cresce oltre le 8 atmosfere I barofili estremi non crescono sopra le 400 atmosfere hanno una membrana particolarmente ricca di acidi grassi insaturi più fluida e meno soggetta a variazioni di conformazione sotto pressioni elevate

10 Pressione osmotica La quantità di acqua FFTTIVAMNT disponibile in un substrato Viene detta water-activity (A w ) d è definita dal rapporto pressione di vapore della sostanza/pressione di vapore dell acqua pura A w = P/P 0

11 I valori di Aw sono compresi tra 0 e 1 La maggior parte dei microrganismi Necessita di Aw 0,98 (valore dell acqua marina) Microrganismi alofili estremi riescono a vivere fino a 0,75

12 1,0 ACQUA PURA 0,99 SANGU 0,90 SCIROPPI PROSCIUTTO BATTRI 0,95 PAN 0,85 SALAMI 0,80 DOLCI DI FRUTTA MARMLLAT FUNGHI 0,75 PSC SALATO 0,70 GRAND LAGO SALATO CRALI FRUTTA SCCA Procarioti ALOFILI Soprattutto archibatteri

13 I microrganismi che vivono in ambienti con bassa Aw estraggono acqua dal mezzo circostante mantenendo inalterata la concentrazione salina interna L acqua non può essere trasportata, deve entrare nella cellula per diffusione Lo scopo quindi deve essere raggiunto giocando con la concentrazione e il trasporto di ioni e soluti

14 I microrganismi alotolleranti sintetizzano o concentrano soluti organici che non danneggino i processi biochimici interni si tratta in genere di zuccheri (saccarosio, mannitolo, glicerolo) o aminoacidi (prolina) e derivati (betaina) e vengono definiti soluti compatibili H 2 O Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ La concentrazione intracellulare dei soluti compatibili richiama acqua all interno della cellula

15 la maggior parte degli ambienti naturali ha ph compreso tra 5 e 9 H 2 SO 4 CaCO 3 H 2 O ACIDOFILI 1-5,5 ALCALOFILI 8,5-11,5 I batteri crescono in un intervallo di 2-3 punti di ph in cui è compreso il valore ottimale per la crescita NUTROFILI 5,5-8

16 Il ph intracellulare deve essere vicino alla neutralità Limite minimo conosciuto: 4,6 (acidofili estremi) Limite massimo conosciuto: 9,5 (basofili estremi)

17 Ambienti caratterizzati da ph estremi acido Acidofili estremi Sorgenti acide Acidofili Acque acide di miniera neutrofili alcalofili Laghi alcalini basico Alcalofili estremi

18 I batteri possono vivere in un intervallo di ph più vasto di quello tollerato dalle loro proteine I meccanismi di efflusso ionico sono molto efficienti per mantenere il ph interno. coli cresce tra ph ,8 5,8 5,7 6 3,3

19 LAGHI ALCALINI (soda-lakes) Fortemente basici > ph 9 elevate concentrazioni di bicarbonato e soda caustica I microrganismi alcalofili sono tutti procarioti (soprattutto archibatteri, ma anche Bacillus e cianobatteri) Devono pompare via gli ioni idrossile (OH-) che neutralizzerebbero i protoni interni distruggendo il normale metabolismo che dipende dai gradienti protonici OH - le membrane di questi microrganismi sono modificate, per combattere l azione degli alcali che saponificano i grassi

20 I batteri acidofili si trovano soprattutto nelle ACQU ACID DI MINIRA ph fortemente acido Quando giacimenti di carbon fossile vengono aperti, la pirite che si trova nel carbone e nelle rocce circostanti A contatto con l aria si ossida FeS 2 H 2 SO 4

21 LA CONOSCNZA DLL SIGNZ NUTRIZIONALI DI MICRORGANISMI indispensabile per la coltivazione in laboratorio Che fornisce informazioni sulla fisiologia permette di ottenere biomassa

22 Una curva di crescita "standard" (sistema chiuso) prevede diverse fasi, correlate La crescita di una coltura è rappresentata dall aumento del numero delle cellule al consumo dei nutrienti all accumulo dei prodotti di scarto A diverse velocità di crescita corrispondono diverse quantità di ribosomi, DNA e proteine Le cellule che crescono velocemente sono più grandi la curva di crescita è riferita alla POPOLAZION e si segue attraverso la variazione del numero di Unità Formanti Colonia (UFC)

23 1-Fase di latenza (lag) Corrisponde al tempo necessario alle cellule batteriche per adeguarsi alle condizioni del terreno La sua durata dipende dal tipo di inoculo (età, entità) dalla natura del terreno latenza

24 La Fase di latenza è un esempio di crescita sbilanciata Passando a un ambiente PIU ricco alcuni componenti sono sintetizzati e altri no prima di moltiplicarsi vanno sintetizzati nuovi ribosomi per adeguare il ritmo della sintesi proteica alle nuove disponibilità Terreno povero Terreno ricco

