PROGETTO MICORID. Carlo Brera, Barbara De Santis, Elena Pannunzi, Clara Berdini, Elisabetta Prantera Istituto Superiore di Sanità RELAZIONE FINALE

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1 PROGETTO MICORID VALUTAZIONE DEL CONTENUTO DI MICOTOSSINE IN MANGIMI DI IMPORTAZIONE Carlo Brera, Barbara De Santis, Elena Pannunzi, Clara Berdini, Elisabetta Prantera Istituto Superiore di Sanità RELAZIONE FINALE PIANO DI LAVORO ED ATTIVITA SVOLTE Al fine di raggiungere gli obiettivi preposti è stato programmato il seguente piano di lavoro: - Codifica dei campioni ricevuti - Messa a punto del metodo di analisi multimicotossina - Valutazione descrittiva su basi statistiche dei risultati ottenuti Le attività relative al piano di lavoro citato hanno riguardato la registrazione dei campioni e relativa suddivisione per classi ed in alcuni casi la doppia macinazione dei campioni per l ottenimento di un grado di macinazione omogeneo (0.5 mm) tramite mulinetto ROMER RAS Mill e Retsch ZM200. Successivamente le aliquote sono state sottoposte ad analisi utilizzando il metodo di seguito descritto. METODO PER L ESTRAZIONE PURIFICAZIONE MULTIMICOTOSSINA PER LA DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINE (A), OCRATOSSINA (O), FUMONISINE (F), DEOSSINIVALENOLO (D), ZEARALENONE (Z), T2 ed HT2 (METODO AOF - DT2HT2Z) PROCEDURA ESTRAZIONE MULTIMICOTOSSINA PER TUTTE LE MICOTOSSINE Pesare direttamente nell omogeneizzatore 25.0 g di campione. Aggiungere 2.5 g di NaCl e 125 ml di solvente di estrazione (metanolo:acetonitrile:h 2 O - 25:25:50). Agitare il campione ad alta velocità per 3 minuti. Evitare di surriscaldare l omogeneizzatore durante l estrazione ad alta velocità. Filtrare l'estratto su filtro di carta.

2 PROCEDURA PURIFICAZIONE MULTIMICOTOSSINA PER DTZ Prelevare 2 ml di filtrato e diluirli con 48 ml di PBS (tampone a sali di fosfato). Miscelare adeguatamente. Filtrare nuovamente il campione su filtro a microfibra di vetro o centrifugare a 8000 rpm per 10. Preparare la colonnina di immunoaffinità secondo le istruzioni del fornitore (R-Biopharm Italia, DZT MS-PREP). Collegare la colonnina di immunoaffinità al sistema sotto vouto e attaccare la siringa alla IAC. Pipettare 20 ml di estratto filtrato nella siringa trasferendoli in IAC ad una velocità di flusso di circa 3 ml/min, applicando un vuoto moderato o utilizzando sistemi equivalenti (il flusso comunque non deve eccedere i 5 ml/min). Lavare la IAC con 20 ml di acqua alla fine del passaggio del campione. Asciugare la colonnina passando almeno 2 volumi di aria. Eluire le micotossine seguendo una procedura in due fasi: applicare 1 ml di metanolo alla IAC e lasciarlo fluire per gravità. aspettare 1 minuto ed applicare una seconda porzione di 500 ul di metanolo. Raccogliere il solvente di eluizione residuo passando, con una siringa da 10 ml, attraverso la IAC un volume d aria pari a due/tre volte il volume della stessa. Evaporare l eluato in flusso di flusso di azoto ad una temperatura di 40 C. Ridissolvere il residuo in 1 ml di solvente di iniezione, miscelare adeguatamente al vortex e conservare il campione a 4 C fino all analisi in LC-MS/MS PROCEDURA PURIFICAZIONE MULTIMICOTOSSINA AOF Prelevare 10 ml di filtrato e diluirli con 40 ml di PBS ( tampone a sali di fosfato). Miscelare adeguatamente. Filtrare nuovamente il campione su filtro a microfibra di vetro. Preparare la colonnina di immunoaffinità secondo le istruzioni del fornitore (R-Biopharm Italia, AflaOchra Prep) disponendole a torre con quella AflaOcra sopra e quella delle Fumonisine sotto. Collegare le colonnine di immunoaffinità al sistema sotto vuoto e attaccare la siringa alla IAC.

