SPETTROMETRIA DI MASSA

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1 SPETTROMETRIA DI MASSA La spettrometria di massa è una tecnica analitica potente usata per identificare prodotti incogniti, per determinazioni quantitative di composti noti e per r chiarire le proprietà strutturali e chimiche delle molecole. La spettrometria di massa viene usata per: Rivelare e identificare l'uso di steroidi da parte di atleti. Controllare in tempo reale la respirazione di pazienti da parte degli anestesisti durante interventi chirurgici. Determinare la composizione di specie molecolari rilevate nello spazio. Determinare se il miele è stato adulterato con l'uso di sciroppi zuccherini. Localizzare depositi di petrolio misurando precursori nelle rocce. Controllare in continuo le fermentazioni per l'industria biotecnologica. Determinare la presenza di diossine in pesce contaminato. Determinare il danno genetico dovuto a cause ambientali. Stabilire la composizione elementare di materiali semiconduttori. Identificare la struttura di biomolecole,, come carboidrati, acidi nucleici e steroidi. Stabilire la sequenza di biopolimeri come proteine e oligosaccaridi. idi. Determinare "come" i farmaci vengono utilizzati dall'organismo. Effettuare analisi in medicina legale, come la conferma e la misura quantitativa di droghe e del loro abuso. Effettuare analisi di sostanze inquinanti per l'ambiente. Stabilire l'età e l'origine di campioni geochimici e archeologici. Identificare e determinare quantitativamente i componenti di miscele organiche complesse. Effettuare analisi inorganiche multielementari con elevatissima sensibilità.

2 SPETTROMETRIA DI MASSA Uno spettrometro di massa è uno strumento utilizzato per misurare la massa di una molecola dopo che essa è stata ionizzata, ossia alla quale è stata impartita una carica c elettrica. Uno spettrometro di massa in realtà non misura direttamente la massa molecolare, ma il rapporto massa/carica degli ioni che si formano dalla molecola in esame. Il rapporto massa/carica è espresso in termini di Da per unità elementare di carica. La maggior parte degli ioni che si possono riscontrare in i spettrometria di massa possiede solo una carica (z = 1) così che il loro valore di m/z coincide numericamente ente con la massa molecolare (o meglio, ionica) in Da. Lo spettrometro di massa varia come dimensioni da una piccola scatola, grande approssimativamente come un forno a microonde domestico, fino a grandi strumenti di ricerca che occupano un intero laboratorio. Le differenti parti di uno spettrometro di massa sono: 1.Sorgente (dove vengono generati gli ioni). 2.Analizzatore (dove si selezionano i vari ioni) 3.Rivelatore (dove si registrano gli ioni prodotti) 4.Sistema da vuoto. Massa Nominale e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento. Massa Esatta e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C

3 1. Sorgente : è la parte dello strumento dove avviene la ionizzazione del campione in esame. Esistono diverse tecniche per ionizzare un campione: -Tecniche Hard Impatto Elettronico (EI) -Tecniche Soft Ionizzazione Chimica Bombardamento con atomi veloci (FAB) Desorbimento con laser (MALDI) Electrospray (ESI) 2. Analizzatore : è la parte dello strumento dove avviene la separazione degli ioni in base al loro rapporto m/z Esistono diversi sistemi per analizzare gli ioni che si differenziano in base alla loro risoluzione. 1) Analizzatori a deflessione magnetica. 2) Analizzatori a quadrupolo 3) Analizzatori a trappola ionica 4) Analizzatori a tempo di volo (TOF) 5) Analizzatori a risonanza ciclotronica ionica (FT ICR)

4 Impatto Elettronico (EI) M: + e - 2e - + M+ Storicamente è la prima tecnica sviluppata è una tecnica di ionizzazione hard che, proprio per l alta energia in gioco, oltre a ionizzare una molecola, generalmente ne provoca anche la frammentazione. Nella camera di ionizzazione ( mmhg) ) le molecole del campione da analizzare, in fase gassosa, interagiscono con un fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (Renio o Tungsteno) ed accelerato attraverso un potenziale regolabile dall operatore. L energia del fascio è normalmente fissata a 70 ev (potenziale di ionizzazione delle molecole ev). La reazione che avviene è la seguente: M: + e - 2e - + M+ Il risultato è la formazione di una specie radical-cationica cationica (IONE MOLECOLARE) ) dotata di alta energia che tende a frammentarsi se il tempo di vita è < 10-5 s.