25 Passando a un ambiente MNO ricco le cellule si adeguano al nuovo stato Terreno ricco Terreno povero non si moltiplicano finchè non siano stati prodotti gli enzimi biosintetici necessari a sopravvivere

26 Se la coltura è invecchiata o danneggiata È necessario riparare i danni prima che possa iniziare la moltiplicazione

27 2-Fase esponenziale (log) la crescita raggiunge la massima velocità possibile la popolazione cellulare è uniforme (adatta per studi biochimici e fisiologici) logaritmica la fase esponenziale è un esempio di CRSCITA BILANCIATA in cui tutti i componenti cellulari sono sintetizzati a velocità costanti e coordinate

28 3-Fase stazionaria i batteri arrivano a densità di popolazione di circa 10 9 cellule/ml, alghe, miceti e protozoi a circa 10 6 una coltura entra in fase stazionaria a causa della deplezione in nutrienti (o in O 2 ) o dell accumulo di metaboliti tossici (es ac lattico) stazionaria

29 4-Fase di morte accelerata se le cellule non lisano questa fase può essere inapparente ( per avere dati precisi si può fare la conta delle UFC) 4 A volte può esserci una fase di sopravvivenza

30 Lo studio della curva di crescita permette di sorvegliare lo stato della coltura Per motivi pratici, si esegue spesso rilevando l assorbanza della coltura stessa Con questa tecnica, la curva assume un aspetto diverso

31 Una curva particolare è la diauxia la popolazione batterica esaurisce un primo nutriente ntra in una seconda fase lag Sintetizza gli enzimi necessari a utilizzare un altra fonte di carbonio (inducibili) riprende a crescere secondo la normale curva

32 COLTUR SINCRON La sequenza di quel che accade durante la crescita di una popolazione batterica Si può seguire con precisione in una coltura sincrona La sincronia si perde dopo 2-3 generazioni che può essere avviata con mezzi fisici (filtrando per selezionare le cellule più piccole) O limitando i nutrienti

33 La velocità di crescita può essere calcolata con l equazione n = logn log N0/0,301 n = numero di generazioni N = numero di cellule valore di n in un intervallo di tempo definito Tempo generazionale log 2 x intervallo tempo logod(2)-logod(1) Quanto tempo impiegherà la mia coltura ad arrivare a una certa densità? Tgen*logOD(?)-log OD(obs) log(2)

34 COLTUR CONTINU Per studiare la crescita microbica in condizioni di nutrienti basse, simili a quelle naturali È utile ottenere colture che restino in fase esponenziale, crescendo a velocità nota Questo è possibile nel CHMOSTATO TURBIDOSTATO

35 CHMOSTATO motore aria Terreno sterile crescita scarto

36 CHMOSTATO TURBIDOSTATO il terreno contiene un fattore limitante Non ci sono fattori limitanti nel terreno il tasso di crescita dipende dalla velocita di immissione di terreno fresco la diluizione del terreno varia a seconda della velocità di crescita della coltura Il tasso di crescita viene mantenuto costante la torbidità viene mantenuta costante

37 Nel ciclo cellulare di. coli si possono distinguere diversi momenti I C D variabile 40 min 20 min Fase I (interinizio) la cellula si prepara alla replicazione del DNA Si osserva in cellule che si dividono lentamente (T>60 ); Fase C (copia) periodo necessario a replicare il DNA. Il limite è rappresentato dalla velocità di sintesi della DNA polimerasi Fase D (divisione): tra il completamento della replicazione del cromosoma e la divisione delle cellule figlie

38 La velocità di divisione può essere inferiore ai 40 minuti necessari per la duplicazione del cromosoma infatti diverse replicazioni si avviano in sequenza rapida, e il cromosoma che entra in una cellula figlia ha già intrapreso una nuova duplicazione

39 La divisione di una cellula comporta la formazione di un setto, che avviene quando la distanza tra il centro dei due nucleoidi è pari a una lunghezza cellulare 1L

40 La forma della cellula batterica si mantiene durante la divisione La cellula si allunga; il cromosoma si duplica, restando attaccato alla membrana I nucleoidi si separano la proteina FtsZ forma un anello (Z-ring) nello spazio tra i nucleoidi, e recluta altre proteine che partecipano alla formazione del setto

41 La formazione dello Z-ring è dovuta alla capacità della proteina FtsZ di polimerizzare Z-ring FtsZ-GFP La sintesi parte da un sito del setto a livello della membrana citoplasmatica e prosegue nelle due direzioni, a formare l anello

42 L anello si stringe progressivamente Forzando la membrana citoplasmatica verso l interno il setto si completa, si formano due pareti distinte e le cellule figlie si separano la divisione avviene sempre e solo dopo la duplicazione del DNA (se la sintesi di DNA si blocca la divisione non ha luogo)

43 nei batteri bastoncellari il setto si localizza esattamente al centro della cellula SI NO Il corretto posizionamento del setto è dovuto a : OCCLUSION DL NUCLOID SISTMA Min

