Micotossine & Vacche da latte

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1 Micotossine & Vacche da latte ISTITUTO DI SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA FACOLTÀ DI UNIVERSITÀ CATTOLICA DEL SACRO CUORE PIACENZA

2 Sommario Breve introduzione a problema Micotossine Micotossine comuni AFLA ZEA Tricoteceni(DON; T-2 & HT-2; DAS) Fumo OTA Effetto sinergico delle micotossine Effetto dei bassi dosaggi Micotossine nascoste Micotossine dei Foraggi

3 Micotossine Metaboliti secondari prodotte da funghi filamentosi Tossici per gli organismi superiori «Micotossicosi» intossicazione causata da micotossine Più frequente effetti Indiretti: Immunodepressione: causa od effetto?

4 Micotossine e ruminanti «the dose makesthe poison» Esposizione costante a micotossine, ma raramente dosi alte Difficoltà nell «imputare» effetto alle micotossine Difficoltà nel «isolare» effetto dovuto a micotossine Difficoltà nel «quantificare $» danni dovuti alla presenza di micotossine negli alimenti

5 Principali Funghi micotossicogeni Genere Specie Micotossine Aspergillus A. flavus A. parasiticus AflatoxinB1, B2 AflatoxinB1, B2, G1, G2 A. ochraceus Ochratoxin A. nigri Ochratoxin Penicillium P. verrucosum Ochratoxin P. expansum Patulin Fusarium F. culmorum F. graminearum F. verticillioides F. proliferatum Tricothecenes, Zearalenone Tricothecenes, Zearalenone Fumonisin B1, B2, B3 Fumonisin B1 Claviceps C. purpurea Alcaloids(ergoline, ergotammine)

6 Funghi visti da vicino Penicillium spp. Fusarium spp.

7 Micotossine: situazione mondiale AllAboutFeed, :17-20

8 Micotossine: presenza negli alimenti Origine DON ZEA FB1+FB2 T-2 + HT-2 OTA Ue company 46% 90% 1% 0% 18% Italia 62% 40% 73% 11% 15% Totale (12000 campioni) 79% 55% 20% 4% 15% Dati FEFAC, 2008

9 Micotossine: Dove, come, quando?

10 Micotossine e Ruminanti Diete per ruminanti Concentrati Sottoprodotti Foraggi Esposizione ampia gamma di micotossine Rumine: difesa attiva

11 Micotossine e Ruminanti Microflora complessa: Batteri /ml Protozoi 10 6 /ml Lieviti 10 4 /ml

12 Metabolismo ruminale delle principali micotossine Mycotoxin Estimates of Degradation Derivatives AFB % Aflatoxicol DON 0-50 % DOM1 ZEA 0-90 % α- and β- Zearalenol T-2 Toxin 0-70 % Acetyl T-2, HT-2 acetyl HT-2 OTA % Dihydroxyioscounmarin FUMO 0-35 %

13 Quali sono i loro effetti sugli animali? 1. Rifiuto dell alimento 2. Immunodepressione,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 1. Maggiore suscettibilità alle malattie 2. Riduzione delle performance produttive e riproduttive 3. Aumento della mortalità

14 Tossicità delle Micotossine

15 Aflatossine: da chi sono prodotte? Genere Aspergillus spp. (Funghi filamentosi) Cresce in zone tropicali e sub-tropicali Fungo di stoccaggio ma Puòinfettare le piante in campo, durante il trasporto e lo stoccaggio degli alimenti

16 Aspergillo: condizioni di crescita Fattori che favoriscono lo sviluppo Temperatura 37 C Specie Italiane anche C Umidità 15-18% Aw >85% CO2 <20% O2 >10% (<1% No crescita) Principali specie A. flavus e A.parasiticus Anche A. nomius, A. bombycis, e A. tamari

17 Aflatossina: condizioni di produzione Metabolismo secondario e relazioni con ambiente esterno Presenza del fungo Fattori che favoriscono la produzione non certe!!! Temperatura C Specie Italiane C Umidità granelle C Aw >85%

18 Principali Aflatossine Aflatossine Madri Idrofobiche AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 O O O O O O O O OCH 3 O O OCH 3 AFB 1 AFB 2 O O O O O O O O O O OCH 3 O O OCH 3 AFG 1 AFG 2

19 Principali alimenti contaminati Alto rischio di contaminazione (dal campo) MAIS e sottoprodotti 25% COTONE e sottoprodotti 36% Arachidi 41% Prodotti vegetali suscettibili (condizioni di stoccaggio) Soia e sottoprodotti Cereali (orzo, frumento, triticale, riso)