5 Ionizzazione Chimica CI La ionizzazione chimica utilizza una sorgente ad impatto elettronico, ma determina una piccola frammentazione del campione, dando luogo a spettri più p chiari. E particolarmente vantaggiosa nella determinazione delle masse molecolari. Nella camera di ionizzazione è presente una elevata quantità di gas reagente (es. metano) che viene bombardato con elettroni veloci ( ev) determinando le seguenti ionizzazioni: CH 4 + e - 2e - + CH 4+ CH 4 + CH 4+ CH 3 + CH + 5 CH 4+ CH 3+ + H CH 3+ + CH 4 C 2 H 5+ + H 2 Le interazioni di questi super acidi con il campione in esame determina generalmente la formazione di ioni molecolari stabili secondo le seguenti reazioni: M + CH 5+ MH + + CH 4 M + 1 M + C 2 H 5+ [M + C 2 H 5 ] + M + 29 M + C 3 H 5+ [M + C 3 H 5 ] + M + 41 M + C 2 H 5+ [M H] + + C 2 H 6 M 1 (nel caso di idrocarburi)

6 Bombardamento con atomi veloci (FAB) La tecnica FAB risolve il problema delle sostanze funzionalizzate ad alto peso molecolare, molto polari e poco volatili per cui risulta molto utile per l analisi di campioni biologici.il campione è miscelato ad una matrice viscosa (Glicerolo( Glicerolo, Tioglicerolo, Nitrobenzil alcol, dietilammina). La miscela (analita( analita-matrice) ) posta su una sonda opportuna, viene introdotta nella camera della sorgente, dove viene fatto il vuoto e dove viene bombardata con una pistola che spara atomi neutri che si muovono ad alta velocità (atomi pesanti come xenon e ioni cesio). L impatto degli atomi contro la miscela crea un fenomeno di superficie cioè gli atomi impattano sulle superfici e proiettano via molecole di miscela. il processo di ionizzazione, si verifica un elevato innalzamento della temperatura, per un breve periodo, troppo breve per causare la rottura dei legami chimici ma sufficientemente alto da permettere la ionizzazione zione dei composti da analizzare. Desorbimento con laser (MALDI) nella MALDI è l irradiazione con laser che permette ad un numero più ristretto di molecole posta sulla superficie delle matrici di essere proiettata ad alte velocità nell analizzatore.

7 Electrospray (ESI) Si tratta di una sorgente di ionizzazione che utilizza un gas inerte (di solito azoto) per provocare un processo di nebulizzazione. Le due caratteristiche essenziali dell ES sono: - la ionizzazione si verifica a pressione atmosferica - sulla specie molecolare si può depositare una carica multipla Questo processo avviene in soluzioni (metanolo e acqua), che vengono poi nebulizzate in una camera a cui è applicato un campo elettrico (ottenuto applicando una differenza di potenziale di 3.6 KV). La nebulizzazione comporta la formazione di piccole goccioline di solvente che contengono delle specie ionizzate (analita( carico). La ionizzazione di solito è spontanea, ma può essere indotta con l aggiunta di reagenti adatti. Nella sorgente il gas entra a bassa velocità per facilitare l evaporazione del solvente, questo permette di trattare anche composti termicamente labili. Man mano che il solvente contenuto nelle goccioline evapora, queste si rimpiccioliscono fino a che la repulsione elettrica, aumentata a causa della forte densità elettrica, supera la tensione superficiale della goccia; a questo punto la gocciolina scoppia, creando una corrente di ioni nudi che vengono poi indirizzati da un gradiente di campo verso l analizzatore. lizzatore.

8 Electrospray (ESI) Una caratteristica peculiare di questa tecnica di ionizzazione è di essere capace di provocare la formazione di specie multicarica.. La diretta conseguenza è la possibilità di analizzare molecole ad elevato peso p molecolare come le proteine sulla base dei valori m/z. Spettro ESI della mioglobina da cuore di cavallo (PM: ) Deconvoluzione dello spettro ESI multicarica della mioglobina.