44 OCCLUSION DL NUCLOID La presenza del nucleoide in una regione inibisce la formazione del setto Nella regione mediana la concentrazione del DNA è diminuita per la separazione del nucleoidi: il setto è libero di formarsi

45 Le estremità della cellula (poli) sono libere dal nucleoide e potenziali siti di formazione del setto Ma la formazione di un setto in corrispondenza di un polo provoca la formazione di minicellule (piccole e prive di cromosoma) minicellula

46 SISTMA Min: impedisce che il setto si formi alle estremità della cellula MinC MinD Min MinC inibisce FtsZ; non è in grado di spostarsi all interno della cellula MinD è una ATPasi che si associa a uno dei poli della cellula, lega MinC e la attiva (complesso MinCD) Min forma un anello all estremità della zona occupata da MinD

47 L interazione Min/MinD provoca il distacco di quest ultima dalla membrana Di conseguenza, anche MinC si stacca Man mano che le unità di MinD si staccano dalla membrana, l anello di Min si sposta verso il polo quando l anello raggiunge il polo, si disgrega

48 MinD, liberata da un polo, raggiunge l altro spostandosi a spirale lungo la membrana e si lega, legando e attivando MinC Min torna a formare l anello all estremità della zona di legame di MinD L oscillazione si sussegue con un periodo di circa 30

49 La presenza di MinCD ai poli impedisce a FtsZ di reclutare le altre proteine per formare il setto durante un ciclo cellulare, quindi, la presenza di MinC attivata è statisticamente maggiore ai due poli

50 In alcuni casi la parete è formata da due strati e solo quello interno partecipa alla formazione del setto Quando il setto si ispessisce rompe la parte esterna della parete su un solo lato le due cellule figlie si allontanano facendo perno sul lato opposto a quello della rottura Questo meccanismo è detto divisione a scatto

51 DIVISION POLAR A volte la crescita e la divisione della cellule batteriche sono polari La divisione per gemmazione è uno di questi casi

52 LA DIVISION INGUAL PRMTT L VOLUZION DI UNA DIVRSA COMPLSSITÀ STRUTTURAL Nitrobacter: le lamelle di invaginazioni della membrana non sono presenti al polo della cellula da cui si origina la gemma

53 gemmazione Gemmazione con ifa

54 Anche il processo di sporificazione è una divisione ineguale Come tutti i batteri, gli sporigeni si dividono solitamente per schizogonia Ma in condizioni di carenza di nutrienti o di altri tipi di stress ambientali O in colture molto affollate, si innesca il processo di sporulazione VII- rilascio VI- maturazione II-Divisione asimmetrica V- tuniche III- Protoplasto prespora IV- Parete e cortex

55 Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus: alternanza delle forme prostecata e flagellata

56 Il ciclo vitale di Streptomyces uno dei cicli più complessi tra i procarioti 1) Micelio del substrato Un micelio vegetativo (Micelio del substrato) formato da ife intrecciate, dà luogo a una colonia Le ife si affondano nel terreno, traendone i necessari nutrienti Nel micelio del substrato i filamenti non sono settati e intrecciandosi danno alla colonia una consistenza compatta lo sviluppo coordinato multicellulare porta alla produzione di antibiotici e, contemporaneamente, inizia a comparire un micelio aereo specializzato

57 2) MICLIO ARO Quando le ife aeree sono cresciute, inizia un secondo momento di sviluppo che porta a una nuova e articolata regolazione della crescita, del ciclo cellulare e dei processi di morfogenesi Quando si formano gli sporofori (e poi le spore) la colonia assume un aspetto polveroso

58 ANCH IL CICLO VITAL DI MYXOBATTRI COMPLSSO Inizio del differenziamento Corpo fruttifero germinazione sciame

59 Il ciclo vitale dipende dalle possibilità che l ambiente offre variazioni ambientali Necessità di modulare le attività cellulari QUALITATIVA Modulazione dell attività enzimatica Scelta del set di enzimi utili a seconda delle situazioni QUANTITATIVA Modulazione della quantità di enzima

60 MODULAZION DLL ATTIVITÀ NZIMATICA le proteine possono cambiare conformazione SSR ATTIVAT SSR INIBIT ACQUISIR CAPACITA NUOV (LATNTI) ATTRAVRSO IL LGAM CON FFTTORI ALLOSTRICI (LIGANDI) positivi negativi Il sito di legame per l effettore non coincide con il sito catalitico dell enzima Il legame con l effettore modifica Velocità di reazione (Vmax) Affinità per il substrato (Km)

61 Inibizione a FD BACK RGOLAZION DLL ATTIVITA NZIMATICA Se il prodotto finale di una biosintesi è in eccesso o se è disponibile nell ambiente, il processo non è più conveniente QUANDO IL PRODOTTO SI ACCUMULA si lega a uno degli enzimi della catena, causandone l inattivazione la reazione enzimatica cessa e non si forma più prodotto

62 Non tutti i geni sono espressi nello stesso modo nzimi particolari Poco espressi Proteine house-keeping: molto espresse