20 Principali alimenti contaminati Matrice N campioni Media ± D.S. (µg/kg) Mediana (µg/kg) Range (µg/kg) Mais ± < Mais germe ±11.31 < Mais semola glutinata ± < Mais glutine ± < Mais tutoli 2 < 0.1 < 0.1 < 0.1 Cotone semi ± < Cotone F.E ± Girasole F.E ± < Girasole bucce <0.1 Colza F.E ± Lino < Cocco Soia F.E < Distiller <0.1 < Arachide Sorgo <0.1 Cacao Palma Citrus pulp <0.1 Dati forniti dal prof. Pietri

21 La realtà Italiana Principale coltura: MAIS da granella Temperatura 37 C Specie Italiane anche C Umidità 15-18% CO2 <20% O2 >10% (<1% No crescita) Rischio di contaminazione Silomais --- Pastone integrale -- Pastone di granella - Granella +++

22 Raccolta del Mais Raccogliere ad umidità superiore del 18% Preferibilmente 20-28% Rapida essicazione delle Granelle (attenzione a trasporto!!!) Evitare rottura delle granelle (Piralide, rotture meccaniche)

23 La realtà Italiana: il caso del 2003 Indice di aridità (Battilani et al., 2007) < > 700 < > 700 < > 700 < > 700

24 Aflatossicosi Varia con dose, tempo di esposizione, specie, età, stato sessuale, nutrizionale, etc. Principali organi bersaglio (Fegato e Reni) Segni clinici: anoressia peso corporeo produttività (uova o latte) emoraggie, embrio-tossicità performance riproduttive suscettibilità malattie

25 Aflatossicosi Epatotossica Epatocarginogenica Neurotossica Nefrotossica Emotossica Enterotossica 0steotossica Immunosoppressiva

26 Aflatossicosi Foto riprodotta da presentazione di D.E. Diaz

27 Effetto delle AFLATOSSINE sulle vacche Il rumine è un detossificatore? Effetti sugli animali dipendono: Dose somministrata Durata dell esposizione Fattori di stress Ingestione di altre micotossine (Simbiosi, eff. Additivo, Antagonismo)

28 Aflatossicosi in Vacche AFB1 nei mangimi 700 ppb (35 volte il limite di legge) Anoressia Riduzione performance produttive Insorgenza malattie AFB1 nei mangimi ppb (5-15 volte limite di legge) Aumento dimensioni del fegato (dismetabolie???)

29 Aflatossicosi nelle vacche Prova di Campo (USA, 1979) Contaminazione della dieta 120 ppb Effetti misurati Dopo sospensione, aumento del latte del 25%

30 Aflatossicosi nelle Vacche Prova di campo (USA, 1979) 120 vacche in mungitura Contaminazione unifeed 20 ppb Effetti misurati Riduzione ingestione di alimenti Riduzione produzione di latte

31 Aflatossicosi Lavori datati Livelli alti Risposta dose-effetto non lineare Non investigata presenza di altre micotossine Si ha una risposta chiara? NO!

32 Metabolismo dell Aflatossina Ingestione, contatto e inalazione

33 Assorbimento dell AFB1: comparsa ematica (6h) 600 ppt Vitamina A Retinolo-Palmitato 400 Inizio transito dal rumine minuti dal trattamento AFB1 AFM1

34 Assorbimento dell AFB1: comparsa ematica (30 ) AFB1 e AFM1 (ng/l) AFB1 AFM minuti

35 Legislazione mondiale International Agency for Research of Cancer classifica le AFLATOSSINE (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 e AFM1) sicuri cancerogeni per l uomo (gruppo 1)

36 Legislazione Europea DIRETTIVA 2003/100/CE

37 Legislazione Europea REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006

38 Escrezione dell Aflatossina L AFB1 viene idrolizzata e/o coniugata Meccanismo di escrezione Feci:55-80% Urine:10-20% Carni:<1% Latte: 1-3%

39 Escrezione dell AFB % Bile e Feci (Wong and Hsieh, 1980; Coulombe and Sharma,1985) Escrezione AFs % Urine (Eaton et al., 2004; Yannikouris and Juoany, 2002) Latte Animali in lattazione AFB1- glutatione (CAST, 2003) % 4-15 % AFB1- glucuronide (Holenski et al., 1987) % less 10 % 16 % AFM1 AFP1 (Groppman, 1988) AFB1-N 7 - Guanina AFM1 Carry Over 1-3 %

40 Carry over del AFM1 Unica dose 0,02 A FM 1 (µ g /m ll ) 0,015 0,01 0, h

41 Carry over dell AFM1 Ingestione continuata Rapido aumento, ma anche rapida riduzione (4-6 munte) 80,0 70,0 Inizio ingestione Fine ingestione 60,0 Milk AFM1 (ng/l) 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0, Days (n ) Masoero et al., 2007

42 Carry Over dell AFM1 CarryOver: quota di AFB1 escretanel latte come metabolita AFM1 Varia fra 1-3% (min 0,1% e max6%) Dipende da Produzione di latte e giorni di lattazione Specie (Lattifere, ovi-caprini) Cellule somatiche per permeabilità membrana????

