Risultati del Progetto EFSA: Survey on sterigmatocystin in food*

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1 V Congresso Nazionale: Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare Amedeo Pietri, Terenzio Bertuzzi Istituto di Scienze degli alimenti e della nutrizione Facoltà di Scienze Agrarie, Alimentari e Ambientali, UCSC - Piacenza Risultati del Progetto EFSA: Survey on sterigmatocystin in food* * sole responsibility lies with the authors and the Authority is not responsible for any use that may be made of the information contained therein Roma, settembre 2015

2 Nel 2013, l EFSA ha pubblicato un bando dal titolo: Survey on sterigmatocystin in food, che invitava a sottoporre proposte per la realizzazione di uno studio sulla presenza di sterigmatocistina negli alimenti, con particolare attenzione ai cereali e ai prodotti derivati Quattro enti di ricerca, (RIKILT, FERA, BPI, UNICATT) hanno costituito un Consorzio, che ha formulato una proposta; la stessa è risultata quella prescelta da EFSA.

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4 Sterigmatocistina - Aflatossina B 1 Contengono la stessa molecola 7,8-diidrofurano Sterigmatocistina Aflatossina B1 1. È un ciclo pentanone costituito da un nucleo xantonico collegato ad uno bis-furanico 2. Questo ha portato a pensare che l una e le altre vengano metabolizzate per la stessa via

5 Funghi produttori - Aspergillus - Penicillium - Bipolaris - Chaetomium - Monocillium Aspergillus versicolor maggior produttore Specie ubiquitaria, si trova comunemente in ambienti umidi principalmente in cereali e sulla superficie di formaggi stagionati Condizioni ottimali per la produzione di STC sono: T di 25 C, Aw a partire da 0,76 e U > 15 %

6 STC RICONOSCIUTA COME POTENZIALE CANCEROGENO MUTAGENO E TERATOGENO EFFETTI TOSSICI CORRELABILI A QUELLI DELLA AFLATOSSINA B1 HA MOSTRATO ATTIVITÀ EPATOTOSSICA E TOSSICITÀ A CARICO DEL RENE E DEL POLMONE IN ALCUNE SPECIE ANIMALI MOLECOLA GENOTOSSICA (INTERAZIONI TRA STC E DNA) LO IARC L HA INSERITA NELLA CLASSE 2B Genotossicità valutata su tre linee cellulari umane: colon, fegato e rene Sterigmatocistina è più genotossica delle aflatossine

7 Il primo ritrovamento riguardante la STC in un prodotto cerealicolo risale ad uno studio del 1972 Nel 1984 venne pubblicato uno studio giapponese sulla distribuzione di Aspergillus versicolor e di STC in riso integrale. L invasione del fungo era spesso nello strato aleuronico e nell endosperma amidaceo. Durante la pulitura del riso, la contaminazione diminuiva dal 71.6 % al 7.7% Nel 1996 venne pubblicato il primo studio (Scudamore et al.) che utilizzava l HPLC-MS/MS per la quantificare la STC. Rappresentò un grande passo in avanti per le ricerche. Finalmente si era in grado di individuare questa micotossina a livelli inferiori a 5 µg/kg Nel 2008 venne pubblicato uno studio su cereali prodotti in Lettonia (Versilovskis et al.). Su 95 campioni analizzati nel 2006 il 13,7% è risultato positivo, mentre del 2007 sono risultati positivi il 35 %. Nello stesso anno e sempre dai medesimi autori è stato messo a punto un nuovo metodo per determinare STC anche nella birra

8 Ad oggi nell Unione Europea non esiste una legislazione per questa micotossina. Repubblica Ceca e Slovacchia hanno fissato un livello massimo di contaminazione di 5 µg/kg per riso, verdure, latte e di 20 µg/kg per altri alimenti. Dallo studio riguardante i cereali svolto in Lettonia, alcuni dei campioni positivi superano i livelli massimi stabiliti dalla Repubblica Ceca e Slovacchia.

9 Progetto EFSA - Mettere a punto e validare un metodo HPLC-MS/MS per determinare la sterigmatocistina con un limite di quantificazione non superiore a 1,5 µg/kg. - Campionare ed analizzare circa 1000 campioni di cereali e prodotti derivati oltre che 50 campioni di birra e 50 campioni di frutta secca.

10 CAMPIONAMENTO Cereali grezzi: 429 Prodotti finiti: 713 Birra: 53 Frutta secca: 64 Totale campioni: 1259 I campioni sono stati prelevati da consorzi di produttori, impianti di trasformazione e in diversi punti vendita in diversi paesi europei. (UK, 276; Olanda, 269; Germania, 16; Italia, 316; Grecia, 275; Cipro, 22; Polonia 40, Paesi baltici, 21, altri, 24). I prodotti provenivano da 27 paesi europei (1076 campioni) e da 18 paesi extra-europei (183 campioni, soprattutto riso e frutta secca).