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10 2. Analizzatore (strumento a doppia focalizzazione ) All'uscita della camera di ionizzazione il raggio di ioni e' accelerato attraverso un potenziale V di Volt. Le equazioni che governano il moto degli ioni nel campo elettrostatico tatico B e nel campo magnetico H sono: E c = F c = 1 2 mv2 = zv mv 2 r = Hzv m z = H 2 r 2 2V Per un dato valore di campo magnetico H e di potenziale di accelerazione V a ciascun valore del rapporto massa/carica m/z corrisponde un raggio di curvatura r.. strumento a doppia focalizzazione (E-B) Il raggio di curvatura del fascio di ioni r e' un parametro strumentale che dipende dal potenziale di accelerazione V e dal campo elettrostatico B. Il settore elettrostatico non separa tra di loro gli ioni generati nella camera di ionizzazione in funzione del rapporto massa:carica; si limita ad uniformare le energie translazionali degli ioni, compensando differenze di velocità iniziale. Nel successivo settore magnetico, ioni caratterizzati da ugual rapporto m/z ma differente energia translazionale seguirebbero traiettorie diverse, diminuendo la risoluzione dello strumento. La separazione degli ioni secondo il loro rapporto massa:carica avviene nel settore magnetico dello strumento.

11 2. Analizzatore (Rilevatore Quadrupolare) L analizzatore quadrupolare è schematicamente costituito da quattro barre di metallo (v. figura sotto). Alle barre opposte del quadrupolo è applicata una differenza di potenziale, generata da una corrente continua ed alternata. Gli ioni, a causa a di tale differenza, subiranno nel loro transito delle oscillazioni, che potranno essere stabili, i, permettendo così allo ione di uscire dal quadrupolo,, o instabili e porteranno alla collisione dello ione con le barre re del quadrupolo.. A determinati valori della tensione applicata, solo ioni aventi i un certo rapporto m/z usciranno dal quadrupolo stesso. Variando nel tempo la tensione applicata, tutti gli ioni saranno messi in condizione di uscire (a tempi diversi) dal quadrupolo.. La risoluzione di questi analizzatori generalmente è nell ordine di ). 5

12 Analizzatore (trappola ionica) È un analizzatore simile a quello quadrupolare, ma in esso il filtro quadrupolare è sferico e trattiene tutti gli ioni generati, i quali poi vengono rilasciati progressivamente verso il rivelatore, variando il campo elettrico. Il potere risolutivo di tali analizzatori è tra 10 3 e Gli ioni generati in una sorgente, vengono intrappolati in una cella cubica in cui per opera di un campo magnetico elevatissimo (criomagneti( criomagneti: 4-12 Tesla) ) unitamente ad un campo elettrico, assumono un orbita elicoidale con frequenza dipendente dal rapporto m/z. Questo analizzatore è in questo momento al top della tecnologia, ha alta sensibilità, accuratezza e potere risolutivo elevatissimo ( ).

13 Analizzatore TOF (tempo di volo) Il principio su cui si basa questo analizzatore è che ioni di differente valore m/z hanno uguale energia cinetica (1/2 mv 2 ), ma differente velocità dopo l accelerazione subita nella camera di ionizzazione. Ne deriva che il tempo che ciascuno impiega ad attraversare l analizzatore è differente: t = a(m/z)1/2 + b. In pratica, gli ioni provenienti dalla sorgente, vengono accelerati da un forte campo elettrico, e percorrono l analizzatore, che ha la forma di un tubo in cui è fatto un alto vuoto, in base alla velocità dovuta alla loro energia cinetica. Così gli ioni che hanno il rapporto m/z minore arriveranno al rivelatore prima di quelli più pesanti. Questo analizzatore, a differenza degli altri, riesce a coprire un ampia a regione spettrale ed ha un alta sensibilità. Il potere risolutivo, che fino a pochi anni fa rappresentava resentava il punto debole di questi analizzatori, può raggiungere anche valori nell ordine di 10 4 (reflectron TOF). Il TOF invece di operare una deflessione magnetica, opera un accelerazione lineare che può essere monitorata e studiata. Il TOF è spesso associato alla MALDI