43 Carry Over e Produzione di latte ppt C.O. 3,2-5,1% (4,1%); prod. 44 kg latte 40 C.O. 0,66-1,6% ( 1,2%) prod kg latte 0 day Vacche ad Alta Produzione Vacche a Bassa Produzione

44 Effetto delle SCC sul Carry over Animali Animali 34 pluripare Divisi per Livello produttivo: LY (< 30 L/vacca/d) & HY (> 30 L/vacca/d) Cellule Somatiche: LSCC (< n /ml) & HSCC (> n /L) 30 L/vacca/d < > 30 L/vacca/d Lg SCC (n /ml) 1 2, n /ml < > n /m Latte (L/vacca/giorno)

45 Effetto delle SCC sul Carry Over Andamento della concentrazione dell AFM1 (ng/l) nelle vacche analizzate nel disegno sperimentale ( ) HYHSCC, ( ) HYLSCC, ( ) LYHSCC, ( ) LYLSCC 80.0 Inizio dell ingestione di AFB 1 Fine dell ingestione dell AFB Milk AFM1 (ng/l) Days

46 Carry over nelle pecore Battaccone et al., 2005

47 Prevedere AFM1 nel Latte AFM1 (ppt) = 1.19 x AFB1 (µg/vacca/d) AFM1 (ppt) = x AFB1 (µg/vacca/d) AFM1 (ng/kg) AFB1 intake (mg/cow/d) 1

48 Prevedera AFB1 nel latte L. Giovati, PhD tesi

49 Prevedere CO nel latte CO % = x latte prodotto (kg/vacca/d) CO % = x latte Prodotto (kg/vacca/d) ,06 0,05 Carry over rate 0,04 0,03 0,02 0, Milk (kg/cow/d)

50 Facciamo degli Esempi Dieta per vacche da latte AFB1 Silomais 22 kg - Medica 4 kg - Fieno di prato 2 kg - Mais 5 kg 10 ppb Soia 3 kg <1 pbb Cotone 1 kg 2 ppb Nucleo 2 kg 4 ppb Totale AFB1 ingerita = 62 µg AFM1 latte = 75 ppt(oltre il limite)

51 Facciamo degli esempi Ingestione AFB1 Max 40 µg di AFB1 Cont. UNIFEED Max 2 ppbdi AFB1 In termini di alimenti: Max 2 kg di Mais contaminato a 20 ppb(limite di legge) Max 5 kg di Mais a 8 ppbdi aflatossina Max 8 kg di Mangime contaminato a 5 ppb(limite di legge)

52 Metodi di Detossificazione Controllo della Contaminazione da AFB1 Prevenzione in campo (Huwing et al., 2001): Scelta varietale Condizioni agronomiche Lavorazioni etc. Metodi di Decontaminazione Metodi di Detossificazione le proprietà tossiche delle le micotossine sono rimosse micotossine sono rimosse o neutralizzate Prerequisiti (CAST, 2003; Diaz and Smith, 2005) Effettive nel ridurre, distruggere e inattivare le micotossine Non residuare negli alimenti sostanze tossiche, cancerogene o mutagene e prodotti derivati Non alterare il valore nutritivo degli alimenti e l accettabilità Non alterare le proprietà tecnologiche Essere economicamente e tecnologicamente conveniente Distruggere spore funginee per evitare contaminazioni tardive

53 Metodi di Decontaminazione/Detossificazione Metodi fisici Pulitura delle granelle Separazione per densità Combinazione (-70-90% di AFB1) Inattivazione termica Irradiazione Estrazione con Solventi

54 Pulitura delle Granelle Impossibile eliminare completamente Dati forniti da Mirco Casagrandi

55 Funghi tossigeni nei FORAGGI Funghi «di campo» Fusarium Cladosporium Claviceps Stachybotrys Funghi «di stoccaggio» Sbyssochlamis Monascus

56 Foraggi vs. Concentrati DON Granelle (51%) Foraggi (27%) AFB1 Granelle (22%) Foraggi (13%) FUMO Granelle (45%) Foraggi (27%) ZEA Granelle (45%) Foraggi (34%) Quando gli alimenti sono contaminati da più micotossine il DON è co-presente nel 65% dei campioni

57 Micotossine e Insilati di Mais Borreaniet al., (2003, IA 49-55) 20 aziende in provincia di Cuneo Annate agrarie (pioggieabbondanti) & (relativamente asciutto) Totale campioni 96 campioni di trinciato alla raccolta 73 trincee e cumuli Caratteristiche trinciati DM insilati 25,5-41,4% ph3,4-3,9

