M. Pascale, V. Lippolis, V. Lattanzio, M. Solfrizzo, A. Visconti, C. Hazel, S. Patel, J. Briggs

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1 III Congresso Nazionale Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare e Zootecnica Roma, Settembre 2009 Sviluppo di metodi di analisi sensibili per le tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati M. Pascale, V. Lippolis, V. Lattanzio, M. Solfrizzo, A. Visconti, C. Hazel, S. Patel, J. Briggs

2 La Food Standards Agency (FSA) è un Dipartimento indipendente del Governo inglese nato nel 2000 per proteggere la salute pubblica e gli interessi del consumatore in relazione agli alimenti. FSA rappresenta il Governo inglese nell Unione Europea per quanto riguarda i temi della sicurezza alimentare. Il ruolo della FSA è anche quello di condividere conoscenze e competenze con altri stati membri dell Unione Europea e di lavorare con loro per migliorare la sicurezza degli alimenti all interno dell Unione Europea.

3 Tossine T-2 e HT-2 H 3 C (CH 3 ) 2 CHCH 2 OCO H H O 13 5 CH 14 2 CH 3 OCOCH 3 Tossina T O H 3 4 OH H OCOCH 3 PRODOTTI A RISCHIO Frumento, avena, mais, segale e prodotti derivati FUNGHI PRODUTTORI orzo, Fusarium sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae, F. acuminatum H 3 C H (CH 3) 2CHCH 2OCO H 1 O CH 2 14 CH 3 OCOCH 3 12 O H 3 4 OH OH H EFFETTI TOSSICI attività immunosoppressiva citotossicità attività dermotossica ed emorragica inibizione della sintesi proteica leucopenia tossico-alimentare (ATA) Tossina HT-2 Rispetto al DON la tossicità delle tossine T-2 e HT-2 è 20 volte più elevata nel topo e volte più elevata in linee cellulari (in vitro).

4 Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003 TRICOTECENI - Prodotti a rischio contaminazione Tricotecene Prodotto contaminato (percentuale di campioni positivi)* Deossinivalenolo mais (89%), frumento (61%) Nivalenolo mais (35%), avena (21%), frumento (14%) 3 Acetil-DON mais (27%), frumento (8%) Tossina T-2 mais (28%), frumento (21%), avena (21%) Tossina HT-2 avena (41%), mais (24%), segale (17%) * DON campioni analizzati: NIV Ac-DON T-2 HT (57% positivi) 4166 (16% positivi) 3721 (8% positivi) 3490 (20% positivi) 3032 (14% positivi)

5 Simon Edwards; HT-2 and T-2 in oats what we know and what we need to know ; th Fusarium toxin Forum, 9-10 Febbraio 2009, Bruxelles. 6 th

6 EUROPEAN COMMISSION Health & Consumer Protection Directorate General Scientific Committee on Food (SCF), 2002 Tossine T-2 e HT-2 dose giornaliera tollerabile temporanea ttdi = 0.06 µg / kg body weight / day (TDI for DON = 1 µg/kg bw) LOEL (lowest-observed observed effect level) = 29 µg/kg bw per day (pigs) - Safety factor = 500 Lo SCOOP - Task ha messo in evidenza che, in alcuni Paesi e per alcune categorie di consumatori, la ttdi eccedeva Tuttavia, l esposizione alle tossine T-2 e HT-2 stimata era basata sia sulla bassa incidenza di contaminazione, sia sugli elevati LOD dei metodi analitici utilizzati.

7 REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari Paragrafo 31 Stime sull'assunzione indicano che la presenza delle tossine T-2 e HT-2 può essere preoccupante per la salute pubblica. È quindi necessario e altamente prioritario sviluppare un metodo di analisi sensibile e affidabile, raccogliere ulteriori dati sull'occorrenza e svolgere ulteriori maggiori indagini/ricerche sui fattori che incidono sulla presenza delle tossine T-2 e HT-2 nei cereali e nei prodotti a base di cereali, in particolare nell'avena e nei prodotti a base di avena.