14 3. Rivelatore (dove si registrano gli ioni prodotti) La maggioranza dei rivelatori funzionano ad impatto ionico o per cattura ionica. Tutti i tipi richiedono una superficie che raccolga gli ioni e dove d la carica venga neutralizzata sia per la raccolta sia per donazione di elettroni.. Si realizza quindi un trasferimento di elettroni ed un flusso di corrente che può essere e amplificato ed infine convertito in un segnale registrabile. La sensibilità può essere così elevata da permettere di rilevare un singolo ione.

15 Risoluzione Il potere risolutivo dello strumento determina la capacita' di separare tra di loro ioni di uguale massa nominale ma diversa massa esatta. Nell'esame delle caratteristiche di uno strumento e' necessario stabilire cosa si intenda per "separare". Nella figura, gli ioni sono in entrambi i casi separati, ma ovviamente la risoluzione e' maggiore nel caso A. I dati di potere risolutivo sono per convenzione misurati su coppie di segnali separati tra di loro da una valle (h) alta il 10% dell'altezza (H). Potere Risolutivo = M1/(M2 M1) Per separare tra di loro gli ioni CO ed N 2 e' necessaria una risoluzione di /( /( ) ) = 2493 Per separare tra di loro gli ioni C 11 H 10 N e C 12 H 12 e' necessaria una risoluzione di /( /( ) ) = Il livello di informazione che possiamo ottenere da uno spettrometro di massa dipende dal suo potere risolutivo. Strumenti a bassa risoluzione (es. a quadrupolo) ) forniscono solo la massa nominale degli ioni. Strumenti ad alta risoluzione (es. FT ICR, doppia focalizzazione) ) forniscono la massa esatta degli ioni, che in genere definisce univocamente la composizione elementare degli ioni i corrispondenti. Ad esempio: In uno strumento a bassa risoluzione CO, C 2 H 4 ed N 2 forniscono un unico segnale a massa nominale 28; in uno strumento ad alta risoluzione si possono osservare invece tre ioni separati di massa esatta: CO N 2 C 2 H

16 Analisi di uno spettro di massa (Tecnica EI) In uno spettro di massa è possibile riconoscere: -Ioni molecolari -Ioni isotopici danno il peso molecolare della sostanza in esame permettono di risalire alla formula molecolare -Ioni di frammentazione danno informazioni strutturali -Ioni di riarrangiamento danno informazioni strutturali -Ioni metastabili (m* = m 22 / m 1 ) danno informazioni strutturali -Ioni di interazione ione molecola danno informazioni strutturali -Ioni multicarica consentono lo studio di macromolecole -Ioni negativi utilizzati solo in casi particolari (es( LC-MS, ESI)

17 Analisi di uno spettro di massa In uno spettro di massa, l asse delle X riporta valori di rapporto m/z e l asse delle Y valori di abbondanza relativa degli ioni analizzati. Dallo spettro di massa a si può risalire alla struttura di un composto incognito, attribuendo ai singoli ioni una composizione one elementare e ricostruendo i meccanismi di frammentazione seguendo schemi tipici per le varie classi di composti. Ione Molecolare M+ è di solito il Picco base,, è il picco più intenso nello picco più a destra dello spettro e spettro con massima abbondanza relativa. fornisce il PM, non sempre è visibile. Non è detto che sia lo ione molecolare. La sua intensità è legata alla stabilità. Cl Ioni Isotopici M e M sono dovuti al fatto che in natura gli elementi presentano più isotopi. Sono utili per stabilire la formula molecolare. C 6 H 5 Cl Mol. Wt.: 112,56 m/z: (100.0%), (32.2%), (6.7%), (2.2%) 6,7/1,1 = nc = % M+1 = 100 [P+1] [P] % M+2 = 100 [P+2] [P] 1,1 x nc + 0,36 x nn [1,1 x nc]2 + 0,20 x no 200 Dal valore di M+1 e M+2 è possibile risalire alla formula molecolare. Tramite le tabelle di Beynon è possibile stabilire in base al PM e alla composizione isotopica, la formula molecolare.