3 Pipettare 10 ml di estratto filtrato nella siringa trasferendoli in IAC ad una velocità di flusso di circa 3 ml/min, lavare la IAC con 10 ml di PBS alla fine del passaggio del campione. Asciugare la colonnina passando almeno 2 volumi di aria. Eluire le micotossine da entrambe le IAC seguendo una procedura in due fasi: AflaOcra: applicare 750 μl di metanolo alla IAC e lasciarlo fluire per gravità, ripetere l operazione per 3 volte in un matraccio da 5 ml, portare a volume con H 2 O. Fumonisine: applicare 750 μl di metanolo per due volte e 750 μl di H 2 O per due volte, in una vial ambrata. Raccogliere il solvente di eluizione residuo passando, con una siringa da 10 ml, attraverso la IAC un volume d aria pari a due/tre volte il volume della stessa, conservare il campione a 4 C fino all analisi in HPLC. Condizioni operative HPLC Analisi Aflatossine + Ocratossina Flusso 1 ml/min V inj = 150 μl Colonna C18 150x4.6 mm, 5μm termostatata a 40 C Derivatizzazione post colonna per le aflatossine con PBPB; Tempo 0 minuti: ecc : 365 nm; em : 442 nm Tempo 17 minuti: ecc : 333 nm, em : 463 nm Fase mobile A: MeOH:H 2 O acidulata al 2% con acido acetico (40:60 v/v) Fase mobile B: MeOH:H 2 O acidulata al 2% con acido acetico (80:20 v/v) Tempo %A %B Condizioni HPLC Fumonisine Flusso 1,0 ml/min; Fluorescenza λexc 335nm, λemx 440nm;

4 V inj = 150 ul ; Fase Mobile: 77:23 ( MeOH : Sodium dihydrogen phosphate solution). (ph 3,35). Metodo UPLC-MS/MS per la determinazione di DON, Zearalenone, T2 e HT2 UPLC conditions Velocità di flusso: 0.4ml/min Colonna: ACQUITY UPC BEH C18 1.7um, 2.1X50mm Volume di iniezione: 20uL Fase Mobile: A: H 2 O + 0.2%CH 3 COOH + 10mM CH 3 COONH 4 B: MeOH + 0.2%CH 3 COOH + 10mM CH 3 COONH 4 Gradiente in 5 min da 90% A a 15%B Riequilibrio 2 min. Metodo in Multiple Reaction Monitoring (MRM) Coll Micotossina Parent Daughters Dwell Cone V E DON ESI HT2 ESI+ 442 T2 ESI+ 484 ZEA ESI ANALISI DESCRITTIVA DEI RISULTATI I risultati ottenuti dalle analisi effettuate in doppio sui campioni di mangime sono riportati di seguito: Distribuzione di contaminazione per micotossina Micotossina: Aflatossina B1 (AFB1) In Figura 1 è riportato l andamento della contaminazione da AFB1. Circa il 33% dei campioni ha una contaminazione inferiore al LOQ (0.04 μg/kg). La quasi totalità dei campioni analizzati risultano essere al di sotto dei due limiti più bassi per l AFB1 nei mangimi (5 e 10 μg/kg). Nessun campione è risultato non conforme per il limite per tutte le materie prime dei mangimi (20 μg/kg), per i mangimi complementari e completi per i suini (20 μg/kg), per i mangimi complementari e completi per i vitelli, agnelli e capretti (5 μg/kg), i mangimi completi per animali da latte (5 μg/kg), mangimi completi per vitelli e agnelli (10 μg/kg) e altri mangimi complementari (5 μg/kg).

5 Un campione è risultato essere non conforme relativamente al limite per altri mangimi completi (10 μg/kg). Fig.1 Distribuzione di contaminazione della micotossina AFB1 (μg/kg). In rosso il limite per altri mangimi complementari (10 μg/kg). Micotossina: Ocratossina A (OTA) In Figura 2 è riportato l andamento della contaminazione da OTA. Nessuno dei campioni analizzati risulta essere non conforme rispetto a tutti i limiti relativi alla contaminazione da OTA. Circa l 88% dei campioni ha una contaminazione inferiore a 2 μg/kg. Fig.2 Distribuzione di contaminazione della OTA (μg/kg).