8 SCOPO Il progetto Sponsor: Food Standards Agency, UK Titolo: Development of an improved method of analysis for the determination of T-2 and HT-2 toxins in foodstuffs Partners: Premier Foods, UK ISPA-CNR, Italy Durata: 19 mesi (Dic Giu. 2008) Sviluppare un metodo di analisi per le tossine T-2 e HT-2 con un limite di quantificazione (LOQ, S/N=10) di 8 µg/kg per la somma delle due tossine. Validare il metodo sviluppato per cereali, inclusa l avena, e prodotti processati (cereali per colazione, biscotti, pasta, snacks).

9 Il progetto 1 Verifica della purezza degli standard (Premier Foods, ISPA) Determinazione del coefficiente di estinzione molare delle tossine T-2 e HT-2 (ISPA) Valutazione delle performance delle colonne ad immunoaffinità per la purificazione del campione (ISPA) 2 3 Sviluppo di un metodo GC-MS (Premier Foods) Frumento, orzo, mais e avena Prodotti processati a base di frumento, mais e avena Sviluppo di un metodo HPLC-FD (ISPA) Frumento, orzo, mais e avena Prodotti processati a base di frumento, mais e avena Sviluppo di un metodo LC-MS/MS (ISPA) Frumento, orzo, mais e avena Prodotti processati a base di frumento, mais e avena Validazione in-house dei metodi sviluppati (Premier Foods, ISPA) Protocolli dei metodi in formato ISO (Premier Foods, ISPA)

10 Fase 1 Obiettivo Verificare la purezza degli standard Determinare il coefficiente di estinzione molare (ε) delle tossine T-2 e HT-2 (in metanolo) Valutare mediante LC-MS/MS che le colonne ad immunoaffinità (IACs) non rilasciassero tossine T-2 e HT-2 Risultato Standard commercialmente disponibili sono stati valutati mediante GC-MS e LC-MS/MS. La purezza degli standard di tossine T-2 and HT-2 è risultata maggiore del 97%. ε (tossina T-2) = 4022 ± 56 (L mol -1 cm -1 ) ε (tossina HT-2) = 4001 ± 48 (L mol -1 cm -1 ) La quantità assoluta rilasciata dalle IACs era <200 pg (T- 2 + HT-2). La contaminazione che potrebbe derivare dalle IACs risulterà essere trascurabile (<0,2 µg/kg). Le IACs testate possono essere utilizzate per lo sviluppo dei metodi.

11 T-2 e HT-2 Sviluppo del metodo GC-MS

12 Metodo GC-MS Stato dell arte Solvente di estrazione: acetonitrile/acqua Clean up: SPE (MycoSep, carbone/allumina) Derivatizzazione pre-colonna (trimetilsililderivati) N-trimetilsilil-imidazolo (TMSI), Tri-Sil TBT (miscela di TMSI:BSA:TMCS 3:3:2) LOQ = 10 µg/kg per tossina (basato sullo ione più abbondante) Applicabilità a varie matrici Ioni utilizzati per la determinazione dei derivati T-2(TMS) e HT-2(TMS) mediante GC-MS Tossine Ioni (m/z) T-2 (TMS) TIC: BWS01.D T-2 (TMS) HT-2 (TMS) HT-2 (TMS) Time-->

13 Metodo GC-MS per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 in frumento, mais, orzo e avena Valutazione dell uso di colonne ad immunoaffinità Efficace clean up Sensibilità del metodo limitata dal volume di caricamento dell estratto su colonna Estrazione: acetonitrile/acqua (84/16, v/v) Aumento del volume di estratto caricato su colonna SPE (20 ml) Derivatizzazione post-colonna con TMSI e purificazione della miscela di reazione; concentrazione dell estratto da iniettare in GC-MS Incremento della sensibilità (LOQ, S/N=10) Estrazione Campione macinato (20 g) con acetonitrile/acqua (84/16 v/v, 100 ml) SPE clean-up Estratto filtrato (20 ml, 4 g di matrice) (colonne carbone/allumina) Derivatizzazione Lavaggio con esano Determinazione GC-MS (Selected Ion Monitoring)