18 tabelle di Beynon

19 Analisi di uno spettro di massa: Ioni Isotopici Poiché la massa è in grado di rilevare ioni n base al rapporto m/z, m sarà possibile distinguere ioni di diversi isotopi. Gli ioni isotopici sono dovuti alla presenza in natura di vari isotopi per i vari atomi. Ad es. il carbonio presenta 2 isotopi ( 12 C, % e 13 C %), quindi in tutti i composti organici saranno presenti ioni dovuti a molecole contenenti enti 13 C, l intensità di questi ioni sarà funzione del numero di atomi di carbonio della molecola. (vedi esempio clorobenzene). Nel caso degli alogeni Cloro e Bromo si hanno spettri con caratteristiche atteristiche peculiari derivanti dalla particolare abbondanza riscontrata negli isotopi di questi elementi. Cloro Bromo Bromoetano C 2 H 5 Br Cloroetano C 2 H 5 Cl

20 Massa esatta e abbondanza naturale degli isotopi di alcuni elementi Elemento Massa nominale Abbondanza naturale Massa esatta Peso atomico Elemento Massa nominale Abbondanza naturale Massa esatta Peso atomico Idrogeno Carbonio Azoto Cloro Bromo Iodio Ossigeno Fluoro Silicio Stagno Fosforo Zolfo

21 Analisi di uno spettro di massa: Ioni Isotopici Br 6 Br 5 Cl 6 Cl 5 Br 4 Br 3 Cl 4 Cl 3 Br 2 Br Cl 2 Cl

22 Interpretazione di uno spettro di massa: Frammentazione Nell interpretazione di uno spettro si segue una procedura abbastanza semplice: 1. Identificazione dello ione molecolare. 2. identificazione di ioni caratteristici. 3. identificazione di processi di frammentazione caratteristici. 4. Ricostruzione della struttura della molecola sulla base della conoscenza di meccanismi di frammentazione standard. NB. Nell esame di spettri di molecole organiche non sono in genere osservate frammentazioni con perdite di 14 uma dallo ione molecolare, si riscontrano perdite di idrogeno (M 1 1 e M 2). M Non dovrebbero essere presenti M 3 M M 14 oppure M 21 M M 25. In presenza di Fluoro si possono osservare M-19, M M-20 M (F - e HF). L intensità dello ione molecolare dipenderà dalla sua stabilità (t vita > 10-5 sec.) In generale l ordine di stabilità degli ioni sarà correlato alla capacità di stabilizzare la carica positiva. Saranno più stabili molecole con n sistemi π Aromatici > olefine con. > solfuri ciclici > alcani lineari > tioli > chetoni > ammine > esteri > eteri > alcani ramif.. > alcol

23 Interpretazione di uno spettro di massa: Frammentazione Lo ione molecolare è una specie estremamente ricca di energia e, specialmente nel caso di molecole complesse, le sue sorti possono essere molto diverse. Lo ione molecolare può decomporsi in un ampia varietà di modi ed i frammenti prodotti possono subire un ulteriore processo di scissione. Le principali frammentazioni delle molecole organiche sono: Frammentazioni semplici (reazioni di frammentazione con rottura di un legame semplice tra a due atomi). Quando queste scissioni interessano il catione radicalico producono sempre un catione ed un radicale libero. -Scissione α (attivata e non) -Scissione benzilica -Scissione allilica Riarrangiamenti (reazioni di frammentazione con rottura di due legami covalenti).. Quando si verificano a carico di uno ione radicale i prodotti sono un altro o catione radicale ed una molecola neutra.