6 Micotossina: Fumonisine B1+B2 (FBs) In Figura 3 è riportato l andamento della contaminazione da Fumonisine. Circa il 32% dei mangimi ha una contaminazione inferiore al LOQ (300 μg/kg). Sette campioni sono risultati essere non conformi al limite per suini, equini, conigli e animali da compagnia (5000 μg/kg). Nessun campione è risultato essere non conforme ai limiti relativi al granoturco (60000 μg/kg), al pollame, vitelli, agnelli, capretti (20000 μg/kg), ai ruminanti adulti e visoni (50000 μg/kg). Fig.3 Distribuzione di contaminazione della micotossina FBs (μg/kg). In rosso i limiti per i mangimi per i suini, gli equini, i conigli, gli animali da compagnia (5000 μg/kg).

7 Micotossina: Deossinivalenolo (DON) In Figura 4 è riportato l andamento della contaminazione da DON. Circa il 33% dei mangimi presenta una contaminazione inferiore al LOQ (50 μg/kg). Tre campioni non sono conformi per il limite dei mangimi completi e complementari per i suini (900 μg/kg), e 1 per i mangimi completi e complementari per vitelli, agnelli e capretti (2000 μg/kg). Fig. 4 Distribuzione di contaminazione della micotossina DON (μg/kg). In rosso i limiti per i mangimi complementari e completi per i suini (900 μg/kg) e per i bovini (2000 μg/kg).

8 Micotossina: Zearalenone (ZEA) In Figura 5 è riportato l andamento della contaminazione da ZEA. Circa il 35% dei mangimi presenta una contaminazione inferiore al LOQ (50 μg/kg). Un solo campione è risultato non conforme relativamente al limite per mangimi complementari e completi per suinetti e scrofette (100 μg/kg). Fig. 5 Distribuzione di contaminazione della micotossina ZEA (μg/kg). In rosso i limiti per i mangimi complementari e completi per i suini (100 e 250 μg/kg).

9 Micotossina: T2 Fig. 6 Distribuzione di contaminazione della micotossina T2 (μg/kg).

10 Circa il 90% dei campioni analizzati risulta essere inferiore al LOQ (10 μg/kg). Micotossina: HT2 Fig. 7 Distribuzione di contaminazione della micotossina HT2 (μg/kg).

11 Circa il 75% dei campioni analizzati risulta essere inferiore al LOQ (10 μg/kg). Analisi descrittiva Tab. 1 Limiti di legge (μg/kg)dir 2003/100/CE; Circolare 10/1999 ; Racc576/2006.

12 AFB1 OTA FBs DON ZEA T2 HT2 Tutte le materie prime per mangimi 20 Cereali e prodotti a base di cereali fatta eccezione per sottoprodotti del granoturco Sottoprodotti del granoturco Mangimi complementari e completi, ad eccezione di: 5000 mangimi complementari e completi per suini mangimi complementari e completi per vitelli (< 4 mesi), agnelli e capretti Mangimi complementari e completi per suinetti e scrofette (giovani scrofe) 100 Mangimi complementari e completi per scrofe e suini da ingrasso 250 Mangimi complementari e completi per pollame 100 suini, equini (Equidi), conigli e animali da compagnia 5000 pesci pollame, vitelli (< 4 mesi), agnelli e capretti ruminanti adulti (> 4 mesi) e visoni mangimi completi per animali da latte 5 Mangimi completi per vitelli e agnelli 10 Altri mangimi completi 10 Altri mangimi complementari 5 Tab. 2 Valori medi, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo delle contaminazioni nei campioni di mangime analizzati per micotossina. (μg/kg) Micotossina N campioni Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) AFB1 0.62± (0.7%) OTA 1.04± (0.0%) FBs ± (5.1%) DON ± (2.2%) ZEA 66.20± (0.8%) T2 5.68± * HT ± * *Non sono stati stabiliti dei limiti. In tabella 2 sono riportati i valori medi di contaminazione, la deviazione standard, il CV, i valori minimi e massimi per tutti i campioni analizzati per tutte le micotossine. I valori medi sono in tutti i casi ampiamente al di sotto di tutti i limiti di legge presi in considerazione in tabella 1. I valori massimi riportati in tabella risultano essere in alcuni casi (AFB1, FBs, DON, ZEA) superiori ad alcuni limiti in particolare relativamente ai mangimi complementari. La contaminazione massima di AFB1 (15.19 μg/kg = avicolo, completo) risulta non essere conforme per i limiti relativi ai mangimi complementari e completi per i bovini, per gli animali da latte, e per altri mangimi completi e complementari. L FBs ( μg/kg = avicolo, NI) massima non è conforme per i suini, gli equini, i conigli, gli animali da compagnia e i pesci. La contaminazione massima del DON ( μg/kg = NI, NI) non rispetta la regolamentazione relativa ai mangimi complementari e completi per