14 Limiti di quantificazione (LOQ s ), Recuperi e ripetibilità (RSD r ) del metodo GC-MS per frumento, mais, orzo e avena LOQ (µg/kg) rapporto segnale-rumore di 10:1 tossina T-2 tossina HT-2 T-2+HT-2 0,3 2,5 0,3 6,0 1,5 8,0 tossina T-2 tossina HT-2 Recupero (%) RSD r * (%) Recupero (%) RSD r * (%) 80 8,0 80 9,0 *RSD r, deviazione standard relativa (n=3) Livelli di contaminazione cereali non processati: T-2 ( µg/kg), HT-2 ( µg/kg)

15 Applicabilità del metodo a prodotti processati a base di cereali pasta pasta integrale cornflakes Prodotti per colazione a base di frumento prodotti per colazione a base di avena tortillas chips chips di mais a base di formaggio biscotti a base di cereali

16 Validazione del metodo Il metodo ottimizzato è stato validato su pasta integrale, cereali per colazione a base di avena e cornflakes Pasta integrale cornflakes cereali per colazione a base di avena Premier Foods ha preparato un singolo batch dei tre materiali non contaminati che sono stati utilizzati nella validazione per determinare precisione, recuperi a bassi (40 µg/kg, 10 LOQ) e alti livelli (200 µg/kg, 50 LoQ) di contaminazione per singola tossina, selettività e LOQ del metodo.

17 Limiti di quantificazione (LOQ s ), Recuperi e ripetibilità (RSD r ) del metodo GC-MS per pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena LOQ (µg/kg) rapporto segnale-rumore di 10:1 tossina T-2 tossina HT-2 T-2+HT-2 0,7 2,5 0,8 6,2 2,0 7,4 tossina T-2 tossina HT-2 Recupero (%) RSD r * (%) Recupero (%) RSD r * (%) 85 8,7 84 8,6 *RSD r, deviazione standard relativa (n=3) Livelli di contaminazione pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena: T-2 (40 e 200 µg/kg), HT-2 (40 e 200 µg/kg)

18 T-2 e HT-2 Sviluppo del metodo HPLC-FD

19 Metodo HPLC-FD Stato dell arte Solvente di estrazione: metanolo/acqua Clean up: colonne ad immunoaffinità (diluizione dell estratto con acqua) (Visconti et al., 2005) Derivatizzazione pre-colonna con 1-AN LOD (S/N=3) = 5 µg/kg (T-2) and 3 µg/kg (HT-2) Applicabilità a frumento, mais, orzo (interferenze per l avena) Colonna: Phenyl-Hexyl Luna (150 x 4.6 mm, 5 µm) Fase Mobile: gradiente CH 3 CN:H 2 O (70:30 to 85:15) Flusso: 1 ml/min Rivelatore: a fluorescenza (λ ex. =381 nm, λ em. =470 nm) Derivatizzazione: pre-colonna con 1-antroilnitrile (1-AN)

20 Metodo HPLC-FD per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Aumento del volume di estratto caricato su colonna IAC 20 ml = 2 g matrice equivalente Differenti soluzioni per la diluizione dell estratto PBS (frumento, orzo, avena e prodotti derivati) 4% NaCl (maize) Estrazione campione (50 g) con metanolo:acqua (9:1 v/v, 100 ml) + NaCl (1 g) Filtrazione (carta) Diluzione 1:5 (v/v) con: PBS o 4% NaCl Filtrazione (microfibra di vetro) Clean-up con IAC Uso di differenti colonne ad immunoaffinità Derivatizzazione con 1-AN Determinazione HPLC-FD