58 Micotossine degli Insilati di Mais

59 Micotossine dei foraggi New (or old?) Problem? Stromet al., 2008

60 Micotossine dei foraggi New (or old?) Problem? Stromet al., 2008

61 Micotossine dei foraggi New (or old?) Problem? Stromet al., 2008

62 Micotossine da Alternaria spp. Fungo di campo Mais?, triticale, frumento, orzo, avena Micotossine: Ac. Tenauzonico AAL-toxin, Alternariolo, Alternariolo metiletere, Altenuene Effetto sugli Animali??? Cancerogene e fetotossiche In Cina associate con tumore all esofago

63 Micotossine di P. roqueforti Tossicità su animali DATI INCERTI Acido Micofenolico Attività antimicrobica, Forte immunodepressione (Bentley, 2000) Roquefortina C Attività antimicrobica In manze ha causato Inappetenza, paralisi e chetosi (Häggblom, 1990) PR Tossina Attività antimicrobica Paralisi, aborti e ritenzioni di placenta (Boysen et al., 2000)

64 Micotossine negli Insilati Attività ISAN Campionati 80 foraggi insilati prelevati in 50 Aziende n positivi range Olanda(max) Acido Micofenolico 39 (49%) 0-48 ppm 45 ppm(17%) PR tossina nd - Roquefortina C 29 (36%) 0-32 ppm 25 ppm(23%) DON 24 (30%) ppb 969 ppb(81%) ZEA nd ppb(46%)

65 Micotossine dei foraggi Esperimento ISAN con inoculo ruminale «Effetto della presenza di micotossine prodotte da Penicillium roqueforti su fermentescibilità della razione» Trattamenti (Central Composite Design) Acido Micofenolico PR tossina Roquefortina C (5 livelli) (5 livelli) (5 livelli)

66 Micotossine da P. roqueforti Effetto della loro presenza Response variables Control syringes Treated syringed Reduction (%) Gas production parameters Vf (ml/g OM) 412±18 382±22-7% k (h -1 ) 0.059± ±0.009 Lag (h) 0.06± ±0.25 T½ (h) 12.6± ±3.2 Volatile fatty acids Acetic acid (A, % mol) 64.2± ±4.3 Propionic acid (P, % mol) 18.2± ±1.9 Butyric acid (B, % mol) 12.6± ±1.9 BCFA (% mol) 3.4± ±1.0 Total (mmol/l) 96.2± ± % A/P ratio 3.5± ±0.8 (A+B)/P ratio 4.2± ±0.8 MSItot PR nd 0 MYCO nd 50.2±37.0 ROQUE nd 48.1±73.3

67 Micotossine dei foraggi Inibizione nella produzione di Gas Vf(ml/g OM) = 413 1,11*Myco(ug) 0,98*Roque(ug) mvf Vf model Mycod Roqued

68 Micotossine dei foraggi Inibizione nella produzione di VFA VFA (mmol/l) = *Myco(ug) *Roque 2 (ug) mvfa VFA model Mycod Roqued

69 Micotossine dei foraggi Confronto con Estratti «naturali» Predicted Vf (ml/g OM) Observed Vf (ml/g OM)

70 Micotossine da Aspergillus fumigatus Contamina foraggi, sprtt Insilati Gliotossina Attività antimicrobica, immunosoppressiva, genotossica Campionati 80 foraggi insilati Ritrovata in 2 casi (ISAN) Concentrazioni < 1 ppm

71 Micotossine da Aspergillus fumigatus Effetto della presenza di Gliotossinasu produzione di Gas e VFA VFA production (mmol/l) Gas production (ml) VFA production (mmol/l) Gliotossina incubata Gas production (ml) Morgavi et al., 2004

72 Micotossine nascoste Cosa sono? Micotossine che si coniugano a zuccheri, proteine e grassi Non vengono quantificate dai metodi analitici «convenzionali» Vengono rilasciate dai processi digestivi del tratto GI Anche trattamenti termici (fioccatura, pellettatura, estrusione) sono in grado di liberarle Quando libere, esplicano le loro caratteristiche di tossicità

73 Micotossine nascoste Tricoteceni Si stima che negli alimenti, il 30% (fino a 76%) del DON è in forma coniugata (D3G, DON 3 glucoside) Zearalenone Si stima che negli alimenti, il 27% di ZEA è in forma coniugata (Z14G, ZON 14 glucoside) FUMO Dopo idrolisi, la quantificazione di FUMO è aumentata di 2.6 volte (legame debole) Questione aperta: «la coniugazione riduce o meno la biodisponibilità della molecola per gli organismi superiori?» Z14G è scomposto durante digestione, rilasciando ZEA D3G non viene rilasciato dopo idrolisi acida (stomaco). Cmq, batteri lattici intestinali sono in grado di deconiugare il composto Nessuna informazione su masked FUMO Berthiller et al., 2012