13 suini, vitelli (< 4 mesi), agnelli e capretti. Mentre il valore massimo registrato per lo ZEA ( μg/kg = bovino, complementare) non è conforme per i mangimi destinati ai suini. Le micotossine che registrano le percentuali più alte di campioni non conformi sono FBs (7 campioni non conformi, 5.1% dei campioni) e il DON (3 campioni non conformi, 2.2% dei campioni. Micotossina: AFB1 Tab. 3 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di AFB1 (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di destinazione Contaminazione di AFB1 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) bovino ± (0.0%) coniglio ± (0.0%) avicolo ± (6.3%) uccelli ± (0.0%) suino ± (0.0%) ovino ± (0.0%) equino ± (0.0%) NI ± (0.0%) Tab. 4 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di AFB1 (μg/kg) per matrice. razza di destinazione Contaminazione di AFB1 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) soia ± (0.00 %) mais ± (0.00 %) complementare ± (0.00 %) completo ± (3.45 %) composto ± (0.00 %) crusca ± (0.00 %) NI ± (0.00 %) In tabella 3 e 4 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di AFB1 (μg/kg), il numero e la percentuale di campioni non conformi per razza di destinazione e per matrice. Le contaminazione medie di AFB1 per animale di destinazione e matrice sono in tutti i casi al di sotto dei limiti di legge. Le contaminazione più alte in media riguardano i mangimi per avicoli e a base di mais. Il mangime per avicoli e il mangime completo registra anche il valore massimo più alto (15.19 μg/kg= avicolo, completo). Micotossina: OTA

14 Tab. 5 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di OTA (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di destinazione Contaminazione di OTA (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) bovino ± (0.00 %) coniglio ± (0.00 %) avicolo ± (0.00 %) suino ± (0.00 %) ovino ± (0.00 %) equino ± (0.00 %) uccelli ± (0.00 %) NI ± (0.00 %) Tab. 6 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di OTA (μg/kg) per matrice. razza di destinazione Contaminazione di AFB1 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) soia ± (0.00 %) mais ± (0.00 %) complementare ± (0.00 %) completo ± (0.00 %) composto ± (0.00 %) crusca ± (0.00 %) NI ± (0.00 %) In tabella 5 e 6 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di OTA (μg/kg), il numero e la percentuale di campioni non conformi per razza di destinazione e per matrice. Tutti i campioni analizzati risultano essere largamente conformi ai limiti di legge. Le sottocategorie con le contaminazioni medie più alte riguardano bovini, conigli, la crusca, il mangime complementare e quello completo. Micotossina: FBs

15 Tab. 7 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di FBs (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di destinazione Contaminazione di OTA (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) bovino ± (0.00 %) coniglio ± (20.0%) avicolo ± (0.00 %) suino ± (25.0 %) ovino ± (0.00 %) equino ± (0.00 %) uccelli ± (0.00 %) NI ± (4.5 %) Tab. 8 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di FBs (μg/kg) per matrice. razza di destinazione Contaminazione di FBs (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) soia ± (5.4%) mais ± (0.00 %) complementare ± (0.00 %) completo ± (13.3 %) composto ± (0.00 %) crusca ± (0.00 %) NI ± (4.5 %) Tab. 9 Livello di contaminazione da FBs (μg/kg) per animale di destinazione e matrice dei campioni non conformi. Codice identificativo Contaminazione FBs (μg/kg) Animale Matrice A suino completo coniglio completo NI soia suino completo NI soia suino completo NI NI In tabella 7 e 8 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di FBs (μg/kg), il numero e la percentuale di campioni non conformi per razza di destinazione e per matrice. In tabella 9 sono riportate le caratteristiche dei 7 campioni non conformi secondo i limiti per suini, equini, conigli e animali da compagnia (5000 μg/kg). Dai risultati ottenuti si evidenzia come i mangimi destinati ai suini presentino i livelli più alti, contrariamente a quanto ci si sarebbe potuto attendere per specie particolarmente sensibili.