21 Profili cromatografici - frumento (IAC/20 ml =2 g matrice equivalente su colonna Frumento bianco 13,0 12,0 11,0 T2-(1AN) S/N= 12 10,0 35 9,0 30 8,0 25 7,0 20 9,8 10,0 10,2 10,4 10,6 10,8 11,0 11,2 11,4 11,6 11,8 12,0 12,2 12,4 12, , ,0 12,0 HT2-(1AN) 2 S/N= , ,0 45 Frumento contaminato 9,0 8,0 40 7,0 17,5 18,0 18,5 19,0 19,5 20,0 20,5 21,0 21,5 22,0 22,5 23,0 23, T2-(1AN) (4,3 µg/kg) HT2-(1AN) 2 (2,5 µg/kg) LOQ T-2 = 4 µg/kg LOQ HT-2 = 2,5 µg/kg

22 Profili cromatografici - avena (IAC/20 ml =2 g matrice equivalente su colonna) HT-2 (1AN) T-2 (1AN) (4,0 µg/kg) HT-2 (1AN) 2 (2,6 µg/kg) LOQ T-2 = 4 µg/kg LOQ HT-2 = 2,5 µg/kg 20 S/N= 10 S/N= Avena naturalmente contaminata T-2 (1AN) (91 µg/kg) HT-2 (1AN) 2 (98 µg/kg) 80 S/N= S/N= Avena artificialmente contaminata (100 µg/kg T-2 e HT-2)

23 Profili cromatografici - mais (IAC/20 ml =2 g matrice equivalente su colonna Diluzione con PBS Diluzione con 4% NaCl NaCl è necessario per precipitare i composti interferenti (per es. proteine) che provocavano intorbidimento dell estratto dopo diluizione e che co-eluivano con il derivato HT2-(1-AN) 2.

24 Profili cromatografici - cereali per colazione a base di avena Non contaminato 10 LOQ Contaminato con 40 µg/kg T-2 40 µg/kg HT-2

25 Profili cromatografici - cereali per colazione a base di avena Non contaminato 50 LOQ Contaminato con 200 µg/kg T µg/kg HT-2

26 Limiti di quantificazione (LOQ s ) del metodo HPLC-FD per cereali non processati, pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena Cereale e prodotto processato LOQ (µg/kg) rapporto segnale-rumore di 10:1 tossina T-2 Tossina HT-2 T-2+HT-2 frumento/mais/avena/orzo 4,0 2,0 2,6 6,0 6,6 pasta integrale cornflakes cereali per colazione a base di avena 3,9 4,3 2,5 2,7 6,4 6,9

27 Recuperi e ripetibilità (RSD r ) del metodo HPLC-FD per cereali non processati, pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena Cereale e prodotto processato tossina T-2 Rec. (%) RSD r * (%) tossina HT-2 Rec. (%) RSD r * (%) frumento/mais/avena/orzo 82 3,6 85 3,1 pasta integrale cornflakes cereali per colazione a base di avena 83 6,6 96 5,9 *RSD r, deviazione standard relativa (n=3) Livelli di contaminazione cereali non processati: T-2 (100 µg/kg), HT-2 (100 µg/kg) pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena: T-2 (40 e 200 µg/kg), HT-2 (40 e 200 µg/kg)

28 T-2 e HT-2 Sviluppo del metodo LC-MS/MS

29 Metodo LC-MS/MS per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Ottimizzazione dei parametri MS/MS (triplo quadripolo) Messa a punto della procedura di estrazione e clean-up Valutazione dell effetto matrice Influenza di composti presenti in matrice sulla ionizzazione degli analiti Estrazione Campione macinato (10 g) con acetonitrile/acqua (84/16 v/v, 50 ml) Estratto filtrato (5mL, 1 g di matrice) Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode (cinque ioni monitorati per ogni tossina) Analyte Precursor Ion Q1 (m/z) Q3 (m/z) HT-2 [HT-2+NH 4 ] T-2 [T-2+NH 4 ] SPE clean-up (Oasis HLB) Determinazione LC-MS/MS APCI Ionizzazione positiva Modificatore: 5 mm acetato di ammonio