11 CEREALI GREZZI Numero CAMPIONI TOTALI : 429 TIPOLOGIA CAMPIONE Frumento tenero 169 Frumento duro 52 Segale 35 Risone 28 Mais 33 Orzo 59 Avena 51 Spelta 2 NUMEROSITÀ CAMPIONE CAMPIONAMENTO PRODOTTI FINITI Numero CAMPIONI TOTALI : 830 Farina di diversi cereali 125 Riso bianco 89 Pasta 115 Pane, pancarrè, pan bauletto, crackers 143 Cereali da colazione 97 Prodotti dolciari da forno: biscotti, brioche 90 Alimenti infanzia 54 Birra 53 Frutta secca nocciole arachidi

12 Tipologia dei cereali campionati Consumo di cereali in Europa 8,5% 5,5% 7% 3% 2% frumento segale mais riso orzo 73 % avena

13 Metodi di analisi Cereali e prodotti derivati STC estratta da 25g di campione con 100ml di acetonitrile-acqua v/v Agitazione del campione per 60 min Filtrazione su filtro di carta a pieghe Purificazione di 5 ml di estratto diluito su colonna OASIS HLB (500mg) Lavaggio colonna con 2 ml di acqua e 2 ml di acqua-metanolo v/v Eluizione con 6 ml di acetonitrile in provetta di vetro graduata Concentrazione estratto a 2 ml sotto flusso di azoto Iniezione nel sistema HPLC-MS/MS con interfaccia APCI Birra Birra degassata in un bagnetto ad ultrasuoni Diluizione di 10 ml di birra con 5ml di PBS Purificazione tramite colonna ad immunoaffinità Lavaggio colonna con 2 ml di acqua Eluizione con 3 ml di acetonitrile in provetta di vetro graduata Concentrazione estratto a 1ml sotto flusso di azoto Iniezione nel sistema HPLC- MS/MS con interfaccia APCI

14 Prestazioni del metodo Prima dell analisi strumentale, agli standard e ai campioni è stato aggiunto uno standard marcato (sterigmatocistina 13 C) per tenere conto dell effetto matrice Le percentuali di recupero sono state valutate utilizzando, come bianco, un campione di cereali non contaminato ed eseguendo tre replicati a due diversi livelli di contaminazione 0,5 e 5 µg/kg In media, la percentuale di recupero è risultata compresa, per i vari prodotti, tra l 88,7 % e il 102,4 % con una soddisfacente deviazione standard relativa (inferiore al 7%).

15 Prestazioni del metodo I metodi per la determinazione della sterigmatocistina basati su HPLC-MS/MS sono stati validati con successo a livello di 0.5 μg/kg nei 4 laboratori, cioè al di sotto di 1.5 μg/kg richiesto da EFSA. I metodi hanno consentito una rivelazione a bassi livelli della sterigmatocistina, con LODs nell intervallo μg/kg (uniformato a 0.15) per cereali, derivati e frutta secca, e μg/kg per la birra.

16 Confronto tra laboratori Risultati dell analisi di un campione di riso naturalmente contaminato Replicato concentrazione in μg/kg RIKILT UCSC Fera BPI Media ,73 2,16 RSD (%) BPI: Benaki Phytopathological Institute, Greece; Fera: Food and Environment Research Institute, UK; UCSC: Università Cattolica del Sacro Cuore, Italy.

17 RISULTATI Contaminazione da sterigmatocistina dei cereali grezzi (429 campioni) campione % positivi Frumento tenero Frumento duro % LOD 0,5 µg/kg CEREALI GREZZI % 0,5 1,5 µg/kg % 1,5-5 µg/kg / / / / Segale / / Risone Mais 6 / 6 / / Orzo 2 / / 2 / Avena % > 5 µg/kg Valore massimo risone: 5,5 µg/kg Valore massimo avena: 33 µg/kg LOD 0,15 µg/kg LOQ 0,50 µg/kg

18 RISULTATI Contaminazione da sterigmatocistina del riso lavorato

19 RISULTATI Contaminazione da sterigmatocistina dei prodotti finiti campione % positivi PRODOTTI DERIVATI % LOD 0,5 µg/kg % 0,5 1,5 µg/kg % 1,5-5 µg/kg Farine (125) / / Riso (89) / Pasta (115) 5 5 / / / Pane (143) / Cereali da colazione (97) / Biscotti (90) / / Cereali per l infanzia (54) / % > 5 µg/kg Nei cereali da colazione contaminati da STC, presenza rilevante di riso o avena tra gli ingredienti. STC non rilevata in birra e frutta secca. LOD 0,15 µg/kg LOQ 0,50 µg/kg

20 CONCLUSIONI In questa indagine, la sterigmatocistina è risultata presente nel 10% dei 1259 campioni analizzati e ha superato il livello di 1.5 μg/kg nell 1.4 % dei campioni L indagine ha evidenziato nei cereali grezzi una contaminazione limitata di sterigmatocistina, ad eccezione dei campioni di riso e avena e derivati. Nel riso bianco la contaminazione è risultata inferiore rispetto al risone. Nei cereali trasformati, la presenza di sterigmatocistina è stata leggermente inferiore, cioè 9 10 % dei campioni, rispetto al 13 % dei campioni di cereali grezzi. Si può supporre che la contaminazione riguardi soprattutto le parti esterne delle cariossidi, ragione per cui gli alimenti integrali risulterebbero maggiormente contaminati. La sterigmatocistina è stata rilevata anche in prodotti da colazione contenenti riso, avena o crusca di frumento. Sarebbe opportuno uno studio più dettagliato che coinvolga varie tipologie di riso. Inoltre, andrebbe approfondita la tematica del processo di lavorazione.

21 Sterigmatocistina in riso e derivati Positivi Media Mediana Range Risone / ± / ± Riso bianco / ± < / ± < Riso integrale/parboiled / ± Prodotti a base di riso / ± <

22 Sterigmatocistina in riso e derivati Processo A Processo B Processo C Processo D µg kg -1 % µg kg -1 % µg kg -1 % µg kg -1 % Risone Riso integrale Lolla Bilancio di massa Riso integrale Riso bianco Riso spezzato Pula Bilancio di massa

23 Grazie per l attenzione