16 I valori medi di contaminazione per le FBs risultano essere in tutti i casi conformi mentre i valori massimi sono superiori ai valori limite consentiti per i mangimi destinati ai conigli (20%), i suini (25.0%), i mangimi di soia (5.4%) e completo (13.3%) (limite per i suini, equini (Equidi), conigli e animali da compagnia 5000 μg/kg). Micotossina: DON Tab. 10 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di DON (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di destinazione Contaminazione di DON (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) bovino ± (0.00 %) coniglio ± (0.00 %) avicolo ± (0.00 %) suino ± (0.00 %) ovino ± (0.00 %) equino ± (0.00 %) uccelli ± (0.00 %) NI ± (4.5 %) Tab. 11 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di DON (μg/kg) per matrice. razza di destinazione Contaminazione di DON (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) soia ± (0.00 %) mais ± (0.00 %) complementare ± (0.00 %) completo ± (0.00 %) composto ± (0.00 %) crusca ± (0.00 %) NI ± (13.6 %) In tabella 10 e 11 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di DON (μg/kg), il numero e la percentuale di campioni non conformi per razza di destinazione e per matrice. I valori massimi di contaminazione di DON per il mangime complementare e completo risultano essere superiore al limite per i mangimi complementari e completi per suini (900 μg/kg). Micotossina: ZEA Tab. 12 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione

17 di ZEA (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di destinazione Contaminazione di ZEA (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) bovino ± (0.00 %) coniglio ± (0.00 %) avicolo ± (0.00 %) suino ± (8.3 %) ovino ± (0.00 %) equino ± (0.00 %) uccelli ± (0.00 %) NI ± (0.00 %) Tab. 13 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di ZEA (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di destinazione Contaminazione di ZEA (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX Numero campioni non conformi (%) soia ± (0.00 %) mais ± (0.00 %) complementare ± (0.00 %) completo ± (3.3 %) composto ± (0.00 %) crusca ± (0.00 %) NI ± (0.00 %) In tabella 12 e 13 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione, numero e percentuale di campioni non conformi di ZEA (μg/kg) per razza di destinazione e per matrice. Il valore medio e i valori massimi registrati per i mangimi completi (248 μg/kg) non sono conformi al limite per mangimi completi e complementari per suini (100 μg/kg e 250 μg/kg). Micotossina: T2

18 Tab. 14 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di T2 (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. razza di Contaminazione di T2 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX destinazione bovino ± coniglio ± avicolo ± suino ± ovino ± equino ± uccelli ± NI ± Tab. 15 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di T2 (μg/kg) per matrice. Matrice Contaminazione di T2 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX soia ± mais ± complementare ± completo ± composto ± crusca ± NI ± In tabella 14 e 15 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di T2 (μg/kg) per razza di destinazione e per matrice. Le sottocategorie che risultano essere maggiormente contaminate sono i mangimi per bovini, i mangimi a base di mais, i complementari, anche se a livelli di gran lunga al di sotto di quelli che sono attualmente in discussione presso la Commissione Europea. Micotossina: HT2