30 Metodo LC-MS/MS per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 - Effetto matrice Confronto tra curve di calibrazione ottenute in: --- fase mobile HPLC; --- estratto purificato con colonne Oasis HLB mobile phase w heat WHEAT mobile phase w heat WHEAT tossina T ng inj tossina HT ng inj Curve di calibrazione in matrice sono necessarie per analisi quantitative affidabili Curve di calibrazione in matrice possono essere evitate utilizzando Standard Interni 13 C 24 T2 toxin e 13 C 24 HT2 toxin sono disponibili (Biopure, Austria)

31 Profili cromatografici - avena (OASIS HLB/5 ml =1 g matrice equivalente su colonna) Intensity, cps HT-2 (5.9 µg/kg) T-2 (6.9 µg/kg) Time, min

32 Limiti di quantificazione (LOQ s ) del metodo LC-MS/MS per cereali non processati, pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena Cereale e prodotto processato LOQ (µg/kg) rapporto segnale-rumore di 10:1 tossina T-2 tossina T-2 T-2+HT-2 frumento/mais/avena/orzo 1,4 2,5 1,9 5,1 3,6 6,6 pasta integrale cornflakes cereali per colazione a base di avena 1,5 3,1 4,5 5,9 6,0 7,9

33 Recuperi e ripetibilità (RSD r ) del metodo LC-MS/MS per cereali non processati, pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena Cereale e prodotto processato tossina T-2 Rec. (%) RSD r * (%) tossina T-2 Rec. (%) RSD r * (%) wheat/maize/oats/barley 70 7,0 72 9,0 pasta integrale cornflakes cereali per colazione a base di avena *RSD r, deviazione standard relativa (n=3) 89 7,5 98 7,5 Livelli di contaminazione cereali non processati: T-2 ( µg/kg), HT-2 ( µg/kg) pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena: T-2 (40 e 200 µg/kg), HT-2 (40 e 200 µg/kg)

34 Metodo LC-MS/MS per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 Miglioramento del LOQ Estrazione Campione macinato (50 g) con metanolo:acqua (9:1 v/v, 100 ml, 1 g NaCl) Filtrazione (diluizione con acqua) Immunoaffinity column clean-up Determinazione LC-MS/MS Pasta integrale SPE (20 mg inj) IAC (100 mg inj) LOQ (µg/kg) T-2 HT-2 T-2+HT-2 2,5 3,6 6,1 0,3 0,5 0,8

35 CONCLUSIONI Nell ambito del Progetto sono stati sviluppati tre metodi (GC-MS, HPLC-FD, LC-MS/MS) per la determinazione delle tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti a base di cereali. I tre metodi ottimizzati hanno un LOQ 8 µg/kg per la somma delle due tossine, e tutti i metodi sono stati validati per frumento, mais, orzo, avena e prodotti derivati (pasta integrale, cornflakes e cereali per colazione a base di avena). I valori di recupero e ripetibilità dei metodi rientrano nei criteri stabiliti dalla Commissione Europea (Regolamento CE No. 401/2006) per l accettabilità di un metodo di analisi per le tossine T-2 e HT-2. I metodi sviluppati potrebbero essere applicati per indagini epidemiologiche al fine di una corretta valutazione del rischio tossicologico connesso all ingestione di prodotti a base di cereali contaminati da tossine T-2 e HT-2.

36 RINGRAZIAMENTI Jonathan Briggs Clare Hazel Sue Patel Ijaz Shah Veronica Lattanzio Vincenzo Lippolis Michele Solfrizzo Angelo Visconti