24 Interpretazione di uno spettro di massa: Frammentazione Principali modalità di frammentazione e regola dell azoto I Pe = ione con un numero pari di e m/z dispari (con nessuno o numero pari di atomi di Azoto) I De = ione con un numero dispari di e m/z pari (con nessuno o numero pari di atomi di Azoto) I De M+ M + 1 I Pe M + 2 I De + R R Radicale a n. dispari di e - M I + Pe De + M Neutra Molecola a n. pari di e - M 4 + I De M + 3 I Pe + R R Radicale a n. dispari di e - + M Neutra Molecola a n. pari di e - Principali vie di frammentazione di un radical catione M+ e di un catione M +

25 Principali modalità di frammentazione e regola dell azoto I De I Pe I Pe I De I Pe

26 -Scissioni in α attivate, avvengono in α ad eteroatomi e a gruppi funzionali. M +. = R Cl R O R 1 R NR 2 R C=O R C=O R + R 1 C O R 1 R C Cl R 1 R C + Cl X Cα α β Cβ Cγ γ Cδ - Scissione benzilica, negli alchilbenzeni si verifica la perdita di un atomo di idrogeno o di un radicale alchilico con formazione dello ione tropilio (ione estremamente stabile). Questa frammentazione si traduce in un picco molto intenso a m/z 91. R. - C 4 H 9 - Scissione allilica, frequentemente la frammentazione degli alcheni m/z = 57 produce carbocationi allilici.. m/z = 41 m/z = 91 R m/z = 90 + R - Scissioni in α non attivate, frammentazioni che avvengono in composti che non hanno eteroatomi e non hanno particolari insaturazioni (idrocarburi alifatici). M -15; M -29; M -43, etc.

27 Riarrangiamenti: Si osservano in seguito a rottura di due legami -Cicloreversione di Diels Alder -Mc Lafferty La carica rimane preferenzialmente sul diene; puo rimanere anche sull' etilene in presenza di sostituenti Si verifica in presenza del sistema π tra A e B, dell'atomo di idrogeno legato ad E e di sei atomi coinvolti in uno stato di transizione ciclico. Eliminazione di una molecola neutra RXH tra gruppi adiacenti su di un doppio legame cis o sistema aromatico Si osservano in seguito a rottura di due legami; viene eliminata una molecola neutra a numero pari di elettroni formando un nuovo radical-catione catione.

28 Frammentazioni secondarie Eliminazione di una molecola neutra HX dopo trasferimento di idrogeno. A volte la reazione puo' fermarsi al primo stadio, se la forma protonata RXH + e' stabile. Attenzione: non e' una beta - eliminazione come in chimica organica classica, ma una gamma - oppure delta - eliminazione che passa attraverso uno stato di transizione ciclico a 5 o 6 atomi. Frammentazione secondaria con shift di idrogeno, successiva ad una scissione α. Con X= OH, SH, NH 2 spiega in derivati secondari ioni a massa rispettivamente 31, 47 e 30 che, sulla sola base della scissione α. dovrebbero essere presente solo in derivati primari Frammentazione secondaria tipica di eteri, tioeteri,, ammine secondarie e terziarie. Spiega ad esempio lo ione molto intenso a massa 31 (CH 2 OH + ) nello spettro dell'etere etilico.

29 Sostituenti insaturi (C=X( C=X, Ar) Anche la presenza di sostituenti "insaturi" in una catena alifatica ica porta nello ione molecolare ad una localizzazione preferenziale della carica, con una conseguente semplificazione s dello spettro di massa. Per "sostituente insaturo" si intende genericamente una unita' strutturale contenente elettroni π: : legami multipli, sistemi aromatici. I meccanismi di frammentazione osservati possono essere cosi' schematizzati: Scissione α attivata Frammentazioni di composti organici Questa frammentazione e' tipica dei composti carbonilici (chetoni, aldeidi, acidi carbossilici, esteri, amidi...) e di altri composti con eteroatomi in simile situazione: derivati imminici (C=N-), solfoni, solfonati e solfonamidi (ma non solfossidi), ecc. E' particolarmente utile in quanto permette di ottenere informazioni circa la posizione del gruppo insaturo in una catena. La frammentazione di tipo C in derivati carbonilici e' seguita di regola dalla perdita di ossido di carbonio (28 unita' di massa). Riarrangiamento di Mc Lafferty E' un meccanismo di frammentazione molto comune. Caratteristica di questo tipo di frammentazione e' la perdita di un sistema a numero pari di elettroni: partendo da un radicale catione si giunge ad un altro radicale catione. Scissione benzilica Tipica di alchilareni.. La frammentazione del legame beta all'anello aromatico innesca un processo di riarrangiamento che porta ad un catione tropilio particolarmente stabile.