19 Tab. 16 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di HT2 (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. Razza di Contaminazione di HT2 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX destinazione bovino ± coniglio ± avicolo ± suino ± ovino ± equino ± uccelli ± NI ± Tab. 17 Valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di HT2 (μg/kg) per razza di destinazione del mangime. Matrice Contaminazione di HT2 (μg/kg) N Media±DS CV MIN MAX soia ± mais ± complementare ± completo ± composto ± crusca ± NI ± In tabella 16 e 17 sono riportati il valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo di contaminazione di T2 (μg/kg) per razza di destinazione e per matrice. I valori più alti di contaminazione riguardano i mangimi per bovini, ovini, equini, conigli, i mangimi complementari, composti e la crusca, anche se a livelli di gran lunga al di sotto di quelli che sono attualmente in discussione presso la Commissione Europea Correlazione lineare In tabella 18 sono riportati i coefficienti di correlazione per ciascuna coppia di contaminazione di micotossine. Lo scopo è quello di verificare se ci siano eventuali associazioni tra le contaminazioni. Tutte le associazioni risultate significative sono positive ad indicare una associazione tra le contaminazioni nello stesso senso (all aumentare di una micotossina aumenta anche l altra e viceversa). Le coppie di micotossine risultate associate significativamente sono: OTA-DON, OTA-T2, OTA- HT2, DON-ZEA, DON-T2, DON-HT2, T2-HT2. Tra queste le coppie di contaminazione i cui

20 coefficienti di correlazione sono più alti e che quindi hanno una relazione più forte sono DON-HT2 ( ) e T2-HT2 ( ). Tab. 18 Coefficienti di correlazione fra le contaminazioni. Coefficienti di correlazione di Pearson Prob > r con H0: Rho=0 Numero di osservazioni AfB1 OTA FBs DON ZEA T2 HT2 AfB OTA FBs DON < ZEA T < HT < < Compresenze di due o più micotossine In tabella 19 e in figura 8 sono riportate le percentuali di campioni che registrano la compresenza di due o più micotossine mentre in tabella 20 e in figura 9 sono riportate le percentuali di campioni che registrano la compresenza di almeno due micotossine. Fig. 8 Percentuale di campioni positivi alla presenza di micotossine.

21 Tab. 19 Percentuale di campioni in cui c è compresenza di contaminazione di più micotossine Compresenze Percentuale AFB1 OTA 62,2 AFB1 OTA FBs 50,4 AFB1 OTA FBs ZEA 33,6 AFB1 OTA FBs ZEA DON 32,8 AFB1 OTA FBs ZEA DON HT2 14,3 AFB1 OTA FBs ZEA DON HT2 T2 1,7 Fig.9 Percentuale di campioni in cui si verifica la presenza di almeno due micotossine.

22 Tab. 20 Percentuale di campioni in cui c è la contaminazione di almeno due micotossine. In parentesi sono riportate le contaminazioni medie dei campioni per micotossina. Compresenze doppie Percentuale AFB1 (0.62 μg/kg) -FBs ( μg/kg) 70,6 OTA (0.84 μg/kg) -FBs ( μg/kg) 69,7 AFB1 (0.62 μg/kg) - DON ( μg/kg) 64,7 FBs ( μg/kg) - DON ( μg/kg) 63,9 AFB1 (0.62 μg/kg)- OTA (0.84 μg/kg) 62,2 AFB1 (0.62 μg/kg)- ZEA (64.19 μg/kg) 60,5 DON ( μg/kg) -ZEA (64.19 μg/kg) 59,7 OTA (0.84 μg/kg) -ZEA (64.19 μg/kg) 58,0 OTA (0.84 μg/kg)- DON ( μg/kg) 52,9 FBs ( μg/kg)- ZEA (64.19 μg/kg) 52,1 DON ( μg/kg) - HT2 (10.95 μg/kg) 38,7 AFB1 (0.62 μg/kg) - HT2 (10.95 μg/kg) 37,0 ZEA (64.19 μg/kg) - HT2 (10.95 μg/kg) 37,0 OTA (0.84 μg/kg) - HT2 (10.95 μg/kg) 35,3 FBs ( μg/kg) - HT2 (10.95 μg/kg) 34,5 DON ( μg/kg) - T2 (5.85 μg/kg) 14,3 T2 (5.85 μg/kg) - HT2 (10.95 μg/kg) 11,8 ZEA (64.19 μg/kg) - T2 (5.85 μg/kg) 11,8 OTA (0.84 μg/kg) - T2 (5.85 μg/kg) 10,9 FBs ( μg/kg) - T2 (5.85 μg/kg) 10,1 AFB1 (0.62 μg/kg) - T2 (5.85 μg/kg) 9,2 Le coppie di micotossine che si presentano in misura maggiore sono risultate essere: AFB1-OTA (62.2%), AFB1-FBs (70.6%), AFB1-DON (64.7%), AFB1-ZEA (60.5%), OTA-FBs (69.7%),

23 Percentuale OTA-DON (52.9%), OTA-ZEA (58.0%), FBs-DON (63.9%), FBs-ZEA (52.1%), DON-ZEA (59.7%). L associazione doppia delle micotossine AFB1, OTA, FBs, DON, ZEA si presenta in quasi tutti i casi intorno al 60%, con una punta del 70.6% per l AFB1 e FBs. In tabella 21 e in figura 10 sono riportate le percentuali di campioni che registrano la compresenza di almeno tre micotossine Fig.10 Percentuale di campioni in cui si verifica la presenza di almeno tre micotossine. Compresenze triple di micotossine 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 AFB1 OTA FBs AFB1 OTA DON AFB1 OTA ZEA AFB1 OTA T2 AFB1 OTA HT2 OTA FBs DON OTA FBs ZEA OTA FBs T2 OTA FBs HT2 FBs DON ZEA FBs DON T2 FBs DON HT2 DON ZEA T2 DON ZEA HT2 Tab. 21 Percentuale di campioni in cui è presente una contaminazione di almeno tre micotossine. In parentesi sono riportate le contaminazioni medie dei campioni per micotossina. Compresenze di micotossine Percentuale AFB1 (0.62 μg/kg) OTA (0.84 μg/kg) FBs ( μg/kg) 53,8 OTA (0.84 μg/kg) FBs ( μg/kg) DON ( μg/kg) 52,1 AFB1 (0.62 μg/kg) OTA (0.84 μg/kg) DON ( μg/kg) 50,4 FBs ( μg/kg) DON ( μg/kg) ZEA (64.19 μg/kg) 47,9 AFB1 (0.62 μg/kg) OTA (0.84 μg/kg) ZEA (64.19 μg/kg) 44,5 OTA (0.84 μg/kg) FBs ( μg/kg) ZEA (64.19 μg/kg) 43,7 DON ( μg/kg) ZEA (64.19 μg/kg) HT2 (10.95 μg/kg) 30,3 OTA (0.84 μg/kg) FBs ( μg/kg) HT2 (10.95 μg/kg) 27,7 FBs ( μg/kg) DON ( μg/kg) HT2 (10.95 μg/kg) 27,7 AFB1 (0.62 μg/kg) OTA (0.84 μg/kg) HT2 (10.95 μg/kg) 26,1 DON ( μg/kg) ZEA (64.19 μg/kg) T2 (5.82 μg/kg) 10,9 FBs ( μg/kg) DON ( μg/kg) T2 (5.82 μg/kg) 7,6 AFB1 (0.62 μg/kg) OTA (0.84 μg/kg) T2 (5.82 μg/kg) 6,7 OTA (0.84 μg/kg) FBs ( μg/kg) T2(5.82 μg/kg) 5,0

24 Le micotossine che più frequentemente si presentano contemporaneamente sono AFB1-OTA-FBs (53.8%), AFB1-OTA-DON (50.4%), AFB1-OTA-ZEA (44.5%), OTA-FBs-DON (52.1%), OTA- FBs-ZEA (43.7%), FBs-DON-ZEA (47.9%). L associazione tripla delle micotossine AFB1, OTA, FBs, DON, ZEA è in tutti i casi intorno al 50%. Conclusioni In conclusione, si può affermare che la qualità igienico sanitaria della quasi totalità dei campioni oggetto della ricerca è risultata di ottimo livello. I mangimi le cui contaminazioni superano i limiti consentiti per le FBs e lo ZEA sono mangimi di coniglio (1 campione non conforme per le FBs), suino (3 campioni non conformi per le FBs ed 1 campione non conforme per lo ZEA), soia (2 campioni non conformi per le FBs), completo (4 campioni non conformi per le FBs ed 1 campione non conforme per lo ZEA). Per quanto concerne la co-presenza di più micotossine, si è osservata una frequenza significativa di tutte le micotossine tranne che per le tossine T2 in particolar modo e HT2 per le quali la copresenza non è risultata particolarmente rilevante. Quest ultimo aspetto può essere giustificato dai livelli estremamente bassi di contaminazione delle due tossine con particolare riguardo alla tossina T2. Il Responsabile Scientifico Dr. Carlo Brera